溫州大學本科畢業(yè)論文終稿

1、<p>　　溫度對黑線倉鼠抗氧化能力和解偶聯(lián)蛋白表達的影響</p><p>　　作者：周思思 導師：趙志軍教授</p><p>　?。刂荽髮W生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州，325027）</p><p>　　摘要：根據(jù)自由基的假說，高代謝率應(yīng)該會增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生。然而，“解偶聯(lián)生存”假說認為解偶聯(lián)蛋白（UCPs）可以通過降低線粒體內(nèi)膜的勢能

2、減少ROS的產(chǎn)生，在這種情況下，代謝速率和ROS的產(chǎn)生之間的關(guān)系將是負相關(guān)而不是正相關(guān)。在本研究中，我們研究黑線倉鼠能量攝入、氧化應(yīng)激水平、抗氧化活性，以及褐色脂肪組織(BAT)、肝臟、心臟、骨骼肌和大腦解偶聯(lián)蛋白的表達。將黑線倉鼠馴化于5℃和32.5℃的環(huán)境，而對照組飼養(yǎng)在室溫下 (21°C)。相對于對照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠能量攝入增加了70.7%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠能量攝入

3、減少31.3%。相對于對照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的丙二醛（MDA）水平、總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）在BAT中顯著降低。相對于對照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的UCP1在BAT中的表達顯著上升，而在32.5°C環(huán)境中顯著下降。在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP3在骨骼肌的表達也大幅上升。這些結(jié)果表明，活性氧的產(chǎn)生和代謝率之間的關(guān)系是負相關(guān)，而不是正

4、相關(guān)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：抗氧化劑；褐色脂肪組織(BAT)；氧化應(yīng)激；黑線倉鼠；溫度；解偶聯(lián)蛋白</p><p>　　Barabensis temperature oxidation resistance and uncoupling protein expression</p><p>　　Author: Zhou Sisi Tutor: Zhao

5、 Zhijun</p><p>　　(College of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou Zhejiang, 325027)</p><p>　　Abstract: In line with living-free radical surmise, higher metabolic rates sh

6、ould subjoin reactive oxygen species (ROS) production. But, the “uncoupling survival” surmise assume that uncoupling proteins (UCPs) by reducing mitochondrial membrane potential to lessen the operation of ROS, in this ca

7、se, the relationship between metabolic rate and ROS production will be a negative correlation between rather than positive. We barabensis into 5 °C and 32.5 °C environment domesticated. The control group</p&

8、gt;<p>　　Key words: Antioxidants; Brown adipose tissue (BAT); Oxidative stress; Striped hamster; Temperature; Uncoupling proteins</p><p><b>　　一、背景介紹</b></p><p>　　21世紀是生物的世紀，在這

9、樣的社會大環(huán)境下，對于生物體的研究也是越發(fā)的超前，學者們花大量的時間和精力去研究前人的實驗以及探究發(fā)現(xiàn)新的結(jié)論。通過不斷的研究來探索生命的現(xiàn)象的本質(zhì)因素。自由基理論認為細胞的代謝過程離不開氧的存在，生物氧化的過程是細胞獲得能量的過程。自由基理論把衰老與代謝聯(lián)系起來，并認為呼吸代謝氧化磷酸化過程中產(chǎn)生過多的自由基對生物體大分子物質(zhì)的氧化損傷會加速衰老的進程，從而減短了壽命。其中最主要的是活性氧（ROS）水平。因為高ROS水平會增強氧化來損

10、傷生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA，因此高ROS水平被認為是減少預(yù)期壽命的原因。</p><p>　　然而有關(guān)對鳥類的研究表明，有些物種的代謝率越高其壽命反而越長。此外，與保持在室溫下的小鼠相比，暴露在相對低溫情況下的小鼠其代謝較高并且壽命也較長。對于代謝率與ROS產(chǎn)生的關(guān)系，在一些研究中發(fā)現(xiàn)這兩者之間是存在著明顯的負相關(guān)，對其的一個可能的解釋是“解偶聯(lián)求生存”假說。該假說提出，解偶聯(lián)蛋白降低ROS的產(chǎn)生，通過降

