不同基因型玉米對(duì)磷脅迫的反應(yīng)及根系蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、磷作為植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素之一，它不僅是核酸和生物膜的重要組分，而且在能量代謝、光合作用、呼吸作用、酶活性調(diào)節(jié)、氧化還原反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)和碳代謝等方面也扮演重要角色。因此，磷幾乎參與了植物所有的生命活動(dòng)過(guò)程，它的缺乏必然嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和谷物產(chǎn)量。作物主要通過(guò)根系吸收土壤中的可溶性磷酸鹽來(lái)滿足其磷營(yíng)養(yǎng)需求。盡管在一些土壤中總磷含量是相當(dāng)豐富，然而有效磷濃度卻通常在1μM左右，遠(yuǎn)不能滿足植物獲取充足磷營(yíng)養(yǎng)的需求，土壤有效磷不足

2、已成為我國(guó)乃至全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中限制谷物產(chǎn)量的主要因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界30﹪以上耕地的谷物產(chǎn)量受到磷缺乏限制。為解決土壤有效磷不足的問(wèn)題，在1960-2000年間磷肥投入量增加了4-5倍，但施入的磷肥80﹪以上被土壤固定，并且在部分地區(qū)造成水域富營(yíng)養(yǎng)化。照此下去，未來(lái)60-80年內(nèi)地球磷礦資源將被耗盡，土壤有效磷不足和潛在的磷資源匱乏將成為未來(lái)農(nóng)業(yè)的潛在危機(jī)。因此，利用作物固有的生物學(xué)特性，挖掘作物自身對(duì)土壤磷素高效吸收利用的潛力，培育

3、磷高效作物品種，是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和解決上述缺磷及環(huán)境污染問(wèn)題的一條最有希望的途徑。 玉米在我國(guó)乃至世界糧食體系中占有舉足輕重的地位。近年來(lái)土壤有效磷不足在許多地區(qū)限制了玉米產(chǎn)量、增加了其生產(chǎn)成本。由于玉米植株高大，生產(chǎn)上利用雜交優(yōu)勢(shì)，采用以生物量和產(chǎn)量為尺度篩選磷高效基因型，不僅周期長(zhǎng)、工作量大，而且易受環(huán)境干擾、很難準(zhǔn)確判斷。植物生物技術(shù)的發(fā)展，為獲得玉米磷高效基因型開(kāi)辟了新途徑，然而這需要充分了解玉米低磷耐受機(jī)制。因此，深入

4、研究玉米磷耐受機(jī)制具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。 近年來(lái)，植物耐低磷機(jī)制的研究非?；钴S，也取得了重大進(jìn)展。低磷耐受機(jī)制已被證明是多基因或QTLs控制的數(shù)量性狀，一些磷饑餓響應(yīng)基因在高等植物磷脅迫反應(yīng)中的作用也已被初步了解。在轉(zhuǎn)錄組水平上的大量工作表明植物耐低磷脅迫反應(yīng)是由復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)控制的過(guò)程。然而，蛋白是細(xì)胞功能的執(zhí)行者，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為植物基因表達(dá)分析提供了較為準(zhǔn)確和直觀的手段，但在蛋白質(zhì)組水平上研究植物根系對(duì)低磷脅迫應(yīng)

5、答的工作未見(jiàn)報(bào)道。在以前的工作中，本實(shí)驗(yàn)室利用細(xì)胞工程技術(shù)獲得了一系列具有不同低磷耐受性的玉米材料。經(jīng)過(guò)連續(xù)6代的自交選擇和耐低磷性檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)自交系99038具有穩(wěn)定遺傳的低磷耐受特性和優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，是玉米磷高效育種和低磷耐受機(jī)制研究的好材料。本論文以低磷耐受性玉米自交系99038和來(lái)源親本齊319為材料，對(duì)足磷和缺磷處理?xiàng)l件下兩者的根系形態(tài)和生理生化特性進(jìn)行了系統(tǒng)的比較；檢測(cè)了低磷脅迫下齊319根系蛋白質(zhì)組的變化并鑒定分析了大量

6、差異表達(dá)的蛋白；分別對(duì)足磷和缺磷條件下的99038和齊319根系進(jìn)行了系統(tǒng)的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并結(jié)合兩者的根系形態(tài)和生理生化特性差異對(duì)鑒定的蛋白進(jìn)行了細(xì)致的分析，旨在找出99038較齊319具有更高低磷耐受性的主導(dǎo)因素，為通過(guò)基因工程手段進(jìn)行玉米磷高效育種提供重要參考資料。 一、玉米耐低磷自交系99038和對(duì)照齊319的根系形態(tài)和生理生化特性分析連續(xù)數(shù)代的觀察發(fā)現(xiàn)，99038植株的地上部分與齊319沒(méi)有明顯差別，但根系較齊31

