磷匱乏影響玉米根系發(fā)育機制的研究.pdf

1、土壤有效磷供給不足和磷資源匱乏將引起未來的農業(yè)危機。在我國玉米主栽區(qū)，土壤有效磷不足已成為限制作物產量和增加生產成本的重要因素之一。同時，磷肥的大量使用也帶來了水域富營養(yǎng)化等生態(tài)問題。因此，利用作物固有的生物學特性，挖掘作物自身對磷素高效吸收利用的潛力來解決上述問題已成為植物生物學研究中的熱點領域。由于土壤磷素移動性差，根系的生長發(fā)育和形態(tài)結構對磷素吸收尤為重要，同時根系還可通過合成生長調節(jié)物質(如CTK、ABA等)來調控整個植株的狀態(tài)

2、包括葉片衰老、光合速率、氣孔開度等。玉米是最重要的農作物之一，其根系特點與擬南芥明顯不同，其發(fā)育調控機理也可能有差異，研究磷營養(yǎng)影響玉米根系發(fā)育的機制對于培育磷高效玉米新材料有重要意義。
　　 本研究以玉米骨干自交系齊319(Q319)和其細胞工程突變體99038去胚乳幼苗為材料，比較了它們在不同供磷水平下的轉錄組差異；分析了低磷誘導的轉錄因子基因ZmPT目的表達強度變化對玉米植株生長發(fā)育的影響及其作用機制；克隆了與生長素濃度梯

3、度形成與維持相關的包含Zea mays auxin transporterprotein3(ZmAUX1)在內的4個生長素極性轉運流入載體基因和包含ZmPIN1α和ZmPIN1b在內的13個生長素極性轉運流出載體基因，并進行了表達譜分析和啟動子序列分析；利用農桿菌介導法將正反向的ZmAUX1、ZmPIN1α和ZmPIN1b基因導入到了玉米骨干自交系DH4866中，獲得了純合的轉基因植株，對轉基因植株的生長發(fā)育狀況、產量性狀、根系構型和對

4、低磷環(huán)境的反應進行了分析。在本工作中，獲得了具有很好應用前景的轉ZmPTF1基因和轉ZmPIN1α基因的玉米育種材料。
　　 玉米自交系Q319和99038的根系轉錄組比較分析
　　 利用玉米全基因組芯片(microarray)檢測了低磷處理0、2、8d的玉米自交系Q319和99038的根尖和側根原基發(fā)生區(qū)的轉錄組變化。該芯片含47K的玉米寡核苷酸探針，后者代表3萬多個基因。設在3個生物學重復中符合ratio≤0.66

5、orratio≥1.5且p≤0.1(t-test)的基因為有意義的差異基因。低磷處理前，在根尖區(qū)中99038比Q319中表達上調的基因有470個，表達下調的基因有542個；而在側根原基發(fā)生區(qū)99038比Q319中表達上調的基因為621個，表達下調的有572個。在低磷處理2d后，與Q319的相比，99038根尖表達上調的基因有343個，下調的有245個；在側根原基發(fā)生區(qū)99038比Q319上調表達的基因有272個，下調表達的有270個。在

6、低磷處理8d后，在根尖區(qū)，99038比Q319表達上調的基因為984個，表達下調的為812個；在側根原基發(fā)生區(qū)99038比Q319表達上調的基因為601個，表達下調的為457個。這些差異表達基因的功能分類表明，Q319和99038根系在低磷處理的不同時間點上存在著不同的應答反應，根的不同部位對低磷脅迫的響應也存在差異。在這些差異表達基因中，約有50％的差異基因功能不清楚，其余大多數與代謝相關，其次與細胞信號轉導、轉錄、細胞增殖關聯等。這

7、些結果表明，玉米根系對低磷脅迫的應答是一個復雜的過程，存在多個適應或調節(jié)機制。
　　 在低磷處理前，一些參與乙烯和生長素代謝及信號途徑的基因，其表達強度在兩基因型之間存在顯著差異。1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid(ACC)oxidase編碼基因(對應探針號：TM00025945、TM00042027)和acc synthase編碼基因(TM00018872)的表達在99038的側根原基發(fā)

