N+、α粒子、60Co-γ對(duì)陸地棉花粉的誘變效應(yīng)研究及誘變后代鑒定.pdf

1、誘變是棉花育種中創(chuàng)造變異的重要手段之一。棉花輻射誘變一般以種子為材料,但輻照種子長(zhǎng)成的M1植株易出現(xiàn)嵌合體。花粉中含有精細(xì)胞,對(duì)輻射誘變敏感,突變的精細(xì)胞可通過(guò)受精遺傳給后代,有助于提高選擇效率和加速輻射育種進(jìn)程。此外,輻照花粉也是創(chuàng)造非整倍體等遺傳材料的有效方法。60Co-γ射線是棉花育種中應(yīng)用最為廣泛的誘變手段。離子束注入技術(shù)在植物、微生物誘變研究方面已取得豐碩成果。但是由于離子束穿透能力很弱,它能否進(jìn)入細(xì)胞,一直存在爭(zhēng)議.而且低能

2、離子與生物體的相互作用涉及復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng),離子注入后對(duì)植物細(xì)胞的直接損傷及誘變效應(yīng)方面的機(jī)理研究還很缺乏。α粒子屬于直接電離粒子,具有較高的傳能線密度,能引發(fā)細(xì)胞之間的輻射信號(hào)傳導(dǎo)及其細(xì)胞間旁效應(yīng)的產(chǎn)生。由于α粒子的穿透力較弱,α粒子的輻射生物學(xué)研究多集中在哺乳動(dòng)物細(xì)胞方面,在植物上研究α粒子的生物效應(yīng)尚少有報(bào)道,尚不清楚它是否能作為一種有效的植物誘變?cè)础１狙芯恳躁懙孛逓椴牧?分別用N+、α粒子和60Co-γ射線作為輻射源,從花粉粒表

3、面結(jié)構(gòu)、內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)、花粉粒萌發(fā)率、授粉后萌發(fā)花粉管的數(shù)量和長(zhǎng)度、花粉管微絲骨架、花粉管Ca2+濃度梯度以及N+注入后引起M1代DNA和RNA水平上的變異等方面研究N+、α粒子及60Co-γ射線輻射對(duì)花粉粒的誘變生物學(xué)效應(yīng),比較三種誘變?cè)吹恼T變機(jī)理,為棉花誘變育種提供了新的方法.對(duì)60Co-γ射線誘變花粉后代的主要農(nóng)藝性狀的變異規(guī)律進(jìn)行了研究,豐富了花粉誘變育種技術(shù).研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.棉花雄性配子體發(fā)生和發(fā)育的檢測(cè)

4、方法
　　 將熒光染料DAPI染色DNA、羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色花粉管微絲、Fluo-3am染色花粉管中Ca2+、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡等方法應(yīng)用到檢測(cè)棉花雄性配子體的發(fā)生發(fā)育過(guò)程,發(fā)現(xiàn)陸地棉花蕾的大小與花粉母細(xì)胞及雄配子體的發(fā)育程度步,同時(shí)存在單核花粉粒、雙核花粉粒和三核花粉粒等三種不同類型的花粉粒；陸地棉花粉管內(nèi)微絲主要以微絲束的方式沿花粉管連續(xù)縱向排列,花粉管頂端10-20μm的區(qū)域內(nèi),不存在微絲網(wǎng)絡(luò)；花粉管內(nèi)

5、的游離Ca2+呈現(xiàn)頂端Ca2+濃度較近頂端高的極性分布。研究的方法和結(jié)果為開展與棉花花粉粒有關(guān)的生殖生物學(xué)研究提供了途徑和依據(jù)。
　　 2.N+、α粒子和60Co—γ對(duì)陸地棉花粉的誘變效應(yīng)研究及誘變后代鑒定
　　 2.1 以10、20和30 keV的N+注入陸地棉花粉粒。發(fā)現(xiàn)N+通過(guò)刻蝕方式作用于花粉粒,對(duì)花粉內(nèi)部結(jié)構(gòu)、花粉活力以及花粉管的微絲骨架結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生程度不同的影響,影響程度與注入能量有關(guān),能量越大,對(duì)花粉的損傷效

6、應(yīng)越明顯。
　　 2.2 通過(guò)對(duì)20 keV的N+注入后的花粉授粉后發(fā)育的M1(胚珠)DNA的SSR標(biāo)記分析,在DNA水平上檢測(cè)N+誘變后的多態(tài)性變化,結(jié)果表明,N+注入陸地棉花粉后再給雌蕊授粉,在一定程度上改變了花粉中精細(xì)胞的DNA序列,會(huì)對(duì)胚珠的DNA多態(tài)性產(chǎn)生影響。說(shuō)明N+注入花粉,能產(chǎn)生可遺傳的變異；通過(guò)抑制消減雜交技術(shù),獲得20 keV的N+誘變陸地棉花粉后M1代特異表達(dá)的cDNA片段,在mRNA水平上檢測(cè)N+的誘變效