11、低線粒體內(nèi)膜的電位來實現(xiàn)的。</p><p>　　UCPs是線粒體膜上的轉(zhuǎn)運蛋白，迄今為止，在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)5 種UCPs：UCP1 主要分布在褐色脂肪組織中；UCP2能在白色脂肪組織、骨骼肌和免疫系統(tǒng)等多種組織中出現(xiàn)；UCP3主要存在于骨骼肌和脂肪組織里。UCP4和UCP5主要在大腦和肝臟中出現(xiàn)。UCP1調(diào)節(jié)機體產(chǎn)熱，可介導任意食物誘導的產(chǎn)熱。UCP2 因為具有質(zhì)子漏功能，而減少了線粒體ROS(活性氧）產(chǎn)物

12、的產(chǎn)生。UCP3 有較強的減少ROS的產(chǎn)生和從線粒體基質(zhì)中輸出脂肪酸陰離子或脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的能力，這樣可以進一步減少氧化應(yīng)激等?？偟膩碚f，UCPs能控制線粒體內(nèi)ROS 生成，與氧化應(yīng)激等過程也有密切聯(lián)系。</p><p>　　“解偶聯(lián)求生存”假說預(yù)測，暴露在寒冷環(huán)境下動物的組織應(yīng)該會降低ROS的產(chǎn)生而解偶聯(lián)蛋白的表達量會增高。但是一些研究結(jié)果并不符合解偶聯(lián)生存假說，比如暴露在寒冷環(huán)境下大鼠的肝臟、心臟和骨骼肌中過

13、氧化氫（H2O2）水平增加，暴露在寒冷環(huán)境下短尾田鼠的肝臟和肌肉組織蛋白質(zhì)羰基水平顯著增加。</p><p>　　我們設(shè)計實驗來測定溫度對黑線倉鼠的代謝率、氧化應(yīng)激、抗氧化水平和mRNA的表達的影響。我們翻閱大量的資料，仔細分析之前相關(guān)實驗的數(shù)據(jù)，以及之前實驗的相關(guān)結(jié)論，考究這些之間的相關(guān)性。并且參考之前實驗的相關(guān)原理以及實驗存在的不足之處，為我們自己的實驗做好充分的準備。先前的一個研究發(fā)現(xiàn)，暴露在適度寒冷或氣溫

14、相對溫和的環(huán)境中，對黑線倉鼠氧化應(yīng)激和抗氧化水平并沒有造成顯著變化。當前研究的目的是測定溫度對黑線倉鼠代謝率、氧化應(yīng)激和抗氧化水平的影響，以及與“解偶聯(lián)求生存”假說關(guān)系。</p><p><b>　　二、實驗材料</b></p><p>　　本實驗所使用的黑線倉鼠來自于河北省的農(nóng)田 (115°13’E, 38°12’S)，被飼養(yǎng)于溫州大學。黑線倉鼠

15、被單獨安置在裝有適量鋸末的塑料籠子里(29 × 15 × 18 cm)，定期更換干凈的鋸末并且清理籠子；保證黑線倉鼠有充足的食物(北京科奧飼料有限公司的標準嚙齒動物食物)和水。實驗前所有動物都安置在21±1°C溫度的環(huán)境中。</p><p>　　成年倉鼠3.5 到4.5個月的年齡，隨機分成3組，低溫馴化組5±1°C (n = 9)和溫暖氣溫馴化組32.5

16、±1°C (n = 8)，對照組保存在室溫下(21±1°C)(n = 8)，分別飼養(yǎng)6周。所有動物的體重和食物攝入量是每兩天測量一次并且及時記錄數(shù)據(jù)。溫度處理結(jié)束后，對各個組的組織樣品進行收集與保存。</p><p><b>　　三、實驗方法</b></p><p>　　3.1總能量攝入(GEI)，消化能量攝入(DEI)和消化率

17、</p><p>　　在實驗的最后兩天對總能量攝入，消化能量攝入進行測定。將每個籠子中剩下的食物以及從木榍中挑出黑線倉鼠的糞便分別裝好，并且將黑線倉鼠的糞便置于60°C的烘箱中烘干并且測量記錄數(shù)據(jù)。食物和糞便的總能量用氧彈量熱計測定。</p><p>　　總能量攝入(GEI)，消化能量攝入(DEI)和消化率計算使用以下方程：</p><p>　　總能量攝入

