烯酰嗎啉對荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)的生物活性及其抗性研究.pdf

1、荔枝霜疫霉病是我國荔枝上最嚴(yán)重的卵菌病害，常常造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。除了利用抗病品種和加強栽培管理以外，化學(xué)藥劑是防治該病害最為有效的措施。烯酰嗎啉是一種羧酸酰胺類(CAA)化學(xué)殺菌劑，它對霜霉屬和疫霉屬的真菌有很強的活性，在全球范圍內(nèi)被用來防治多種霜霉和疫霉病害。除游動孢子形成及孢子游動期外，對卵菌生活史的各個階段均有作用。該藥劑內(nèi)吸性強，對植株具有很好的保護、治療活性，也具有良好的持效期，于上世紀(jì)90年代中期開始用于中國黃瓜霜霉病和荔

2、枝霜疫霉病的防治。目前，它對荔枝霜疫霉的研究還是空白。本文以傳統(tǒng)和新型的殺卵菌劑為對照藥劑，系統(tǒng)研究了烯酰嗎啉對荔枝霜疫霉病菌室內(nèi)、外的生物活性;建立了該藥劑對該病菌的敏感性基線，并根據(jù)基線系統(tǒng)地監(jiān)測了2007-2008年荔枝霜疫霉病原菌群體對烯酰嗎啉的敏感性;室內(nèi)誘導(dǎo)了荔枝霜疫霉病菌羧酸酰胺類殺菌劑烯酰嗎啉的抗藥性突變體，并對其生物學(xué)習(xí)性進(jìn)行了研究;克隆了敏感和抗性菌株的膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，并進(jìn)行了基因序列的比對分析，以探究烯酰嗎啉的

3、抗藥性機理。
　　 由荔枝霜疫霉病菌引起的荔枝霜疫霉病是我國荔枝上具有嚴(yán)重破壞性重要的病害之一。本文首先詳細(xì)地研究了烯酰嗎啉、嘧菌酯、惡唑菌酮、甲霜靈、霜脲氰及代森錳鋅6種不同類型的殺菌劑對荔枝霜疫霉病菌菌絲生長、孢子囊產(chǎn)量、游動孢子的釋放、孢子囊的直接萌發(fā)及休止孢的萌發(fā)的生物活性。結(jié)果表明烯酰嗎啉和甲霜靈對菌絲生長具有強烈的抑制作用，其次為代森錳鋅，嘧菌酯、惡唑菌酮和霜脲氰的活性最低;烯酰嗎啉和甲霜靈對孢子囊的形成也具有很高的

4、活性，其抑制作用顯著高于其它類藥劑;游動孢子的釋放對嘧菌酯和惡唑菌酮最為敏感，其次為代森錳鋅，而烯酰嗎啉、甲霜靈和霜脲氰對其沒有抑制作用;孢子囊的直接萌發(fā)對嘧菌酯和惡唑菌酮最為敏感，其次為烯酰嗎啉和代森錳鋅，而甲霜靈和霜脲氰對此階段沒有活性;休止孢的萌發(fā)對嘧菌酯和惡唑菌酮也最為敏感，其次為烯酰嗎啉，代森錳鋅的活性稍低，而甲霜靈和霜脲氰均不影響其萌發(fā)。首次對荔枝霜疫霉不同無性階段的生物活性進(jìn)行了研究，為荔枝霜霉病的化學(xué)防治提供了理論基礎(chǔ)。

5、
　　 其次，本文以荔枝果實和葉片作為實驗材料，以常用的代森錳鋅、霜脲氰和甲霜靈為對照藥劑，研究了新型殺卵菌劑烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、氟嗎啉、丁吡嗎啉、嘧菌酯和惡唑菌酮對荔枝霜疫霉病活體上的生物活性。結(jié)果表明該病原菌在荔枝果實上的致病力顯著強于葉片上，而選擇成熟的果實進(jìn)行活性測定。接菌前24 h用藥劑處理，所有藥劑對該病害在果實上的抑制作用都隨著藥劑濃度的增加而逐漸增強。雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉、氟嗎啉和甲霜靈的抑制作用最強，其EC5

6、0和EC90值分別為1.04、2.91、2.67、2.46 mg L-1，和5.0、8.63、8.58、6.72 mg L-1;其次為甲氧基丙烯酸酯類的嘧菌酯和惡唑菌酮，及霜脲氰，其EC50值的范圍為19.48-31.84 mg L-1;效果最差的為丁吡嗎啉和代森錳鋅，其EC50值分別為125.8和＞800 mg L-1。雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉、氟嗎啉和甲霜靈在25 mg L-1時均可以完全抑制荔枝霜疫霉病菌的侵染，然而其它藥劑在最高劑量

