菊花黃綠葉突變體黃葉與綠葉組織形成的生理與分子機(jī)制比較研究.pdf

1、菊花(Chrysanthemum×morifolium(Ramat.) Kitamura）原產(chǎn)我國(guó)，是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花與世界四大切花之一，具有很高的觀賞與應(yīng)用價(jià)值，在花卉生產(chǎn)中占有十分重要的地位。目前，由于菊花以觀花為主，研究應(yīng)用主要集中在花型花色上，葉色研究較少。本研究通過對(duì)菊花黃綠葉突變體的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比研究，對(duì)類囊體蛋白含量與光譜、葉綠素?zé)晒馓匦赃M(jìn)行分析，及構(gòu)建黃綠葉突變體葉片中的黃葉組織與綠葉組織抑制差減雜交文庫(kù)，通過對(duì)差

2、減雜交文庫(kù)分析篩選與黃綠葉突變性狀相關(guān)的葉色突變基因，并對(duì)篩選到的兩個(gè)基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)分析，相關(guān)研究對(duì)揭示菊花葉色形成機(jī)理及遺傳改良有積極意義。主要結(jié)果如下:
　　 1.以菊花黃綠葉突變體‘NAU04-1-31’為試驗(yàn)材料，分別測(cè)定了菊花黃綠葉突變體葉片中黃葉與綠葉組織的葉綠素含量與類胡蘿卜素含量，并比較了兩種不同類型葉片組織的顯微、超微解剖結(jié)構(gòu)及類囊體膜蛋白的含量。葉綠素含量測(cè)定表明:黃葉組織中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜

3、素含量顯著低于綠葉組織，而黃葉組織與綠葉組織葉綠素a/b的比值則沒有顯著的差異。葉綠體顯微與超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn):黃葉組織中細(xì)胞內(nèi)葉綠體形狀不規(guī)則，缺乏正常的葉綠體膜結(jié)構(gòu)，無類囊體，無淀粉粒，嗜鋨顆粒較多且積聚成簇狀;而綠葉組織細(xì)胞內(nèi)葉綠體較多，形狀規(guī)則，基粒片層清晰，其內(nèi)淀粉粒結(jié)構(gòu)清晰且體積較大，嗜鋨顆粒較少且分散，說明黃綠葉突變體中黃葉與綠葉組織的顏色差異主要是由于葉綠素含量顯著減少所致。類囊體蛋白電泳結(jié)果表明:綠葉組織中最少可以分離出

4、15條類囊體膜多肽，而黃葉組織中則僅可分離出4條類囊體多肽，特別是黃葉組織中的光系統(tǒng)Ⅱ的多肽與綠葉相比下降明顯。類囊體膜的吸收光譜、熒光發(fā)射光譜及激發(fā)光譜明顯下降，而且峰位發(fā)生紅移與藍(lán)移，說明突變體類裘體膜的結(jié)構(gòu)可能受到了破壞，黃葉組織對(duì)光能的捕獲效率下降，且較依賴于Chla捕光并將光能激發(fā)傳遞給PSⅡ反應(yīng)中心。
　　 葉綠素?zé)晒馓匦员砻?菊花突變體黃葉組織與綠葉組織相比，其熒光參數(shù)Fo較高，而Fv/Fm、Fv'，/Fm'、(φ

5、)PSⅡ等參數(shù)較低，說明黃葉組織的光合機(jī)構(gòu)可能受到破壞，光化學(xué)能力下降;黃葉組織用于光化學(xué)反應(yīng)的光能遠(yuǎn)小于綠葉組織，而用于熱耗散的光能則大大增加。黃葉組織中與光抑制有關(guān)的NPQ成分qI增加，說明其更容易受到光抑制的破壞。黃葉組織光系統(tǒng)間的電子傳遞受阻，放氧復(fù)合體受到破壞，單位面積反應(yīng)中心數(shù)目較少，光合性能指數(shù)(PIABS)低于綠葉組織。與綠葉組織相比，黃葉組織PSⅡ光化學(xué)性能的下降，黃葉組織對(duì)光抑制比較敏感，通過提高熱耗散能力，來減少過

6、剩光能對(duì)黃葉組織光合機(jī)構(gòu)的破壞。
　　 2.為了驗(yàn)證黃葉組織與綠葉組織基因表達(dá)的差異，將黃綠葉突變體中綠葉組織與黃葉組織通過抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建了抑制差減雜交文庫(kù)。通過斑點(diǎn)雜交確定為陽(yáng)性克隆并測(cè)序獲得339個(gè)ESTs序列。其中從黃葉組織中分離到157個(gè)ESTs，綠葉組織中分離到182個(gè)ESTs，根據(jù)測(cè)序文件去除低質(zhì)量序列后，最終獲得293個(gè)ESTs。利用DNAStar軟件對(duì)293條ESTs分別進(jìn)行聚類，共獲得150個(gè)unigen