18、(kJ/d) = [食物攝入量(g/d) ×飼料的干物質(zhì)含量(%) –食物碎屑] ×食物總能量含量(kJ/g)；</p><p>　　消化能量攝入(kJ/d) =總能量攝入– [糞便干質(zhì)量(g/d) ×糞便的總能量含量(kJ/g)]；</p><p>　　消化率 (%) =消化能量攝入/總能量攝入× 100%</p><p>

19、　　3.2氧化應(yīng)激標記物和抗氧化酶</p><p>　　實驗材料的提取，采用斷頸法取血，將黑線倉鼠處死，快速取其肩胛間的褐色脂肪組織（BAT），腿部骨骼肌、肝臟、心臟和大腦，并且將這些實驗材料儲在液態(tài)氮中迅速冷凍，以保證實驗材料的活性。組織的處理方式：按照一定的質(zhì)量配比將組織放置到冰冷的0.9%的氯化鈉溶液中進行勻漿，然后再放到離心機中用3000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速對其進行離心，15分鐘后取其上清液保存在適宜的環(huán)境中待后續(xù)實

20、驗分析。用Lowry法測定蛋白質(zhì)濃度。使用(南京建成生物工程研究所)生產(chǎn)的試劑測定過氧化氫（H2O2）水平，并通過對過氧化氫水平的測定來分析分析黑線倉鼠的氧化應(yīng)激水平。過氧化氫（405nm）的水平表示為毫摩爾/克蛋白質(zhì)（mmol/g protein）。</p><p>　　丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的指標。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，用硫代巴比妥酸（TBA）在532nm波長進行測定，并且產(chǎn)生具有粉紅

21、色的產(chǎn)物。組織MDA水平表示為納摩爾/克蛋白質(zhì)（nmol/mg protein）。</p><p>　　3.3總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性</p><p>　　使用(南京建成生物工程研究所)生產(chǎn)的試劑測定T-AOC和GSH-活性。在之前的大量預(yù)實驗研究中證實這些試劑都適用于黑線倉鼠。黑線倉鼠機體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使3價的Fe還原成2價的Fe，后者可

22、與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)和物，通過比色可測出其抗氧化能力的高低。在測定過程中，將待測液按一定要求處理后用雙蒸水調(diào)零1cm光徑，520nm測各種管吸光度。定義：在37℃時，每分鐘每毫克待測液，使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位。</p><p>　　在GSH-PX活性測定的基礎(chǔ)上還原谷胱甘肽（GSH），過氧化氫產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（GSSG）和H2O反應(yīng)。GSH與二硫化碳代2硝基苯甲

23、酸（DTNB）反應(yīng)產(chǎn)生2-硝基-5-硫代苯甲酸，可以在412nm處被檢測的黃色化合物反應(yīng)。</p><p>　　3.4實時RT-qPCR的分析</p><p>　　熒光定量PCR分析使用Trizol試劑（TAKARA，中國大連）。提取褐色脂肪組織、肝、心臟、骨骼肌和腦組織總RNA，用分光光度計測定的吸光度值確定RNA樣品濃度，然后調(diào)節(jié)到一致水平。取用調(diào)整過濃度的總RNA樣品2μL，用MLV

24、反轉(zhuǎn)錄酶（TAKARA）和oligo（dT18）引物進行cDNA的合成，反應(yīng)體系為50μL。用2μL的cDNA樣品作為模板，使用解偶聯(lián)蛋白目的基因的特定引物進行PCR反應(yīng)（表1）。</p><p><b>　　3.5統(tǒng)計數(shù)據(jù)</b></p><p>　　數(shù)據(jù)都表示為平均值±標準誤差，在SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。體重和食物攝入量的變化檢測使用重復

25、測量方差分析。采用皮爾森相關(guān)系數(shù)分析來檢驗H2O2和MDA水平并T-AOC和GSH-Px活性之間的關(guān)系。P<0.05被認為是具有統(tǒng)計學的顯著意義。運用統(tǒng)計學的方法處理和分析數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。</p><p><b>　　四、試驗結(jié)果</b></p><p>　　4.1體重和食物攝入量</p><p>　　3個小組黑線倉鼠的體重在實驗開始前并

26、沒有顯著的區(qū)別(d0，F(xiàn)2,22 = 0.11，P>0.05， 圖1A)，并且經(jīng)過六個星期的馴化后，3個小組黑線倉鼠的體重也沒有顯著的差別(d2，F(xiàn)2,22=0.45，P>0.05；d42，F(xiàn)2,22=0.94，P>0.05)。3個小組黑線倉鼠的食物攝入量在第一天的時候沒有顯著的差別(d0，F(xiàn)2,22=0.13，P>0.05，圖1B)，但從第二天開始一直到42天，相對于對照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉

27、鼠其食物攝入量明顯增加，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則明顯減少 (d2，F(xiàn)2,22=16.43，P<0.01，d42，F(xiàn)2,22=25.38，P<0.01，圖1B)。</p><p>　　圖1 在不同溫度（5°C，21°C，32.5°C）馴化下黑線倉鼠的體重變化（A）和食物攝入量(B)。數(shù)據(jù)平均值± SE, **P<0.01。</p

28、><p>　　Figure 1. Effect of temperature on body mass (A) and food intake (B) in striped hamsters acclimated to 5°C, 21°C and 32.5°C. Data are means ± SE, **P<0.01.</p><p>　　4.

29、2總能量攝入與消化率</p><p>　　總能量攝入受溫度的影響，相對于對照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其總能量攝入增加，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其總能量攝入則減少(F2,22=26.13，P<0.01，post hoc，P<0.05，圖2A)。相對于對照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠產(chǎn)生的糞便較多，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則反之(F

30、2,22=35.90，P<0.01，post hoc，P<0.05，圖2B)。3個小組的消化能量攝入存在著差異，相對于對照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其消化能量攝入提高了68.9%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則降低了37.2% (F2,22=20.58，P<0.01，post hoc，P<0.05，圖2C)。然而3個小組之間的消化率并沒有明顯的差別(F2,22=0.16，P>

31、0.05，圖2D)。</p><p>　　圖2 溫度對黑線倉鼠總能量攝入（GEI，A），糞便的總能量（GE）（B），消化能量攝入（DEI，C）和消化率（D）的影響。數(shù)據(jù)平均值± SE, **P<0.01。</p><p>　　Figure 2. Effect of temperature on gross energy intake (GEI, A), gross ener

32、gy (GE) of feces (B), digestive energy intake (DEI, C) and digestibility (D) in striped hamsters. Data are means ± SE, **P<0.01.</p><p>　　4.3褐色脂肪組織（BAT）蛋白質(zhì)含量</p><p>　　如表2所示，在5°C環(huán)境中馴

33、化的黑線倉鼠的褐色脂肪組織（BAT）蛋白質(zhì)含量明顯高于對照組以及在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠。肝臟、心臟、肌肉以及大腦中的蛋白質(zhì)都不受溫度的影響。</p><p><b>　　4.4氧化應(yīng)激</b></p><p>　　在這3個小組之間,肌肉的過氧化氫（H2O2）的水平都比較低，然而大腦和褐色脂肪組織（BAT）中的過氧化氫（H2O2）水平比較高。無論是

34、在褐色脂肪組織（BAT）(F2,22=2.14，P>0.05)還是肝臟(F2,22=1.50，P>0.05)、心臟(F2,22=1.50，P>0.05)、肌肉(F2,22=1.09，P>0.05)、大腦(F2,22=2.60，P>0.05，圖3A)，溫度對于過氧化氫（H2O2）的水平的表達幾乎沒有影響。這3個小組之間，在肝臟(F2,22=0.77，P>0.05)、心臟(F2,22=0.17，P>

35、0.05)、肌肉(F2,22=1.50，P>0.05)和大腦(F2,22=0.67，P>0.05)，溫度對于丙二醛(MDA)的水平的表達并沒有明顯的差別。然而在褐色脂肪組織（BAT）中溫度對于丙二醛(MDA)水平的表達有明顯的影響；相對于對照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其BAT中丙二醛(MDA)的水平降低了41.4%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則升高了196.4%(F2,22=10.40，P&

36、lt;0.01，post hoc，P<0.05，圖3B)。</p><p>　　圖3 溫度對H2O2（A）和黑倉鼠丙二醛（MDA）含量（B）的影響。數(shù)據(jù)平均值±SE, ** P <0.01。</p><p>　　Figure 3. Effect of temperature on H2O2 (A) and malonaldehyde (MDA) levels (B)