7、200 mg L-1時卻不能完全抑制該病的擴展。
　　 本文進(jìn)一步研究了四株荔枝霜疫霉菌株在不同無性階段對四種羧酸類殺菌劑（烯酰嗎啉、氟嗎啉、丁吡嗎啉、雙炔酰菌胺）的敏感性。結(jié)果表明四種藥劑都不影響霜疫霉游動孢子的釋放;但都強烈的抑制菌絲的生長、孢子囊的產(chǎn)量、休止孢和孢子囊的萌發(fā)。四種藥劑對各個階段的平均抑制中濃度(EC50值)分別為0.075、0.258、0.115、0.0048 mg L-1,0.085、0.315、0.15

8、0、0.0032 mg L-1,0.140、0.150、0.645、0.0023 mgL-1，0.203、0.5、0.743、0.0061 mg L-1。同其它無性階段相比，菌絲生長對烯酰嗎啉和丁吡嗎啉最為敏感，因此菌絲生長速率法作為敏感性基線的研究方法。2007年從中國福建、廣東和廣西三省共采集131株荔枝霜疫霉菌株，其中127、116、113和100株分別用來建立荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉、氟嗎啉、丁吡嗎啉和雙炔酰菌胺的敏感性基線。結(jié)果表

9、明不同省的菌株對四種藥劑具有相似的敏感性;荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉、氟嗎啉、丁吡嗎啉和雙炔酰菌胺的敏感性均成單峰曲線，其平均EC50值分別為0.082(±0.01)、0.282(±0.047)、0.115(±0.032)和0.0055(±0.0012) mg L-1。本結(jié)論將對以后荔枝霜疫霉病對這四種羧酸類殺菌劑的敏感性變化研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 LBA平板上菌絲生長速率法測得荔枝霜疫霉病菌對烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性基線的平均值分

10、別為0.082(±0.01)，0.081(±0.045) mg L-1，本文以此基礎(chǔ)監(jiān)測了2007-2008年我國南方主要荔枝產(chǎn)區(qū)荔枝霜疫霉病菌對烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性。分別于2007和2008年從廣西、廣東、福建、及海南4省共采集分離得到118和397株菌株。以0.25 mg L-1烯酰嗎啉和1 mgL-1甲霜靈作為區(qū)分劑量，對所采集菌株進(jìn)行抗藥性監(jiān)測。結(jié)果表明，兩年所采集的515株荔枝霜疫霉菌株均對這兩種藥劑均為敏感，沒有檢測到任

11、何抗藥性菌株。因此，烯酰嗎啉和甲霜靈在我國荔枝上使用10多年后，仍可作為荔枝霜疫霉病的主要防治藥劑。
　　 通過對荔枝霜疫霉菌在室內(nèi)含藥平板上兩步藥劑馴服，獲得了四株羧酸酰胺類殺菌劑烯酰嗎啉抗藥性突變體。其中，第一步誘得兩株抗性穩(wěn)定的菌株，抗性倍數(shù)分別為14.65和2158，誘導(dǎo)率為0.926％;第二步馴服是將第一步獲得低抗菌株繼續(xù)在20 mgL-1烯酰嗎啉馴服，得兩株抗性倍數(shù)分別為141.09和24.4的菌株，誘導(dǎo)率為1％。室

12、內(nèi)毒力測定表明四突變體均降低了對CAA類殺菌劑的敏感性。烯酰嗎啉同雙炔酰菌胺、氟嗎啉及丁吡嗎啉間存在正交互抗性，且除雙炔酰菌胺外的其余三藥劑交互抗性倍數(shù)基本一致;而與甲氧基丙烯酸酯類嘧菌酯和惡唑菌酮、苯基酰胺類甲霜靈、乙酰胺類霜脲氰、及保護性的代森錳鋅間均不存在交互抗性。適合度研究表明抗藥性突變體具有同敏感菌株同樣的溫度適應(yīng)能力;其游動孢子形成的能力變?nèi)?休止孢萌發(fā)和孢子囊的直接萌發(fā)能力同敏感菌株一樣或稍微有所降低;部分突變體菌絲生長速

13、度增強而產(chǎn)孢量（離體和活體上）和致病力均減弱，部分突變體的產(chǎn)孢能力（離體和活體上）不變而菌絲生長速度和致病力均減弱;在無藥平板上連續(xù)培養(yǎng)11代后，第一步誘得的2抗性菌株對烯酰嗎啉的敏感性穩(wěn)定，第二步誘得的突變體敏感性增強。本研究表明荔枝霜疫霉對羧酸酰胺類殺菌劑的抗性風(fēng)險水平較低，也是荔枝霜疫霉病菌不同抗藥性水平的首次報道。
　　 據(jù)報道羧酸酰胺類殺菌劑通過作用于膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶來抑制卵磷脂的生物合成。本文最后克隆了荔枝霜疫霉病菌羧