陸地棉花粉氮離子注入誘變效應(yīng)及機(jī)理研究.pdf

1、離子束生物工程技術(shù)是一種新的生物技術(shù),它通過(guò)離子束注入生物細(xì)胞,來(lái)研究其生物學(xué)效應(yīng)和作用機(jī)理,用于誘變育種和基因工程等方面。1986年首次將離子束注入技術(shù)應(yīng)用于誘變育種,通過(guò)離子束注入誘變,在多種植物、微生物中已獲得各種不同類型的突變體。但是,離子注入對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)理尚不清楚,離子的穿透能力很弱,離子能否進(jìn)入生物細(xì)胞及誘發(fā)基因發(fā)生突變?nèi)匀皇怯袪?zhēng)議的問(wèn)題。本文主要研究氮離子束注入棉花花粉引起的生物學(xué)效應(yīng)。 本研究采用能量為20ke

2、V的低能氮離子,分別以不同劑量(100單位(0.26×1016N+/Cm2、150單位(0.39×1016 N+/cm2)、200單位(0.52×1016 N+/cm2)、300單位(0.78 ×1016N+/cm2))的氮離子注入陸地棉(Gossypium hirsutum)品種蘇棉12號(hào)的成熟花粉,用處理花粉授粉,收獲種子。對(duì)處理花粉的活力、花粉表面結(jié)構(gòu)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化、花粉萌發(fā)率、花粉管在花柱中的生長(zhǎng)速度、受精情況等進(jìn)行系統(tǒng)分析。

3、用SSR分子標(biāo)記的方法檢測(cè)了離子注入花粉對(duì)于授粉后胚珠DNA變異的程度,用抑制性消減雜交法分析離子注入花粉授粉后代的基因表達(dá)差異。并分析離子注入花粉授粉后的農(nóng)藝形狀變異。主要結(jié)果如下。 用花粉原位萌發(fā)法、聯(lián)苯胺-甲萘酚染色法、花粉管快速萌發(fā)法、FDA法(熒光素二醋酸脂法)、TTC(2,3,5-氯代三苯基四氮唑)染色法、離體萌發(fā)法等6種方法分別測(cè)定對(duì)照花粉、抽真空處理花粉及N+注入后的棉花花粉活力。TTC染色法不能有效檢測(cè)自然花粉

4、及N+注入后的花粉的活力,測(cè)定結(jié)果均為0％。除了TTC染色法外,其它5種方法均能測(cè)定自然花粉的活力,測(cè)定結(jié)果均為98％左右.花粉管快速萌發(fā)法不能準(zhǔn)確測(cè)定經(jīng)抽真空處理后的花粉的活力。抽真空處理對(duì)花粉的活力無(wú)明顯影響。聯(lián)苯胺-甲萘酚染色法、花粉管快速萌發(fā)法、TTC染色法、離體萌發(fā)法等4種方法均不能用來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定N+注入后的棉花花粉活力。FDA熒光染色法測(cè)定的花粉活力結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性好,與原位萌發(fā)法測(cè)定的結(jié)果一致,是快速測(cè)定經(jīng)N+注入處理后的棉

5、花花粉活力的簡(jiǎn)便方法。N+注入花粉后,隨著離子注入劑量的增加,花粉活力呈明顯下降趨勢(shì)。 通過(guò)熒光顯微鏡觀察棉花花粉活體原位萌發(fā)(柱頭上萌發(fā))和離體條件下的原位萌發(fā)狀況,建立準(zhǔn)確的觀察花粉粒在柱頭上的萌發(fā)和花柱中花粉管的生長(zhǎng)狀況的簡(jiǎn)便的方法,并找出棉花花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)溫度。結(jié)果表明：花粉在原位和離體情況下的原位萌發(fā)時(shí)間是基本一致的?；铙w原位萌發(fā)在授粉1 h后極個(gè)別的花粉粒開(kāi)始萌發(fā),4 h后柱頭上的花粉粒全部萌發(fā)。12 h后大量的

6、花粉管生長(zhǎng)至花柱基部；離體原位萌發(fā)在授粉2 h后開(kāi)始有花粉粒萌發(fā),13 h后大量的花粉管長(zhǎng)至花柱基部。授粉后,活體原位萌發(fā)較原位萌發(fā)晚1h。此外,在花粉管生長(zhǎng)的同時(shí),花柱也在生長(zhǎng)?；ǚ勖劝l(fā)的合適培養(yǎng)溫度為25～35℃。而在培養(yǎng)溫度為30℃時(shí),花柱中花粉管數(shù)量最多。通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡、原位萌發(fā)和石蠟切片等方法觀察了N+注入棉花花粉后產(chǎn)生的各種變化,初步研究了不同劑量的N+注入棉花花粉的誘變機(jī)理及誘競(jìng)舌產(chǎn)生的一系列生物學(xué)效應(yīng).結(jié)果表明：

7、隨著離子注入劑量的增大,離子注入使表面結(jié)構(gòu)破損的花粉粒的數(shù)量逐漸增加,離子注入對(duì)于花粉表面有明顯的刻蝕作用,可產(chǎn)生不同大小和深度的孔洞和裂縫；花粉粒內(nèi)涵物的量逐漸減少,排列致密性降低；離子注入劑量越高,花粉粒內(nèi)部出現(xiàn)的空隙越多,造粉質(zhì)體的體積變大,數(shù)量也越多；離子注入會(huì)明顯降低花粉的萌發(fā)率；N+注入花粉授粉后,花柱中花粉管的數(shù)量明顯下降,注入劑量愈大,花柱中花粉管的數(shù)量愈少,對(duì)照花粉授粉后花粉管的數(shù)量為：320±42條,劑量為100單位

8、、150單位、200單位爭(zhēng)300單位的N離子注入花粉后,花粉管的數(shù)量分別為：145±19.8、114±12.7、94±11.4和51.3±11條。 離子注入不影響授粉后雌雄配子受精。不同處理的花粉管生長(zhǎng)速度是一致的,授粉后13小時(shí),花粉管都能生長(zhǎng)至花柱基部。不同劑量處理的花粉粒萌發(fā)后的受精時(shí)間是一致的。N+注入花粉授粉后,對(duì)子房的生長(zhǎng)有明顯的影響,子房重量和直徑都隨注入劑的增加而降低。劑量為100單位、200單位和300單位的N

9、+注入花粉授粉后,SSR分子標(biāo)記結(jié)果表明,胚珠的DNA多態(tài)性發(fā)生一定程度的改變。劑量為300單位的N+注入花粉授粉后,SSH分析獲得1個(gè)與已知功能基因同源序列,與EST庫(kù)中的序列同源的4條EST序列。離子注入花粉授粉后成鈴率降低,對(duì)M1代農(nóng)藝形狀也產(chǎn)生變異,但變異程度是隨機(jī)的,與離子注入劑量之間無(wú)一定的規(guī)律.本研究結(jié)果充分說(shuō)明N+注入花粉,會(huì)通過(guò)刻蝕作用進(jìn)入細(xì)胞使細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì),降低花粉的活力,降低子房的生長(zhǎng)速度