37、in striped hamsters. Data are means ± SE, **P<0.01. </p><p><b>　　4.5抗氧化水平</b></p><p>　　在這3個小組之間，總抗氧化能力（T-AOC）的水平在肝臟、心臟、肌肉、大腦中并沒有明顯的差別(liver，F(xiàn)2,22=0.42，P>0.05；heart，F(xiàn)2,22=0

38、.15，P>0.05；muscle，F(xiàn)2,22=1.43，P>0.05；brain tissue，F(xiàn)2,22=0.38，P>0.05；圖4A)。然而在黑線倉鼠的褐色脂肪組織（BAT）中溫度對于總抗氧化能力（T-AOC）水平有明顯影響；相對于對照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的總抗氧化能力（T-AOC）的水平降低了46.6%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則升高了33.4%(F2,22=3.1

39、9，P=0.06)。與其他組織相比較，大腦和心臟的總抗氧化能力（T-AOC）較低。在黑線倉鼠的肝臟(F2,22=0.52，P>0.05)、心臟(F2,22=2.37，P>0.05)和肌肉 (F2,22=0.92，P>0.05，圖4B)中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）水平并沒有受溫度的影響。</p><p>　　圖4 溫度對黑線倉鼠T-AOC（A）和GSH-Px活性（B）的影響。數(shù)據(jù)平均值&#

40、177;S,E, ** P <0.01。</p><p>　　Figure 4. Effect of temperature on T-AOC (A) and GSH-PX activity (B) in striped hamsters. Data are means ± SE, *P<0.05. </p><p>　　但是在黑線倉鼠的褐色脂肪組織（BAT）中溫度對

41、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）水平有顯著的影響；相對于對照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的總抗氧化能力（T-AOC）的水平降低了39.4%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則升高了41.8%(F2,22=4.87，P<0.05，post hoc，P<0.05)。與對照組和在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠相比，在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的總抗氧化能力（T-AOC）水平大概降低

42、了40%；但這種差距在統(tǒng)計學上并不是很顯著(F2,22=3.31，P=0.06)。雖然在肝臟中過氧化氫（H2O2）、丙二醛(MDA)、 總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）存在明顯的相關(guān)性，但是在褐色脂肪組織（BAT）、心臟、肌肉和大腦中并沒有發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)性(表3)。</p><p>　　4.6 UCP mRNA的表達</p><p>　　在褐色脂肪組織（BAT

43、）中，UCP1 mRNA的表達明顯受溫度的影響，并且在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其表達明顯高于對照組和在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠(F2,22=7.92，P<0.01，post hoc，P<0.05)；對照組與在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠之間并沒有明顯的差別(post hoc，P>0.05，圖5)。在肌肉中UCP3 mRNA的表達明顯受溫度的影響，并且在5°C環(huán)境中馴

44、化的黑線倉鼠中的表達是對照組的4.48倍(F2,22=17.00，P<0.01，post hoc，P<0.05)。溫度對于UCP2在肝臟中的表達并沒有影響(F2,22=1.88，P>0.05)；溫度對于UCP3在心臟中的表達也沒有影響(F2,22=2.20，P>0.05)；以及溫度對于UCP2、UCP4、UCP5在大腦的表達中也沒有影響(UCP2，F(xiàn)2,22=0.36，P>0.05，UCP4，F(xiàn)2,22=0

45、.25，P>0.05，UCP5，F(xiàn)2,22=0.94，P>0.05，圖5)。</p><p>　　圖5 溫度對黑線倉鼠解偶聯(lián)蛋白（UCP）mRNA在褐色脂肪組織（BAT）、肝臟、心臟、肌肉以及大腦中表達的影響。數(shù)據(jù)平均值±S,E, ** P <0.01。</p><p>　　Figure 5. Effect of temperature on uncouplin

46、g protein (UCP) mRNA expression in brown adipose tissue (BAT), and liver, heart, muscle and brain tissue, in striped hamsters. Data are means ± SE, **P<0.01. </p><p><b>　　五、實驗討論</b></p

47、><p>　　環(huán)境溫度是影響小型哺乳動物的能量收支的最重要的因素之一。我們的研究結(jié)果表明，相對于對照組(21±1°C)在5±1°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其總能量攝入增加，而在32.5±1°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其總能量攝入則減少。這個結(jié)果與之前對黑線倉鼠的研究的結(jié)果是相一致；并且表明黑線倉鼠在寒冷的環(huán)境條件下其能量代謝增加，而在炎熱的環(huán)境條件下能量代謝降低。&