7、9的更發(fā)達(dá)，根系形態(tài)具有明顯的差異。由于磷素在土壤中低的移動(dòng)性，發(fā)達(dá)的根系對(duì)于植物高效吸收土壤磷素尤為重要。與齊319相比，99038小苗的三條最長(zhǎng)根的平均長(zhǎng)度、根冠比、側(cè)根平均長(zhǎng)度和單位質(zhì)量莖葉所對(duì)應(yīng)的根系吸收面積、根體積、側(cè)根數(shù)目以及總根長(zhǎng)均顯著增加，根平均直徑明顯變細(xì)，這一系列變化擴(kuò)大了根系與土壤的接觸面積和涉獵的土壤體積，提高了99038對(duì)磷素的吸收能力。通過(guò)檢測(cè)不同供磷水平下99038和齊319根系與莖葉的磷含量和磷濃度，以及

8、植株體內(nèi)磷素的分配，發(fā)現(xiàn)低磷脅迫下99038與齊319相比將更高比例的磷滯留在植株根部，根系含磷量是齊319的1．5倍，根系磷濃度顯著高于齊319，其生長(zhǎng)發(fā)育與齊319相比受抑制程度較小(與足磷條件下相比)。酸性磷酸酶活性分析表明，低磷脅迫下兩個(gè)基因型玉米老葉和根尖部位的酸性磷酸酶活性均大大提高，但足磷和缺磷條件下齊319和99038相應(yīng)部位的酸性磷酸酶活性沒(méi)有顯著差別，說(shuō)明酸性磷酸酶活性不是造成兩個(gè)基因型玉米低磷耐受性差異的主要因素。

9、根系磷吸收動(dòng)力學(xué)分析表明，在足磷和缺磷條件下99038較齊319均具有更高的I<,max>值，更低的K<,m>和C<,min>．值，具有磷高效特性。根系蛋白表達(dá)譜分析得出，在低磷條件下99038和齊319根蛋白表達(dá)譜(pH 3-10)中有13.6﹪的蛋白存在質(zhì)或量的顯著差異(P<0.01)?；谶@些結(jié)果，初步認(rèn)為有可能99038和齊319根蛋白的差異表達(dá)導(dǎo)致兩者根系形態(tài)和磷吸收能力的差異，從而導(dǎo)致99038低磷耐受性優(yōu)于齊319；同時(shí)證

10、明了細(xì)胞工程技術(shù)在玉米磷高效育種中具有重要的價(jià)值。 二、低磷脅迫下齊319根系生長(zhǎng)和代謝改變的蛋白質(zhì)組分析在對(duì)齊319和99038的根系形態(tài)和生理生化特性進(jìn)行分析中，我們發(fā)現(xiàn)低磷脅迫下盡管齊319和99038的根系形態(tài)和磷吸收特性存在明顯差異，但它們的變化趨勢(shì)是一致的，即與足磷條件下相比，它們的根冠比和單位質(zhì)量莖葉所對(duì)應(yīng)的總根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)目、根體積和根系吸收面積均顯著增加，根平均直徑明顯變細(xì)，根系對(duì)磷素的吸收能力顯著提高。為了深入

11、了解玉米根系對(duì)低磷脅迫的適應(yīng)機(jī)制，取低磷(5μMKH<,2>PO<,4>)和足磷(1000μMKH<,2>PO<,4>)處理17天的齊319根系進(jìn)行蛋白質(zhì)組差異分析。雙向凝膠電泳檢測(cè)出約1300個(gè)蛋白點(diǎn)，其中254個(gè)蛋白在足磷和缺磷條件下存在量的顯著差異，占檢測(cè)出的蛋白總數(shù)的19.5﹪。通過(guò)MALDI-TOF MS鑒定出120個(gè)差異表達(dá)的蛋白，并進(jìn)行了功能分類分析。這120個(gè)鑒定蛋白分布在多個(gè)功能種類范圍，包括44個(gè)代謝相關(guān)蛋白、13個(gè)

