煙草突變體創(chuàng)制及其表型鑒定.pdf

1、創(chuàng)制突變體是作物功能基因克隆和品種選育的重要途徑。本研究針對煙草紅花大金元和珊西兩個品種為實(shí)驗(yàn)材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA插入和輻射誘變方法進(jìn)行了煙草突變體創(chuàng)制和表型鑒定。獲得如下主要結(jié)果：
　　 1、轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化：農(nóng)桿菌介導(dǎo)用含有抗潮霉素的Hpt基因的二元載體pCMI8將干擾RNA表達(dá)基因M8導(dǎo)入煙草葉片外植體中，然后在含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測鑒定，借以初步探討干擾RNA表達(dá)

2、基因M8在植物中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)情況，結(jié)果表明，干擾RNA表達(dá)基因M8已整合到煙草的基因組中。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，對受體再生系統(tǒng)建立進(jìn)行了研究，篩選出有利于受體材料的高效培養(yǎng)基配方，最終確定出有利于葉片愈傷誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為：MS+6-BAlmg/L+NAA0.1mg/L；有利于芽分化的培養(yǎng)基為：MS+NAA0.2mg/L。隨后通過外植體材料生長狀態(tài)、Hpt敏感性、預(yù)培養(yǎng)時間、農(nóng)桿菌濃度、浸染時間、共培養(yǎng)時間等對轉(zhuǎn)化的影響研究，建立和優(yōu)化了轉(zhuǎn)化體

3、系。總體來講，在附加3％蔗糖的MS培養(yǎng)基上生長的組培苗葉片為最佳外植體，在搖菌過程中，使用50mg/L Kan進(jìn)行陽性菌株的篩選以及50mg/LRif進(jìn)行抑菌比較適合，在愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生到轉(zhuǎn)化苗出芽生根培養(yǎng)過程中，使用25mg/L Hpt進(jìn)行陽性植株篩選以及250 mg/LCarb進(jìn)行抑菌比較適合。25℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2天，抗性愈傷誘導(dǎo)效果最好；農(nóng)桿菌濃度在OD600為0.4-0.6，侵染時間為8-10min時，抗性愈傷生長狀態(tài)最好。

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　　 2、T-DNA插入突變體：獲得轉(zhuǎn)基因植株9株，表型較野生型有顯著的變異。株型十分緊湊，節(jié)間變窄，莖稈粗壯變短。葉肉細(xì)胞增多，葉片變厚，顏色深綠，枝葉茂盛。在花期之前會分化長出2-3個頂芽，在沒打頂?shù)那闆r下會自然長出很多側(cè)芽。
　　 3、輻射誘變突變體：用劑量為400Gy60Coγ射線輻照處理煙草紅花大金元種子，將處理后的種子種于大田，鑒定后代植株性狀的變異。試驗(yàn)研究結(jié)果表明：M0代在種子出苗率、植株葉片性狀(葉色