48、lt;/p><p>　　褐色脂肪組織（BAT）是中小型哺乳動物在寒冷的環(huán)境中參與非顫抖性產(chǎn)熱的重要組織，非顫抖性產(chǎn)熱是一種不涉及肌肉活動而釋放的化學能的熱量，在能量代謝過程中起到非常重要的作用。這種產(chǎn)熱主要受交感神經(jīng)支配和甲狀腺激素的調(diào)控。就像布氏田鼠(Microtus brandti)在5℃環(huán)境下馴化一個月的時間，其在靜止狀態(tài)下的代謝率比在25℃恒溫狀態(tài)下增長34%，并且其非顫抖性產(chǎn)熱增加了91%之多；阿拉斯加紅背

49、鼠平(Clethrionomys rutilus)冬季的非顫抖性產(chǎn)熱是基礎(chǔ)代謝產(chǎn)熱的10倍，在根田鼠(Microtus oeconomus)是3.7倍。在本實驗中我們觀察到相對于對照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的蛋白質(zhì)含量升高了53.9%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則降低了36.2%。丙二醛(MDA)脂質(zhì)過氧化的次級產(chǎn)物在2個小組中含量發(fā)生了明顯的變化，相對于對照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠降

50、低41.1%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則升高了196.4%；由此可知丙二醛(MDA)和能量代謝呈負相關(guān)。</p><p>　　類似的差異也存在于總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的表達水平。先前的研究發(fā)現(xiàn)，相對于對照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的脂質(zhì)過氧化物、超氧化物歧化酶水平和T-AOC水平，分別為27.9％、29.9％和48.5％。這個結(jié)果與（代謝

51、率與ROS的產(chǎn)生存在著負相關(guān)）這一假設(shè)相一致。</p><p>　　哺乳動物通過增加能量代謝來適應(yīng)寒冷的環(huán)境，剛開始時迅立即過骨骼肌的顫抖性產(chǎn)熱來進行能量代謝的，隨后由褐色脂肪組織（BAT）通過非顫抖性產(chǎn)熱來維持能量代謝，而哺乳動物在炎熱的環(huán)境下則是以相反的方式進行能量代謝的。雖然骨骼肌在寒冷的環(huán)境下產(chǎn)熱顯著增加，但是骨骼肌的產(chǎn)熱是屬于顫抖產(chǎn)熱而不是非顫抖產(chǎn)熱；事實證明骨骼肌在非顫抖產(chǎn)熱中所扮演的是一個次要的角色

52、。然而，我們的研究結(jié)果顯示，無論是ROS的產(chǎn)生通過過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）水平表明，還是抗氧化劑（T-AOC、GSH-PX）的水平都不受到溫度的影響。在之前的研究中并沒有發(fā)現(xiàn)置于寒冷溫度(15°C)或保持在室溫（23°C）的條件下，倉鼠的氧化應(yīng)激和抗氧性存在差異。相反，在另一項研究中確實檢測到短尾場田鼠骨骼肌的過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的含量增加。此外，在長期受凍的情況下，短尾場田鼠的過氧化氫酶活性

53、先增加，然后再回到基礎(chǔ)水平。在這項研究中， ROS和抗氧化活性穩(wěn)定性的機制還不清楚。</p><p>　　與褐色脂肪組織（BAT）和骨骼肌相比，氧化應(yīng)激和抗氧化水平在黑線倉鼠的肝臟、心臟、大腦并沒有因為溫度而受到明顯的影響，表明在這些器官中氧化應(yīng)激和抗氧化活性之間存在著相關(guān)性。有人提出動物具有各種防止氧化應(yīng)激的機制，并且這樣的抗氧化防御系統(tǒng)的正確調(diào)節(jié)能保持氧化與抗氧化的平衡。各種研究已經(jīng)表明，為了以應(yīng)付ROS的產(chǎn)

54、生，抗氧化防御系統(tǒng)可以被刺激而產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答措施。</p><p>　　“解偶聯(lián)求生存”假說表明，解偶聯(lián)蛋白降低線粒體膜電位，從而減少活性氧的產(chǎn)生。UCP1在BAT中完全表達，在適應(yīng)性產(chǎn)熱的過程中起到重要的作用。正如預(yù)期的那樣，我們發(fā)現(xiàn)相對于對照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP1在BAT中的表達顯著增加，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則降低，這個結(jié)果與在能量代謝中觀察到的變化是一

