豬脂肪誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因FIT的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，動(dòng)物新品種的培育技術(shù)也得到了快速的發(fā)展，尋找有價(jià)值的分子標(biāo)記或主效基因作為分子標(biāo)記輔助選擇的基礎(chǔ)，結(jié)合傳統(tǒng)的表型性狀進(jìn)行選擇是目前豬遺傳改良工程所采用的主要方法之一。同時(shí)，科技的發(fā)展和人們生活水平的提高也使豬育種的目標(biāo)發(fā)生了變化，育種的重點(diǎn)也已由原來(lái)的降低背膘厚、提高生長(zhǎng)速度等轉(zhuǎn)變?yōu)樘岣呤萑饨M織的生長(zhǎng)效率、改良肉質(zhì)等各項(xiàng)指標(biāo)的改善。肌內(nèi)脂肪含量能直接影響豬肉的嫩度和風(fēng)味，脂肪性狀作為影響豬肉質(zhì)的主要指標(biāo)之一越來(lái)

2、越引起科學(xué)家們的關(guān)注，2009年啟動(dòng)的國(guó)家轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項(xiàng)就把培育高肌內(nèi)脂肪肉質(zhì)新品種豬種列為其中一個(gè)主要目標(biāo)。
　　 在人體中，脂滴(lipiddroplets)積累過(guò)量就會(huì)導(dǎo)致肥胖，而在所有的真核細(xì)胞生命中，從最簡(jiǎn)單的酵母到最復(fù)雜的人類，細(xì)胞內(nèi)脂滴儲(chǔ)存脂肪的能力都是最基本的過(guò)程，之前科學(xué)家已經(jīng)確定了很多負(fù)責(zé)合成脂肪的基因，但是控制將脂肪“打包”成脂滴的基因一直未被發(fā)現(xiàn)。07年12月17日出版的《PNAS》上，美國(guó)艾伯

3、特·愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院的DavidLSilver和同事發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)將脂肪打包成脂滴的關(guān)鍵基因，分別命名為FIT1和FIT2(fat-inducingtranscript,誘導(dǎo)脂肪轉(zhuǎn)錄基因)。文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法均證明FIT基因在人、小鼠和斑馬魚(yú)等生物中有重要功能，鑒于在豬中脂滴方面研究的不足，很有必要在豬中進(jìn)行該基因的研究，進(jìn)而了解脂滴的生物合成機(jī)制，探討瘦肉型豬和脂肪型豬差異形成的分子機(jī)理，為人類肥胖提供更細(xì)致的解釋，為從分子水平上選育

4、高瘦肉率且肉質(zhì)較好的豬種提供理論依據(jù)。
　　 本試驗(yàn)對(duì)FIT1和FIT2基因主要進(jìn)行了基因克隆及其遺傳效應(yīng)的研究。初步結(jié)果如下：
　　 1.充分利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和豬基因組計(jì)劃公布的數(shù)據(jù)，克隆鑒定了豬FIT1和FIT2基因的cDNA序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)兩基因均只由兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，豬FIT1基因編碼290個(gè)氨基酸，位于7號(hào)染色體，包含一個(gè)肌糖磷脂合成蛋白超家族結(jié)構(gòu)域，物種間同源性比較發(fā)現(xiàn)豬FI

5、T1編碼的氨基酸序列與人、牛、大鼠和小鼠有很高的相似性(＞93％)，且遺傳進(jìn)化關(guān)系和人的距離最近。FIT2基因編碼262個(gè)氨基酸，位于17號(hào)染色體。
　　 2.豬FIT2基因第二外顯子的559bp處存在T/C突變，引起內(nèi)切酶BcnI酶切位點(diǎn)的改變，利用PCR-BcnI-RFLP進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)在梅山豬中A等位基因點(diǎn)優(yōu)勢(shì)，大白豬中B等位基因占優(yōu)勢(shì)，但在170頭“大白×梅山”F2資源群體中進(jìn)行與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該突變

6、位點(diǎn)僅與肌肉pH值(SC)呈顯著相關(guān)(P＜0.05)，與肌肉pH值(BF)接近顯著相關(guān)，但是與其它性狀關(guān)聯(lián)不大。
　　 3.豬FIT1基因第一外顯子72bp處G/A突變，引起內(nèi)切酶FspBI酶切位點(diǎn)的改變，利用PCR-FspBI-RFLP進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)在梅山豬中A等位基因占優(yōu)勢(shì)，大白豬中B等位基因占優(yōu)勢(shì)，在279頭“大白×梅山”F2資源群體中進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析表明，該突變位點(diǎn)對(duì)骨率、肥肉率、臀部平均膘厚、肋骨數(shù)、板油重的效應(yīng)

7、達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)；對(duì)皮率、平均背膘厚的效應(yīng)達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。
　　 4.在豬FIT1基因第二外顯子590-595bp處存在CACTCC的插入和缺失，在梅山豬中為插入型，在大白豬中為缺失型，而且在該突變前9個(gè)堿基，即581bp處存在C/A突變，共引起3個(gè)氨基酸的改變，利用直接測(cè)序和PCR-SSCP方法證明兩位點(diǎn)連鎖，用PCR-SSCP進(jìn)行基因型分析發(fā)現(xiàn)梅山豬中C等位基因占優(yōu)勢(shì)，大白豬中D等位基因占優(yōu)勢(shì)，在

8、314頭“大白×梅山”F2資源群體中進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析，表明該位點(diǎn)與肥肉率、6-7腰椎間膘厚、臀部平均膘厚、板油重、內(nèi)脂合計(jì)、內(nèi)脂率(％)等脂肪沉積性狀的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。
　　 5.獲得FIT1基因的啟動(dòng)子序列，利用CPGPLOT，NNPP,SignalScan,MotifFinder及TFSEARCH等在線軟件預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的順式元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測(cè)僅發(fā)現(xiàn)一處可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，即位于ATG上游-310

9、bp處的C，且分值較高，為0.91。同時(shí)該段序列還具備啟動(dòng)子的一些特征元件，如帽子信號(hào)，TATAbox，CCAATbox等，另外還有促使脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子C/EBP和與調(diào)控成肌細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MyoD的結(jié)合位點(diǎn)。
　　 6.利用RT-PCR技術(shù)對(duì)FIT1和FIT2基因進(jìn)行了不同組織的表達(dá)譜分析。表達(dá)譜顯示兩基因在肌肉和心臟中均高表達(dá)，總體趨勢(shì)是FIT1基因只在特異組織中表達(dá)，而FIT2基因在多數(shù)組織中均有表達(dá)。