12、蛋白命運(yùn)相關(guān)蛋白、6個(gè)蛋白合成相關(guān)蛋白、5個(gè)能量代謝相關(guān)蛋白、9個(gè)次級(jí)代謝相關(guān)蛋白、7個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、11個(gè)抗性或與環(huán)境互作相關(guān)蛋白、3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白、7個(gè)轉(zhuǎn)錄/細(xì)胞周期/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白、15個(gè)未分類或未知蛋白。其中有些蛋白，如tRNA異戊烯基轉(zhuǎn)移酶、GTP結(jié)合的核蛋白R(shí)AN-B1、AraC type：Arac蛋白、嘌呤豐富元件的結(jié)合蛋白B類似蛋白和蛋白激酶等，參與激素合成、細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過(guò)程。這些蛋白可能在連接外部磷

13、濃度改變和植物代謝適應(yīng)性調(diào)控方面扮演重要角色，以調(diào)控基因表達(dá)，維持細(xì)胞相對(duì)磷穩(wěn)態(tài)。上述結(jié)果從蛋白質(zhì)組水平上揭示了植物磷饑餓響應(yīng)是涉及多個(gè)信號(hào)和代謝途徑的復(fù)雜過(guò)程，為進(jìn)一步研究一些磷饑餓響應(yīng)基因在植物磷營(yíng)養(yǎng)中的功能提供了重要啟迪。 三、99038和齊319根系蛋白質(zhì)組差異分析為了了解99038磷高效分子機(jī)制和究竟哪些蛋白的差異表達(dá)導(dǎo)致99038和齊319根系形態(tài)發(fā)育和磷素吸收能力的顯著差異，我們通過(guò)pH 3-6和pH 5-8的IP

14、G膠條對(duì)1000μM和5 μM KH<,2>PO<,4>處理17天的99038和齊319根系進(jìn)行了蛋白質(zhì)組比較分析。足磷條件下，雙向電泳分離出1260個(gè)蛋白點(diǎn)，其中135個(gè)(10.7﹪)蛋白點(diǎn)在99038和齊319根中存在量的顯著差異；低磷條件下檢測(cè)到1637個(gè)蛋白點(diǎn)，其中196個(gè)(12.0﹪)蛋白點(diǎn)在兩個(gè)基因型間存在量的顯著差異。這些結(jié)果表明無(wú)論在足磷或缺磷條件下99038和齊319的根系蛋白質(zhì)組均存在較大差異。我們通過(guò)質(zhì)譜鑒定出99

15、038和齊319根系在足磷條件下呈現(xiàn)顯著差異的79個(gè)蛋白點(diǎn)和缺磷條件下呈現(xiàn)顯著差異的108個(gè)蛋白點(diǎn)，這些蛋白分布于廣泛的功能種類范圍。差異表達(dá)蛋白涉及碳代謝、激素合成、細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑，如碳代謝中的檸檬酸合酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、丙酮酸磷酸二激酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，激素合成及活化途徑中的C-24固醇甲基轉(zhuǎn)移酶、β-糖苷酶，具有重要調(diào)控作用的GTP結(jié)合的核蛋白R(shí)AN-B1、importin α、MCM6、PP2A、14

16、-3-3、MAPK1、CDC48等，這些蛋白可能在調(diào)控玉米根系形態(tài)發(fā)育、細(xì)胞周期以及感知外部磷濃度變化等方面扮演重要角色。結(jié)合99038和齊319根系形態(tài)和磷吸收能力的差異，推測(cè)這些差異蛋白很可能通過(guò)參與碳代謝，激素信號(hào)途徑或細(xì)胞周期運(yùn)行的差異主導(dǎo)兩基因型根系生長(zhǎng)發(fā)育和磷吸收能力的差異。此外，在鑒定的所有差異蛋白中，有18種同功蛋白在足磷和缺磷處理的兩基因型根系中均具有相同的差異表達(dá)模式，包括細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白和大量碳代謝相關(guān)蛋白等，

17、它們?cè)?9038和齊319根系中的差異表達(dá)可認(rèn)為主要是由基因型不同所致。據(jù)此可推測(cè)99038和齊319在碳代謝、細(xì)胞周期調(diào)控等方面存在較大的基因型差異?；谏鲜鼋Y(jié)果，99038具有更發(fā)達(dá)的根系和更高的低磷耐受性與其碳代謝和細(xì)胞增殖調(diào)控有利于根系細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)等有關(guān)。同時(shí)，這些數(shù)據(jù)也加深了對(duì)一些磷饑餓響應(yīng)基因在玉米磷效率調(diào)控中的作用的認(rèn)識(shí)。本論文通過(guò)對(duì)耐低磷玉米自交系99038和其來(lái)源自交系齊319的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，初步