可可西里土壤細(xì)菌多樣性的研究.pdf

1、可可西里被譽(yù)為“生命的禁區(qū)”，寒冷、少雨、輻射強(qiáng)、多大風(fēng)是可可西里地區(qū)的氣候特點(diǎn)?？煽晌骼锿寥牢⑸锒鄻有院苌俚玫窖芯浚寥牢⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)也不為所知。本研究采用純培養(yǎng)和免培養(yǎng)相結(jié)合的方法對(duì)可可西里土壤微生物多樣性進(jìn)行探索，所研究的土壤樣品均采自海拔4200-5300米之間。
　　 本研究采用22種分離培養(yǎng)基(M1-M22)及3種土壤預(yù)處理方法對(duì)土壤樣品中的微生物進(jìn)行選擇性分離研究，其中M1-M11有利于分離放線(xiàn)菌，M12主要用于

2、分離非放線(xiàn)菌細(xì)菌，培養(yǎng)基M13-M17為含鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基M18-M22適于堿性土壤樣品IMB08-207—IMB08-218中耐堿和嗜堿微生物的分離。純培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)共分離放線(xiàn)菌48株，16SrRNA基因序列研究比表明它們分別屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)、小月菌屬(Microlunatus)、動(dòng)孢菌屬(Actinokineospora)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、小單孢菌屬(Micromonospora)、紅球菌屬(Rho

3、dococcus)、糖霉菌屬(Glycomyces)、原小單胞菌屬（Promicromonospora）、微桿菌屬(Microbacterium)、戈登氏菌屬(Gordonia)、韓國(guó)生工屬(Kribbella)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、威廉姆斯菌屬(Williamsia)，同時(shí)還得到非放線(xiàn)菌細(xì)菌30株，分別屬于貪食菌屬(Variovorax)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomon

4、as)、芽孢桿菌屬(Bacillus)。
　　 16S rRNA基因序列分析顯示，純培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中分得到的菌株CPCC100076T與小月菌屬菌株的16S rRNA基因相似性最高(95.8-98.0％)，其中，與菌株Microlunatus parietis DSM 22083T的相似性達(dá)98.0%。在基于16SrRNA基因分析的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上，菌株CPCC100076T聚類(lèi)于小月菌屬內(nèi)與菌株Microlunatus parietis

5、 DSM 22083T聚成一個(gè)穩(wěn)定的亞分支。多相分類(lèi)研究數(shù)據(jù)不支持將菌株CPCC100076T歸入Microlunatus parietis種內(nèi)。因此，我們提議菌株CPCC100076T代表了小月菌屬的一個(gè)新物種。
　　 從純培養(yǎng)分離結(jié)果可以看出，在所有的土壤樣品中，IMB08-049中的微生物多樣性最好，共分離得到細(xì)菌19株，其中放線(xiàn)菌7株，非放線(xiàn)菌細(xì)菌12株。這些菌株分別屬于葉桿菌屬(Phyllobacterium)、貪食菌

6、屬(Variovorax)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、小月菌屬(Microlunatus)、原小單胞菌屬（Promicromonospora）、韓國(guó)生工屬(Kribbetla)和芽孢桿菌屬(Bacitlus)，而土壤樣品IMB08-056中未分離得到任何菌株。
　　 本研究分別采用16S rRNA基因文庫(kù)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)相結(jié)合的方法對(duì)純培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中多樣性最好的土壤樣品

7、IMB08-049和未得到任何分離株的IMB08-056進(jìn)行了分子生態(tài)學(xué)的研究。DGGE電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤樣品IMB08-049基因組16S rRNA基因的V3區(qū)片段經(jīng)變性梯度凝膠電泳(DGGE)后獲得了17個(gè)條帶，而土壤樣品IMB08-056獲得了條帶約為15條，可以粗略估計(jì)土樣IMB08-049中1%以上的細(xì)菌種群為17種，土樣IMB08-056中1%以上的細(xì)菌種群為15種。軟件Quantity one分析表明，土壤樣品IMB08-

8、049和IMB08-056中的微生物多樣性較低，這可能和其所處的極端環(huán)境有一定關(guān)系。而土壤樣品IMB08-049較IMB08-056細(xì)菌種類(lèi)相對(duì)豐富。
　　 本研究分別構(gòu)建了基于通用引物PCR擴(kuò)增的細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫(kù)，通過(guò)AfaⅠ和HaeⅢ限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)兩份土壤樣品細(xì)菌16S rRNA基因文庫(kù)中的克隆進(jìn)行ARDRA(Amplified Ribosomal DNA Rstriction Analysis)分析，將所有

9、陽(yáng)性克隆分為若干個(gè)可操作分類(lèi)單元(OTU)。分析結(jié)果表明，IMB08-049號(hào)土壤樣品中的細(xì)菌可分為19個(gè)OTUs，選擇各OTU中代表性克隆子進(jìn)行測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明該土壤樣品中細(xì)菌在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中分屬于3個(gè)類(lèi)群：其中變形菌門(mén)（Proteobacteria）為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)種群，其次是放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）。19個(gè)OTUs中有14個(gè)OTUs的16S rRNA基因序列與GeneBank

10、數(shù)據(jù)庫(kù)中已培養(yǎng)細(xì)菌的序列相似性高于97%，另外的5個(gè)與已培養(yǎng)或未培養(yǎng)的屬種的16S rRNA基因相似性低于或等于97%。而土壤樣品IMB08-056中的細(xì)菌可分為23個(gè)OTUs。16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明，該土壤樣品中細(xì)菌分屬于3個(gè)類(lèi)群：其中變形菌門(mén)（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)種群，其次為放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)和

11、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）。23個(gè)OTUs中有16個(gè)OTUs的16S rRNA基因序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已培養(yǎng)細(xì)菌的序列相似性高于97%，另外的7個(gè)與已培養(yǎng)或未培養(yǎng)的屬種的16S rRNA基因相似性低于97%。
　　 對(duì)土壤樣品IMB08-049的DGGE和16S rRNA基因文庫(kù)研究結(jié)果表明，相對(duì)于普通環(huán)境樣品，該樣品中微生物多樣性較低。DGGE電泳中三條優(yōu)勢(shì)條帶的測(cè)序結(jié)果與16S rRNA基因文庫(kù)中優(yōu)勢(shì)種群的分