8、生區(qū)顯著低于Q319的，而在根尖區(qū)卻高于Q319的，提示由腺苷甲硫氨酸生成乙烯的強度可能在99038和Q319的不同部位根區(qū)段中存在差異。在乙烯信號途徑中位于CTR1下游的膜結合蛋白EIN2(ethylene insensitive2，TM00057348)和乙烯應答轉錄因子(ethylene-responsive factor-like protein1，ERF1，TM00030445)和ethylene-responsive sma

9、ll GTP-binding protein(TM00014304)在99038側根原基發(fā)生區(qū)的表達量也顯著低于Q319的，乙烯響應元件結合蛋白(ethylene responsive elementbinding factor3，TM00018574和TM00042351)等基因的表達在99038的根尖高于Q319的。這些結果表明乙烯信號轉導途徑參與了99038更發(fā)達根系的形成。
　　 生長素是調控植物根系發(fā)育的核心激素之一，

10、參與了植物對低磷脅迫的反應。生長素的極性轉運對生長素濃度梯度的形成、生長素信號的啟動、生長素調控生長發(fā)育過程至關重要。生長素極性轉運流入載體AUX1-like permease(TM00029483)的表達在99038根尖和側根原基發(fā)生區(qū)顯著高于Q319的，可能與99038側根數量有關。TM00003447編碼phosphatase2A的調節(jié)亞單位，在99038的側根發(fā)生區(qū)表達強度遠低于Q319的。該酶通過磷酸化與去磷酸化作用可逆調節(jié)生

11、長素流出載體PIN蛋白的分布，這暗示著在該區(qū)段生長素流出速率大幅度降低，有利于生長素在此處的積累。PGP1(TM00020888)是參與生長素極性運輸的另一類載體，也在兩個基因型中的表達強度差異表達。TM00047995編碼IAA-Alahydrolase，該酶水解IAA-Ala復合物產生有活性的IAA，在側根發(fā)生區(qū)99038的轉錄豐度顯著高于Q319的，而在根尖區(qū)卻低于Q319的，這與99038的根系形態(tài)相對應。Tryptophan

12、synthase(TM00016868)、putative tyrosine/dopa decarboxylase(TM00005060)、indole-3-glycerol phosphate lyase(TM00005958)和cinnamic acid4-hydroxylase(YUCCA，TM00025513)等IAA生物合成中的關鍵酶基因也在這兩個基因型間差異表達，可能導致局部IAA的合成或活性IAA的濃度在99038和Q31

13、9中出現差異。另外，玉米中的生長素結合蛋白auxin binding protein1(ABP1，TM00041857)、auxin-induced in root cultures protein12(TM00055925)和GH3家族成員(TM00048104)等生長素信號途徑或應答基因在兩個基因型之間的表達也出現差異。以上這些差異暗示著根系不同區(qū)段的IAA含量及活性的變化、以及信號途徑及下游基因的表達差異很可能是造成兩個基因型根系

14、形態(tài)差異的主要因素之一。
　　 生長素和乙烯的合成、代謝和信號轉導及調控參與了玉米對低磷脅迫的應答。在低磷處理2d和8d的植株中，生長素極性運輸和分布調節(jié)相關基因的表達在99038和Q139之間存在明顯差異，可能低磷脅迫通過影響生長素極性轉運而影響整個植株的生長狀態(tài)。與足磷供給條件下相比，MAP3K、MAPK4、MAPK5、MAPK6等基因在根尖區(qū)呈下調表達，MAPK信號系統(tǒng)可能參與了低磷脅迫信號的轉導及代謝變化。乙烯信號途徑中

15、的EIN3、ERF1、赤霉素信號途徑中的Gibberellin-regulated protein2等基因的差異表達可能與低磷脅迫下側根發(fā)生和兩個基因型在低磷脅迫下的根系差異有關。99038和Q319對生長素、乙烯信號反應的差異很可能是造成它們對低磷脅迫響應差異的重要原因。
　　 一些轉錄因子和在信號轉導及生長發(fā)育中起重要作用的基因，如14-3-3、ABP1、AUX1、RHD3、ROP6、SGR2、BRI1等，在兩個基因型間或/