7、es，包括93個(gè)singletons，57個(gè)contigs。所有的ESTs經(jīng)BlastX比對(duì)和功能注釋發(fā)現(xiàn)在所有的Unigene中，107個(gè)unigene與已知基因具有類似功能，占71.3％;27個(gè)Unigene與已知基因未有顯著的同源性或僅具有推定功能，占18％;16個(gè)unigene在數(shù)據(jù)庫(kù)中未搜索到同源序列，可能為新基因，占10.6％。根據(jù)COG分類，可把所有的unigene劃分為16類:第一大類為能量生成與代謝，占16％;翻譯、核

8、糖體結(jié)構(gòu)與合成為第二大類，占14％;碳轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝及次生物質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝各占7.3％，細(xì)胞骨架、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等其它各類所占比例較少。其中在菊花黃葉中上調(diào)表達(dá)的鎂螯合酶(GUN5)大亞基和ATP依賴的金屬蛋白酶(VAR1)有可能參與到與花葉有關(guān)的表型形成。
　　 3.通過RACE技術(shù)，獲得了4451bp全長(zhǎng)的菊花鎂螯合酶大亞基(CmChlH) cDNA序列。序列分析表明:該序列包含4149bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一條1383

9、個(gè)氨基酸的蛋白。推測(cè)的蛋白大小與理論等電點(diǎn)分別為154kDa和5.95。根據(jù)ORF序列，在5'端有一段51個(gè)氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。菊花鎂螯合酶大亞基與擬南芥、水稻、念珠藻、嗜中溫螺旋桿菌分別有85％、82％、67％和43％的同源性，與同為雙子葉的擬南芥同源性最高，并具有保守的三個(gè)組氨酸殘基(H666，H670 and H815)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明:菊花與擬南芥、金魚草及煙草的ChlH有比較近的親緣關(guān)系，屬于一類。這些結(jié)果表明:菊花Ch

10、lH編碼鎂螯合酶大亞基。
　　 通過相同方法獲得了2272bp全長(zhǎng)的菊花FtsH cDNA序列，命名為CmFtsH。序列分析表明:該序列包含2094bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一條698個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。推測(cè)的蛋白大小與理論等電點(diǎn)分別為74.67kDa和5.99，在其5'端有一段長(zhǎng)度57個(gè)氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。多序列比對(duì)表明:CmFtsH具有保守的兩個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)(Walker-A，Walker-B)，以及推測(cè)AAA特征模

11、塊——第二同源區(qū)(SRH)，其C端包括了一個(gè)推測(cè)的Zn2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域HEXGH(X代表非保守氨基酸)。菊花CmFtsH與擬南芥12成員中可以引起黃葉突變的最為重要的兩個(gè)成員AtFtsH1和AtFtsH5親緣關(guān)系最近，分別具有82％與84％的同源性。這些結(jié)果表明:菊花FtsH編碼FtsH蛋白酶基因。
　　 4.組織特異性表達(dá)表明，CmChlH與CmFtsH在根、莖、葉和花中均有表達(dá)，其中在葉片中表達(dá)量最高，在莖中其次，在根與花中表

12、達(dá)較低。光抑制實(shí)驗(yàn)表明，給予一個(gè)較高光強(qiáng)的強(qiáng)光后，其綠葉組織的Fv/Fm減少了0.11，而黃葉組織的Fv/Fm減少了0.45;在其后的微光恢復(fù)過程中，綠葉組織可以恢復(fù)到接近原來的初始水平，而黃葉組織則無法恢復(fù)到原來的水平，甚至降低到一個(gè)較低的熒光值。在不同的光強(qiáng)處理下，在綠葉組織中，CmChlH的轉(zhuǎn)錄在10μmol/m2/s到450μmol/m2/s時(shí)不斷上升，在600μmol/m2/s光強(qiáng)下受到抑制，但在黃葉組織中，CmChlH的轉(zhuǎn)錄

13、則持續(xù)不斷上升，在600μmol/m2/s光強(qiáng)下則未受到抑制。當(dāng)置于黑暗中時(shí)，與光下對(duì)照相比，CmChlH在兩種類型葉片中的表達(dá)在早期均下調(diào)到一個(gè)較低的水平，然后保持在該水平，表明CmChlH受光誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。
　　 在綠葉組織中，CmFtsH的mRNA水平從10amol/m2/s到450μmol/m2/s時(shí)穩(wěn)步上升，在450μmol/m2/s光強(qiáng)下達(dá)到頂峰，然后在600μmol/m2/s光強(qiáng)下受到光抑制。在黃葉組織中，CmFtsH