高增殖性能犬流感重組病毒的制備及流感病毒基因末端序列決定轉(zhuǎn)錄水平的研究.pdf

1、犬流感病毒是危害犬類的一類重要病毒，本論文利用流感病毒反向遺傳操作技術(shù)，拯救了一系列H3N2亞型犬流感病毒株A/canine/Zhejiang/01/2010（H3N2）（簡(jiǎn)稱ZJCIV）和PR8（A/Puerto Rico/8/34(H1N1)）的重組病毒，篩選獲得了一株高效表達(dá)H3N2亞型犬流感病毒表面抗原的重組病毒；利用PR8病毒微型復(fù)制子系統(tǒng)，研究了包裝效率最高的情況下，流感病毒8個(gè)基因片段末端序列對(duì)報(bào)告基因（Firefly l

2、uciferase）轉(zhuǎn)錄的影響，同時(shí)比較研究了不同包裝效率下，M基因末端序列對(duì)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　近年來爆發(fā)的H3N2亞型犬流感對(duì)我國(guó)不同種類的犬構(gòu)成極大威脅，目前還沒有有效的疫苗用于該病毒防制。ZJCIV在雞胚和MDCK細(xì)胞上的增殖能力均很差，為了獲得高效表達(dá) ZJCIV病毒表面抗原的重組病毒，本實(shí)驗(yàn)利用反向遺傳操作技術(shù)，將ZJCIV的HA和NA基因與PR8病毒的內(nèi)部基因及突變的NP（G132A）基因和NS2(E67/74

3、S）進(jìn)行人工重組，拯救并獲得了4株犬流感重組病毒CIV-PR8、CIV-NP、CIV-NS和CIV-NP-NS。用含100 EID50的病毒接種9-11日齡 SPF雞胚。CIV-NS,CIV-NP-NS接種雞胚36 h后，尿囊液的HA滴度達(dá)到最高，CIV-NP和CIV-PR8在接種48h后尿囊液的HA滴度達(dá)到最高，CIV-NS的血凝效價(jià)平均值可達(dá)213.33。用2×103 TCID50的病毒感染MDCK細(xì)胞，CIV-NS的細(xì)胞上清HA滴

4、度最高，可達(dá)210，CIV-NP-NS次之為29，而野生病毒ZJCIV只有24；無論通過雞胚擴(kuò)增還是細(xì)胞擴(kuò)增，4株重組犬流感病毒的TCID50均高于ZJCIV，其中CIV-NS的TCID50高于其他毒株。本研究我們成功救獲了4株增殖能力明顯高于野生毒株ZJCIV重組犬流感病毒，CIV-NS在雞胚和MDCK細(xì)胞上的增殖能力明顯優(yōu)于其他毒株，該重組病毒有望成為犬流感疫苗研制的候選種毒。
　　流感病毒基因片段的3′端和5′端非編碼區(qū)及部

5、分編碼區(qū)序列不僅起包裝信號(hào)的作用，而且這些序列決定了流感病毒各基因的表達(dá)量。本研究將PR8流感病毒株最高包裝效率的8個(gè)基因片段5′和3′末端序列分別克隆于RNA聚合酶I啟動(dòng)子和RNA聚合酶I終止子之間，并且在5′和3′端之間設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，然后在酶切位點(diǎn)之間插入報(bào)告基因（Firefly luciferase），并將5′端編碼區(qū)的起始密碼子ATG突變?yōu)镚TG，改造后的基因只轉(zhuǎn)錄表達(dá)報(bào)基因的開放閱讀框。將構(gòu)建的質(zhì)粒分別與表達(dá)流感病毒PB1、P

6、B2、PA、NP及表達(dá)內(nèi)參Renilla luciferase的5個(gè)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)比較在包裝效率最高的情況下，流感病毒8個(gè)基因片段末端序列對(duì)報(bào)告基因（Firefly luciferase）轉(zhuǎn)錄的影響。研究發(fā)現(xiàn)，PA基因末端的轉(zhuǎn)錄水平最高，而M基因末端的最低。選擇了M基因片段的5種包裝效率下的末端序列，用同樣的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒，將構(gòu)建的質(zhì)粒分別與表達(dá)流感病毒PB1、PB2、PA、NP及表達(dá)內(nèi)參Ren