16、和在低磷處理前后出現表達豐度的差異，提示它們參與了玉米根系發(fā)育的調控和對低磷脅迫耐的響應，可作為玉米根系改良和磷高效育種的操控靶標。
　　 過表達ZmPTF1改進了玉米根系發(fā)育和耐低磷特性
　　 前期工作中，實驗室通過RACE的方法克隆到ZmPTF1基因，該基因編碼具有bHLH(basic helix-loop-helix domain)結構域的轉錄因子，與水稻的OsPTF1有高的相似性。該基因在根中受低磷脅迫誘導表達。

17、ZmPTF1過表達株系在不同介質培養(yǎng)條件下根系發(fā)達，根系明顯大于對照和轉反義基因植株的。當生長于低磷土壤中，ZmPTF1過表達株系具有較多的雄穗分支數和較飽滿的籽粒，受低磷脅迫影響較小。過表達ZmPTF1導致了一些低磷脅迫響應基因如RNases、vacuolar H+pyrophosphatase(H+-PPase)、PEP carboxykinase等在正常磷供給下高量表達。糖含量測定表明，ZmPTF1過表達株系葉片中可溶性糖濃度(G

18、lu+Fm+Suc)低于對照和轉反義基因植株的，而根中的可溶性糖濃度高于對照和轉反義基因植株的。對蔗糖合成和分解代謝相關基因的表達分析發(fā)現，過表達ZmPTF1導致了蔗糖合成關鍵基因fructose-1，6-bisphosphatase和sucrosephosphate synthase1的表達在葉片中顯著提高，在根中明顯低于對照植株的。同時，參與蔗糖代謝的酶基因在過表達株系根中的表達量也低于對照的。ZmPTF1過表達導致了玉米代謝和根系

19、形態(tài)發(fā)生變化，當遭受低磷脅迫時，這些特征能促進過表達株系較快適應低磷環(huán)境，減少了低磷對玉米生長發(fā)育和產量的影響。該工作為深入了解ZmPTF1-耐低磷-根系形態(tài)-糖之間的關系積累了重要資料，提供了一個通過基因工程育種來提高作物對低磷環(huán)境的耐性的成功實例。獲得的轉基因材料已通過轉基因生物安全性中間試驗，并提供給多家育種單位用于育種。生長素極性運輸相關基因在玉米根系發(fā)育中的表達變化
　　 生長素極性運輸使生長素在植株體內形成以器官頂端

20、為中心的濃度梯度，并維持植物不同組織中的生長素濃度差，以調控植物的生長發(fā)育。介導生長素極性運輸的蛋白有AUX1/LAX家族、PIN-formed家族，ABCB家族蛋白。擬南芥和水稻中分別含有4個可能的生長素流入載體，8個和12個PIN蛋白家族成員。通過生物信息學預測和RT-PCR從玉米克隆出4個可能的生長素流入載體，13個可能的生長素流出載體。與擬南芥和水稻中生長素輸入/出載體相比較，發(fā)現早期報道的玉米ZmAUX1(rename=Zm

21、auxin transporter protein3)與擬南芥auxintransporter2和3、水稻Os auxin transporter protein3的序列相近，在氨基酸組成、長度、等電點和分子量上差異不大。在克隆的13個可能的玉米生長素流出PIN-like基因中，與AtPIN1同源的基因有4個，分別為ZmPIN1α、ZmPIN1b、ZmPIN1c和ZmPIN1d。ZmPIN1b和ZmPIN1c在玉米基因組上對應于同一段序

22、列，推測認為它們是同一mRNA前體可變剪接的產物，與OsPIN1α有較新的相似性。ZmPIN1α是水稻OsPIN1c的同源基因，玉米ZmPIN1d與水稻OsPIN1b和OsPIN1d親緣關系近。與AtPIN5同源的玉米基因有5個，分別定位于玉米的3、4、8、2、1染色體上，編碼產物相似性較高。與AtPIN8同源的玉米基因只1個，命名為ZmPIN8。在玉米中還有一個與水稻OsPIN9同源的基因，命名為ZmPIN9。未找到AtPIN2、4t