7、應(yīng)。已測(cè)序的有50個(gè)縮減cDNA克隆中,52％的序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中都有同源的棉屬來(lái)源的EST。38個(gè)EST與其他物種已知基因部分區(qū)域的同源性為56％-100％,占總EST的76％；5條EST序列能在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到同源性序列,但其功能尚不清楚；9個(gè)EST能在數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)為推測(cè)蛋白；4個(gè)EST在GenBank中沒有查到對(duì)應(yīng)的同源序列(序列號(hào)分別為:GH291233；GH291234；GH291235和GH291236).
　　 2.3

8、以陸地棉花粉為材料,研究不同注入機(jī)各參數(shù)(離子能量、總劑量、劑量率、脈沖劑量、間隔時(shí)間)對(duì)陸地棉花粉注入效應(yīng)的影響。發(fā)現(xiàn)N+注入時(shí)的抽真空過(guò)程對(duì)陸地棉花粉活力無(wú)影響,離子能量、總劑量、劑量率、脈沖劑量和注入間隔時(shí)間等5個(gè)參數(shù)均在不同程度上影響注入結(jié)果。5個(gè)參數(shù)對(duì)注入效果的影響順序?yàn)槟芰?劑量率>總劑量>脈沖劑量>間隔時(shí)間。因此,在實(shí)際的離子注入時(shí),應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康木C合考慮這些參數(shù)的效應(yīng),比如采用高能量-低劑量-長(zhǎng)間隔時(shí)間可能是提高注入花粉

9、活力較為有效的方法。
　　 2.4 以20 Gy的60Co-γ射線輻照陸地棉花粉粒,發(fā)現(xiàn)60C0-γ射線對(duì)花粉粒的表面結(jié)構(gòu)無(wú)影響；但對(duì)花粉粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的破壞作用,內(nèi)壁變薄,不規(guī)則且部分向內(nèi)凹陷,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解聚,內(nèi)含物增多；與對(duì)照(自然花粉)相比,花粉?；盍档土?8％授粉后胚珠的DNA多態(tài)性明顯增加；M1發(fā)芽率降低了41.03%。棉株的主根長(zhǎng),最長(zhǎng)側(cè)根長(zhǎng)度,平均側(cè)根長(zhǎng)度,側(cè)根數(shù)和株高等分別比對(duì)照下降了22.24%,18.93%

10、,11.80％,28.02％和23.05％。雄性不育株占56.7％。鈴數(shù)的變異系數(shù)最大,達(dá)119.79％,比對(duì)照增加103.21％,其次為衣分、莖粗、籽指、果枝數(shù)、最長(zhǎng)果枝,變異系數(shù)分別比對(duì)照增加了74.59％、75.96％、69.83％、33.25％、29.62％；株高變異系數(shù)最小(20.15％),比對(duì)照增加了11.843％.M2代植株中的雄性不育株占24％。M2代鈴數(shù)的變異系數(shù)最大(33.08％),較對(duì)照增加21.94％,其次為籽棉

11、產(chǎn)量、果枝數(shù)、株高、單鈴重,分別較對(duì)照增加了16.26％、3.83％、3.99％、7.25％。衣分的變異系數(shù)最小(4.90％),比對(duì)照增加0.50％.M2代各農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)及變異幅度均小于M1代。M3代的株高、果枝數(shù)、鈴數(shù)、產(chǎn)量和單鈴重5個(gè)性狀的均值皆低于對(duì)照,衣分均值高于對(duì)照,降低與升高的幅度皆小于M2代。在M1、M2、M3代等3個(gè)誘變后代中,M3代各農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)最小,M1代的變異系數(shù)最大。M3代大多數(shù)的變異株系表現(xiàn)穩(wěn)定,基

12、本無(wú)分離,因此,在誘變后代選擇上,M1代種子可混收,M2代再分單株收獲。M3代可獲得部分純合株系。
　　 2.5 以陸地棉成熟花粉粒為材料,結(jié)合超薄切片、熒光染色等技術(shù)。通過(guò)觀察花粉的表面結(jié)構(gòu)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、以及花粉萌發(fā)出的花粉管的生長(zhǎng)和內(nèi)部的微絲骨架結(jié)構(gòu)的變化,分析α粒子及60Co-γ射線的誘變效應(yīng),以及誘變效應(yīng)與輻照劑量間的關(guān)系,比較兩種輻射源產(chǎn)生的輻射效應(yīng)及機(jī)理方面的差異。結(jié)果表明,α粒子是通過(guò)刻蝕方式作用于花粉粒,不同于60

13、Co-γ射線通過(guò)高能量射線穿透花粉粒作用于花粉粒。兩種輻照方式均通過(guò)對(duì)花粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷使花粉萌發(fā)率及萌發(fā)花粉管的數(shù)目下降,破壞花粉管微絲骨架。相同劑量時(shí),60Co-γ射線的損傷作用大于α粒子的作用。
　　 2.6 從誘變育種的角度來(lái)說(shuō),α粒子由于其發(fā)射儀器的限制,每次處理的花粉數(shù)量有限,不能在田間大量授粉；N+雖然對(duì)花粉的損傷效應(yīng)明顯,但田間授粉,后代變異不明顯；20 Gy的60Co-γ射線是較為適宜的陸地棉成熟花粉育種的