巴西橡膠樹(shù)REF、RT和SRPP基因物理定位的研究.pdf

1、巴西橡膠(Hevea brasiliensis)是一種重要的產(chǎn)膠植物,其膠乳是目前工業(yè)用天然橡膠的唯一商業(yè)來(lái)源,是我國(guó)重要的戰(zhàn)略物資,也是熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物。前人已經(jīng)對(duì)橡膠樹(shù)產(chǎn)膠、抗逆性等相關(guān)性狀開(kāi)展了一系列研究,已從橡膠樹(shù)中克隆了40多種重要基因或cDNA片段,但是這些基因的染色體定位卻鮮見(jiàn)報(bào)道。基因的染色體定位對(duì)物理圖譜的繪制、遺傳連鎖群和特定染色體的對(duì)應(yīng)關(guān)系的建立、遺傳圖譜和物理圖譜的整合具有重要的意義。本研究采用原位

2、PCR技術(shù)對(duì)橡膠延長(zhǎng)因子(REF)基因和利用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)對(duì)橡膠轉(zhuǎn)移酶(RT)基因和小橡膠粒子蛋白(SRPP)基因進(jìn)行了物理定位的研究。主要結(jié)果如下:
　　 對(duì)橡膠樹(shù)葉片的染色體標(biāo)本制作方法進(jìn)行了探索,建立了適合橡膠樹(shù)葉片染色體標(biāo)本制備的一整套方法。
　　 通過(guò)對(duì)前人的原位PCR技術(shù)進(jìn)行改良,建立了適合巴西橡膠樹(shù)基因特異DNA片段定位的原位PCR方法。改良后的原位PCR技術(shù),具有背景低、假陽(yáng)性低的特點(diǎn)。

3、r>　　 首次建立了巴西橡膠樹(shù)單低拷貝基因的熒光原位雜交技術(shù)體系:雜交液總體積為20μl,各組分的終濃度為:50％去離子甲酰胺,10 ng/μl探針,10％硫酸葡聚糖,2×SSC,250 ng/μl鮭魚(yú)精DNA,0.5％SDS；操作流程為0.1 M HCl2 min→胃蛋白酶處理10 min→94℃水浴1 min→70％甲酰胺70℃變性2 min→乙醇脫水→雜交液變性、冰浴→共變性→雜交→信號(hào)檢測(cè)。
　　 利用改良后的橡膠樹(shù)原

4、位PCR技術(shù),首次對(duì)產(chǎn)膠相關(guān)基因REF基因進(jìn)行了染色體定位。在熱研7-33-97不同分裂時(shí)期的細(xì)胞中均擴(kuò)增到2個(gè)信號(hào),初步將REF基因定位于熱研7-33-97中期細(xì)胞第3號(hào)染色體長(zhǎng)臂上,信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離是34.51。
　　 構(gòu)建了橡膠樹(shù)的雙色熒光原位雜交技術(shù)體系,并用所構(gòu)建的技術(shù)將RT基因和SRPP基因同時(shí)定位到了熱研7-33-97的染色體上。其中RT基因被初步定位在熱研7-33-97第6號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上,信號(hào)位點(diǎn)到著