松材線蟲低溫冷凍保存的研究.pdf

1、松材線蟲的低溫冷凍保存能夠充分利用并收集各種來源的松材線蟲，可為松材線蟲的致病機理和生物防治技術的研究和應用提供大量實驗材料，并且不受時間和空間的限制。目前，國內(nèi)還沒有關于松材線蟲低溫冷凍保存的成功報道，國外關于這方面的報道也很少，尚缺乏系統(tǒng)的研究。本試驗研究了松材線蟲冷凍保存過程中冷凍方法、冷凍保護劑種類和濃度、預處理時間、解凍方式以及冷凍時間對冷凍保存效果的影響，結(jié)果如下：
　　 1.為了篩選玻璃化冷凍保護劑，將EG、GL和

2、、DMSO三種冷凍保護劑和無菌水按照不同比例配制成6種玻璃化保護液，比較不同玻璃化保護液對線蟲的毒性作用與冷凍效果。試驗結(jié)果表明，單一的EG或GL的冷凍效果顯著優(yōu)于GL+EG混合液(P＜0.05)，前兩者之間的差異不顯著(P＞0.05)，單一的EG或GL作為冷凍保護劑效果最好。
　　 2.在上述試驗的基礎上，以低濃度EG和GL為預處理液，比較不同預處理液濃度對松材線蟲冷凍效果的影響，以沒有經(jīng)過預處理的松材線蟲作為對照。結(jié)果表明，

3、GL作為預處理劑的冷凍效果顯著高于EG(P＜0.05);經(jīng)過5％GL預處理的線蟲存活率最高，為36.5％，相比其他試驗組的冷凍效果顯著較好(P＜0.05)。
　　 3.通過1h、2h、3h、4h和5h的平衡時間對松材線蟲進行冷凍，比較比較不同平衡時間對松材線蟲冷凍效果的影響，結(jié)果表明，平衡2h和3h的線蟲凍后存活率最高，分別達到32.1％和32.6％，顯著高于1h、4h和5h(P＜0.05)。由此推斷，線蟲平衡2-3h后進行冷凍

4、，冷凍效果最好。
　　 4.將GL用無菌水分別配置成30％,40％,50％和60％系列濃度溶液，比較不同濃度冷凍保護劑對松材線蟲冷凍效果的影響，結(jié)果表明，GL濃度為20％、25％時對松材線蟲的冷凍效果最好，存活率為35.6％和36.2％，顯著高于其它的濃度(P＜0.05)。在上述試驗的基礎上分別添加不同濃度的蔗糖或海藻糖進行冷凍保存，研究非滲透性保護劑對松材線蟲冷凍效果的影響，結(jié)果表明，添加同一濃度的海藻糖或蔗糖，冷凍后的線蟲存

5、活率差異不顯著(P＞0.05)；添加0.25M的蔗糖或海藻糖進行冷凍，與其他試驗組相比，冷凍效果顯著較好最好(P＜0.05)。
　　 5.以不同的解凍溫度20℃，30℃，40℃，50℃和60℃對冷凍24h的線蟲分別進行水浴解凍和干熱解凍，比較不同解凍方式和解凍溫度對松材線蟲冷凍效果的影響，結(jié)果表明，干解凍的方式明顯不能用于線蟲的冷凍保存；水浴解凍溫度為40℃時，線蟲的凍后活率達到42.2％，顯著高于其他試驗組(P＜0.05);<

6、br>　　 6.在玻璃化冷凍保存的基礎上，設計了7組降溫程序，采用程序化冷凍法對松材線蟲進行冷凍，篩選最合適的降溫程序。結(jié)果表明，采用降溫程序5（在4℃以1℃/min的速率降溫至-6℃，再以20℃/min的速率降溫至-40℃，然后以10℃/min的速率升溫至-20℃，最后以1℃/min的速率降溫至-45℃，迅速投入液氮）的凍后線蟲活率達到41.1％,顯著高于其他降溫程序(P＜0.05)。
　　 7.以低濃度的GL、EG及二者的

7、組合為冷凍保護劑，并添加0.25M的蔗糖進行程序化冷凍保存，篩選最適的程序化冷凍保護劑。試驗結(jié)果表明，10％-15％GL作為程序化冷凍保護劑的冷凍效果最好，凍后存活率分別為50.9％和49.6％，二者差異不顯著(P＞0.05)。
　　 8.分別采用玻璃化冷凍法和程序化冷凍法對松材線蟲進行冷凍保存，比較不同株系線蟲的冷凍效果及冷凍后的繁殖情況，結(jié)果表明，不同株系間的冷凍效果差異不顯著(P＞0.05)；程序化冷凍松材線蟲幼蟲的冷凍效