23、PIN4、AtPIN6和AtPIN7在玉米中的同源基因，在水稻基因組中也未發(fā)現AtPIN4、AtPIN6和AtPIN7的同源基因。
　　 啟動子元件分析發(fā)現Zm auxin transporter protein3可能更多的參與干旱脅迫誘導的反應，而Zm auxin transporter protein2和Zm auxin transporter protein4則在傷害反應中起作用。PIN1家族對冷、熱脅迫的響應可能主要是通

24、過ZmPIN1b/c完成的，而ZmPIN1α在干旱、ABA的應答反應中起主要作用。ZmPIN1α表達可能是受干旱、內源ABA、GA、乙烯等調控，在植株形態(tài)建成和生長發(fā)育中起重要作用。ZmPIN3b基因可能受MYBHv1的調控。ZmPIN3α和ZmPIN3b可能參與了損傷反應及形態(tài)發(fā)生，并對環(huán)境脅迫發(fā)生反應，受玉米素、赤霉素和生長素濃度梯度或信號途徑的調控。
　　 ZmAUX1在地上部分的表達豐度遠高于根中，如在萌發(fā)4d的小苗中幼

25、葉的表達豐度是幼根的5倍多。推測該基因在生長素從地上部分向地下部的轉運中起關鍵作用。生長素流出載體ZmPIN1b，ZmPIN1α表達強度相對高，ZmPIN3α，ZmPIN3b、ZmPIN5α、ZmPIN5b、ZmPIN5c、ZmPIN8、ZmPIN9的表達在5葉期玉米中表達強度很低。這些基因在種子萌發(fā)期活躍表達暗示著它們參與了植株早期生長與發(fā)育。生長素極性轉運相關基因在5葉期玉米的葉片、側根發(fā)生區(qū)和根尖區(qū)具有不同的表達豐度。各基因對低磷

26、脅迫的響應也與器官部位有關。在側根發(fā)生區(qū)ZmAUX1、ZmPIN1α、ZmPIN1b受低磷脅迫的誘導，而ZmPIN1c表達卻被低磷脅迫抑制。在根尖和葉片中ZmPIN1α的表達受低磷脅迫的誘導，而其它基因的表達受到抑制。
　　 以上結果表明，生長素極性運輸相關基因參與了玉米形態(tài)建成和生長發(fā)育的調控，參與了對低磷脅迫的應答。
　　 轉ZmPIN1α/1b基因和ZmAUX1基因對玉米生長發(fā)育和磷脅迫抗性的影響
　　 在

27、對生長素極性轉運相關基因分析的基礎之上，構建了ZmPIN1α、ZmPIN1b和ZmAUX1的正、反向植物表達載體，通過農桿菌介導的轉化法將它們分別導入到玉米優(yōu)良自交系DH4866中，獲得了純合的轉基因植株，在此基礎上研究了ZmPIN1α、ZmPIN1b和ZmAUX1的表達強度變化對玉米生長發(fā)育、根系構型和對低磷環(huán)境反應的影響。
　　 轉正義ZmPIN1b或ZmPIN1α基因植株的根系比WT和轉反義基因植株的發(fā)達，其中以轉正義Zm

28、PIN1α基因的更為明顯，表現為種子根長、側根數目增多，根體積變大。生物量測定表明，轉正義ZmPIN1α基因的根系生物量顯著高于WT的，而莖葉生物量明顯低于WT的。在SP營養(yǎng)液培育下，轉正義ZmPIN1α株系玉米根系較發(fā)達，雖然種子根數和冠根數與WT植株基本無差異，但側根是對照植株的121～173％。轉反義ZmPIN1α株系的側根數目則為WT植株的82％～106％。根長度分析揭示，轉正義ZmPIN1α植株的初生根長度顯著高于WT及反義株

29、系的，但平均根長卻顯著低于WT和轉反義基因株系的，形成了種子根較長側根密集的表型。當在LP營養(yǎng)液中生長時，各株系均表現出適應性變化，主要表現在初生根增加，側根數目減少，而ZmPIN1α基因過表達的效果更加明顯。比較低磷條件下不同株系的性狀差異，得出轉正義ZmPINα口植株的根數目是WT的141％～261％，但總根長是WT的98％～132％，即過表達ZmPIN1α促進側根發(fā)生，這與低磷脅迫下生長素濃度梯度的局部變化相對應。分析成株期植株的

