武夷山自然保護(hù)區(qū)大型真菌土壤粘細(xì)菌多樣性及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究.pdf

1、微生物是活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源。本論文研究以武夷山自然保護(hù)區(qū)大型真菌和土壤粘細(xì)菌為對(duì)象,分兩篇分別探討武夷山自然保護(hù)區(qū)大型真菌的生物多樣性和分離1株大型真菌發(fā)酵產(chǎn)物的13個(gè)新二萜化學(xué)成分;通過(guò)LC-HRMS分析、化合物數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、基因組分析和PCR篩選等多種手段,探索粘球菌的化學(xué)分類及其新次級(jí)代謝產(chǎn)物的定向分離,發(fā)掘產(chǎn)生埃博霉素的新粘細(xì)菌資源和LC-HRMS追蹤分離新PKS&NRPS生物合成基因簇的產(chǎn)物,為深入開(kāi)發(fā)武夷山自然保護(hù)區(qū)大型真

2、菌和土壤粘細(xì)菌的新活性天然產(chǎn)物提供了豐富的菌種資源和可行的研究模式。
　　 第一篇為武夷山自然保護(hù)區(qū)大型真菌的生物多樣性以及可培養(yǎng)大型真菌輻毛鬼傘Coprinus radians M65菌株發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分研究。武夷山自然保護(hù)區(qū)地處亞熱帶,是中國(guó)東南亞大陸生物多樣性最豐富的地區(qū),具有全球生物多樣性保護(hù)意義。本研究從2006年7月-2008年7月先后五次對(duì)武夷山保護(hù)區(qū)部分區(qū)域的大型真菌進(jìn)行采集,共獲得300多份子實(shí)體,形態(tài)鑒定子

3、實(shí)體標(biāo)本178份,包括3個(gè)目19個(gè)科108個(gè)種的大型真菌。利用rDNA的ITS片段對(duì)79個(gè)子實(shí)體和75個(gè)來(lái)自NCBI的參考序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和多樣性分析,結(jié)果表明17個(gè)進(jìn)化支共包含14個(gè)分類群,其中Russulaceae和Boletales是發(fā)育樹(shù)中最大的進(jìn)化支;另外三個(gè)比較大的分支Russulaceae、Boletale和Amanitaceae獨(dú)立進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果表明武夷山保護(hù)區(qū)蘊(yùn)含著十分豐富的高等真菌資源。此外,本論文研究對(duì)分離

4、自大型真菌的輻毛鬼傘Coprinus radians M65菌株的發(fā)酵產(chǎn)物,開(kāi)展了系統(tǒng)的分離純化和結(jié)構(gòu)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)13個(gè)新二萜化合物Radianspenes A-M。其中Radianspene C顯示良好的細(xì)胞毒活性,Radianspene M為首個(gè)ent-kaurane型二萜之外的新穎二萜二聚體。
　　 第二篇為粘細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究和PKS&NRPS基因簇c941的產(chǎn)物的初探。從全國(guó)各地采集土樣和腐爛植物分離得到的239株粘

5、細(xì)菌菌株進(jìn)行純化,得到約157株純培養(yǎng)粘細(xì)菌,通過(guò)形態(tài)鑒定和16S rDNA測(cè)序比對(duì)相結(jié)合,最終鑒定粘球菌61株,珊瑚菌6株,堆囊菌90株。
　　 關(guān)于粘細(xì)菌的新活性天然產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)掘,首先采用HPLC-HRMS篩選的方法,聯(lián)合德國(guó)薩爾大學(xué)的粘細(xì)菌已知化合物數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)61株粘球菌(Myxococcus)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)myxovirescin、cittilin和myxochromid可能有種級(jí)化學(xué)分類學(xué)意義,DKXa

6、nthen和myxalamid可能有屬級(jí)化學(xué)分類學(xué)意義;發(fā)現(xiàn)葉柄粘球菌M.stipitatus SBMx132菌株能產(chǎn)生少量的DKxanthen和myxalamid等已知化合物外,還產(chǎn)生一類極性比較小的未知化合物MxUA。通過(guò)LC-HRMS示蹤對(duì)其進(jìn)行分離純化,共分離得到7個(gè)單體化合物,其中化合物522、524和538通過(guò)波譜解析、酯交換反應(yīng)和GC-MS/MS檢測(cè),最終確定為新聚酰胺類化合物。其次,重點(diǎn)對(duì)85株堆囊菌的粗提物進(jìn)行活性篩選

7、,并結(jié)合LC-HRMS分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,最后得到7株可能產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)活性化合物的候選菌株;使用PCR篩選,結(jié)合代謝產(chǎn)物的LC-MS分析,從60株纖維堆囊菌中發(fā)現(xiàn)1株埃博霉素相對(duì)高產(chǎn)的菌株XMU-So-112。最后,本論文研究通過(guò)對(duì)黃色粘球菌Myxococcus xanthus A47菌株基因組的生物信息學(xué)分析,以一個(gè)新PKS&NRPS生物合成基因簇c94-1為研究對(duì)象,通過(guò)單交換同源重組,得到突變株47-c94_orf3-和47-c94_