棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及突變體的創(chuàng)制.pdf

1、棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，利用遺傳工程技術(shù)改良棉花品種能夠提高棉花的種植效益。然而目前棉花的生物技術(shù)的發(fā)展仍然存在著很多障礙，主要表現(xiàn)在棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生對(duì)基因型依賴性很強(qiáng)、周期長、導(dǎo)致再生植株的體細(xì)胞變異很嚴(yán)重；棉花遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的復(fù)雜性(難重復(fù)、轉(zhuǎn)化率低)和轉(zhuǎn)基因棉花的農(nóng)藝性狀的變異等等，這些問題已經(jīng)成為棉花生物技術(shù)、棉花功能基因的驗(yàn)證和棉花相關(guān)基因克隆等研究領(lǐng)域的瓶頸。本研究內(nèi)容主要涉及棉花高體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力基因型的篩選、棉花體細(xì)胞無

2、性系變異研究、高效棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，棉花胚芽為轉(zhuǎn)化受體的新的轉(zhuǎn)化方法以及一個(gè)小型的promoter-trap插入突變體庫的建立，旨在為轉(zhuǎn)基因棉花育種、功能基因組研究提供理論指導(dǎo)。主要研究結(jié)果如下： 1對(duì)三十個(gè)優(yōu)良棉花基因型進(jìn)行離體培養(yǎng)，系統(tǒng)地比較了它們的體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力。篩選到兩個(gè)體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力明顯高于珂字棉的基因型一‘豫668’和‘豫早1號(hào)’，這兩個(gè)基因型能夠在兩個(gè)月內(nèi)獲得高頻率的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，為棉花的遺傳工程的

3、發(fā)展拓寬了受體范圍。 2棉花體細(xì)胞無性系變異的研究。利用細(xì)胞學(xué)壓片、流式細(xì)胞儀檢測及RAPD技術(shù)對(duì)棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲得的再生植株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估，研究發(fā)現(xiàn)隨機(jī)挑選的14個(gè)再生植株的DNA倍性、染色體數(shù)目沒有發(fā)生變異，而利用187條RAFD引物對(duì)再生植株進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)50％再生植株(14株中的7株)存在RAPD擴(kuò)增多態(tài)性，這意味著細(xì)胞學(xué)水平的遺傳變異與DNA水平的遺傳變異沒有必然聯(lián)系。在國際上首次利用RAPD和SSR技術(shù)對(duì)2

4、，4-D+KT和IBA+KT這兩種激素組合誘導(dǎo)的胚性愈傷的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測。發(fā)現(xiàn)兩者誘導(dǎo)的胚性愈傷組織胚胎發(fā)生能力沒有明顯差異，但2，4-D+KT組合誘導(dǎo)到的胚性愈傷組織在DNA水平上的變異程度要比IBA+KT組合誘導(dǎo)的胚性愈傷組織高。 3農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花胚性愈傷轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及以GFP為報(bào)告基因?qū)γ藁ㄏ屡咻S遺傳轉(zhuǎn)化的觀察。 預(yù)培養(yǎng)15 d的棉花胚性愈傷組織是較好遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，對(duì)轉(zhuǎn)化的影響因子進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果

5、表明利用OD值為0.5的農(nóng)桿菌菌液，在共培培養(yǎng)基中加入50mg／L的乙酰丁香酮，19℃下，暗培養(yǎng)48小時(shí)，用100 mg／l的卡那霉素進(jìn)行選擇，400 mg／l的頭孢霉素抑制農(nóng)桿菌的生長能夠獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。利用這些參數(shù)轉(zhuǎn)化能夠使胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化率達(dá)到15.0％左右。 為了克服棉花轉(zhuǎn)基因植株移栽困難的不利影響，建立了一種新的試管苗嫁接移栽技術(shù)。以棉花去殼種子消毒后在培養(yǎng)基中萌發(fā)的無菌苗作為砧木，在無菌條件下，將轉(zhuǎn)基因頂芽，或者

6、側(cè)芽，嫁接到無菌苗的下胚軸上，在試管內(nèi)萌發(fā)新根和新葉，然后逐步移栽到大田中，這種試管內(nèi)嫁接的技術(shù)有效地避免了環(huán)境因子對(duì)試管苗嫁接成活的影響，將轉(zhuǎn)基因試管苗的移栽存活率提高到90％以上，同時(shí)將移栽時(shí)間縮短到20 d左右。 以GFP為報(bào)告基因研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化的整個(gè)過程，發(fā)現(xiàn)GFP瞬時(shí)表達(dá)主要發(fā)生在下胚軸切口處的初生維管組織中，表皮細(xì)胞也有表這，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在切口處初生維管組織中，表皮細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的頻率極低。G

7、FP瞬時(shí)表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)率是有關(guān)聯(lián)但不等同的兩個(gè)事件，在提高報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)率的同時(shí)，盡量減少農(nóng)桿菌對(duì)外植體的毒害，才能真正提高轉(zhuǎn)化效率?？剐杂鷤M織絕大多數(shù)是由轉(zhuǎn)化的和非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞構(gòu)成的嵌合體，在誘導(dǎo)的前兩個(gè)月左右，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞團(tuán)和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞團(tuán)增殖速度都很慢，兩個(gè)月后，部分轉(zhuǎn)化細(xì)胞團(tuán)，呈現(xiàn)爆發(fā)式增長，直到分化。不同基因型材料的遺傳轉(zhuǎn)化特性有一定差異，轉(zhuǎn)化的愈傷組織需要在高激素濃度的條件下才能夠分化。 4 新的轉(zhuǎn)化方法的探討

8、 利用萌發(fā)24 h的棉花種子的胚芽，作為轉(zhuǎn)化受體材料，進(jìn)行超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化處理，能夠?qū)FP基因在胚芽的瞬時(shí)表達(dá)率提高100多倍，利用這種技術(shù)，獲得了兩個(gè)轉(zhuǎn)抗蟲基因的抗性植株。 5 promoter-trapping突變?nèi)后w的初步研究。 通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花胚性愈傷組織，在國際上首次利用T-DNA將promoter-trapping系統(tǒng)導(dǎo)入棉花基因組，獲得了713個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子。GUS染色發(fā)現(xiàn)，報(bào)告基因G