30、形態(tài)，發(fā)現轉正義ZmPIN1α基因植株下部莖節(jié)間變短、穗位和株高均降低、側根數目增多、根系涉獵面積顯著增大，從而提高了植株對水分和養(yǎng)分的吸收能力，有利于產量提高。所創(chuàng)造的種質材料可能在玉米耐密植育種中有很好的應用價值。
　　 ZmPIN1b基因轉正義基因植株的莖葉生物量高于WT的，但未達到差異顯著程度，根系生物量則顯著高于WT的。其反義株系的表型和生物量與WT無明顯差別。在SP營養(yǎng)液培養(yǎng)下轉正義ZmPIN1b基因的植株根數目比W

31、T增加，為WT的129％～146％，根總長是WT的114％～138％。而轉反義基因株系的根數目和根總長比WT略有下降。在LP營養(yǎng)液中培養(yǎng)時，轉正義基因植株和轉反義基因植株都表現出對低磷脅迫的敏感性降低，側根數、總根數和SP培養(yǎng)液中的植株相差不大，與WT對低磷脅迫的應答有顯著差異。可能ZmPIN1b影響了玉米在低磷脅迫條件下根系的適應性變化。
　　 轉ZmAUX1正、反義株系的分析表明，過表達ZmAUX1的植株在低磷環(huán)境中能維持較

32、高的生物量和較好長勢。并且ZmAUX1的過表達調節(jié)其它生長素極性運輸相關基因的表達。
　　 該實驗結果表明，通過調節(jié)生長素極性運輸強度來改變玉米植株構型及根系構型是可行的，為玉米抗逆育種和高產育種提供了新思路。ZmPIN1a基因過表達對植株轉錄組影響
　　 采用Real-time RT-PCR方法分析了過表達和抑制表達ZmPIN1a對生長素極性轉運相關基因表達的影響，發(fā)現過表達ZmPIN1a引起ZmAUX1、ZmPIN1

33、b、ZmPIN1c、ZmPIN3b、ZmPIN3b在幼葉和幼根中上調表達，在多數轉反義基因株系中這些基因則不同程度下調表達。ZmAUX1表達強度在過表達株系葉中是對照的3～6倍，在根中是對照的1.4～2.2倍；ZmPIN1b表達強度變化在根中和ZmAUX1相近，在葉中則低于ZmAUX1的，是對照植株的2～5倍；ZmPlN1c也表現出同樣的變化趨勢，但變化幅度較小。PIN3的2個成員的表達也受到ZmPIN1a過表達的誘導，且變化幅度大，但

34、與ZmPIN1a的表達強度對應關系不明顯。ZmPIN5、ZmPIN8、ZmPIN9這幾個短loop的PIN基因表達變化不明顯。
　　 采用數字表達譜分析了不同供磷狀態(tài)下ZmPIN1a正、反義株系和對照的葉片和根中的差異表達基因，發(fā)現過表達ZmPIN1a對轉錄組有較大影響，抑制ZmPIN1a表達對轉錄組影響相對較小，尤其在根中。過表達ZmPIN1a植株的根系形態(tài)和株型發(fā)生了顯著變化，轉錄組分析表明這些變化是大量基因表達變化引起的體

35、內代謝反應及生長發(fā)育調整的結果。生長素和乙烯的代謝及信號轉導途徑明顯受到ZmPIN1a表達水平的影響，光合作用在過表達ZmPIN1a植株中增強。另外，在過表達ZmPIN1a基因植株中一些中間代謝產物出現積累，晝夜節(jié)律相關因子出現不同變化趨勢。這些資料為深入了解生長素極性轉運與玉米株型之間的關系提供了大量信息。
　　 本工作利用兩個對低磷脅迫響應有明顯差異的玉米自交系為材料進行了轉錄組比較，鑒別出一些可能在玉米低磷脅迫反應和根系發(fā)