55、致的；但與預(yù)期結(jié)果不一致的是MDA、T-AOC、GSH-PX，相對于對照組在32.5℃環(huán)境中馴化的黑線倉鼠這些指標顯著增加，而在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則反之。</p><p>　　與UCP1相比，UCP3的表達主要在骨骼肌中；UCP3的主要功能可能不是能量代謝的調(diào)節(jié)。相對于對照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP3在肌肉中的表達顯著增加。一般情況下，在寒冷環(huán)境中馴化的倉鼠其BAT和骨骼

56、肌會顯示出氧化消耗與線粒體能量代謝增加的結(jié)果。</p><p>　　有人提出，BAT極其容易受到氧化應(yīng)激，這主要是由于其高濃度的線粒體以及高產(chǎn)熱能力，由此增加ROS產(chǎn)生。在寒冷環(huán)境馴化下的骨骼肌由于其肥大也可能容易誘使氧化應(yīng)激。然而，包括黑線倉鼠在內(nèi)的處于寒冷環(huán)境中的動物，它們的ROS的產(chǎn)生水平并沒有增加，并且在整個生物個體或組織中并沒有發(fā)現(xiàn)ROS的產(chǎn)生水平與代謝率之間存在正比的關(guān)系，這與“解偶聯(lián)求生存”假說的觀

57、點一致。</p><p>　　一些研究已經(jīng)證實解偶聯(lián)蛋白特別是UCP3會降低在骨骼肌中的線粒體ROS的產(chǎn)生水平。不幸的是，到目前為止在生物個體或細胞水平并沒有大量的證據(jù)支持這個假說。我們發(fā)現(xiàn)UCP3在骨骼肌中表達的變化，尤其是UCP1在BAT中表達的變化，與之前在氧化應(yīng)激和抗氧化性研究的方向是相反的。雖然這些發(fā)現(xiàn)符合 “解偶聯(lián)求生存”假說在整個生物體和組織的水平，但是其他的影響因素對于氧化應(yīng)激的影響不能排除在外。

58、</p><p><b>　　六、實驗結(jié)論</b></p><p>　　相對于對照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的能量攝入提高，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的能量攝入則降低。這表明在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠和在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠它們的代謝率顯著不同。相對于對照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的

59、MDA、T-AOC、 GSH-PX水平明顯下降，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則上升，表明氧化應(yīng)激和抗氧化性與代謝之間呈負相關(guān)。這既不是受ROS產(chǎn)生的影響，也不受存在于骨骼肌、肝臟、心臟或腦組織中的抗氧化劑的影響，而是受溫度的影響。這表明氧化應(yīng)激和抗氧化性之間存在著一種相關(guān)性，這與抗氧化防御系統(tǒng)在防止氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮著重要的作用這一想法是一致的。</p><p>　　相對于對照組，在5°

60、;C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP1在BAT中的表達明顯升高，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP1在BAT中的表達明顯降低。這一趨勢與溫度引起能量代謝的變化是一致的，但是與溫度引起氧化應(yīng)激的變化是相反的。另外相對于對照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP3在骨骼肌中的表達明顯上升，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則反之。這些結(jié)果表明ROS產(chǎn)生水平與代謝率之間并沒有存在著正相關(guān)性，因此在生物個

61、體水平和組織水平上是存在證明“解偶聯(lián)求生存”假說的證據(jù)。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　在此我衷心地感謝趙志軍老師對在畢業(yè)論文實驗過程中以及在寫作上的悉心指導。同時也要感謝曹麗麗、徐維東、鄭國梟和林江濤同學在實驗中給予的協(xié)助！</p><p><b>　　參考文獻</b></p>

62、<p>　　[1] Argyropoulos, G., Harper, M.E., 2002. Uncoupling proteins and thermoregulation. J. Appl. Physiol. 92, 2187-2198.</p><p>　　[2] Barja de Quiroga, G., 1992. Brown fat thermogenesis and exercise

63、: two examples of physiological oxidative stress? Free Radic. Biol. Med. 13, 325-340.</p><p>　　[3] Beckman, K.B., Ames, B.N., 1998. The free radical theory of aging matures. Physiol. Rev. 78, 547-581.</p&

64、gt;<p>　　[4] Nespolo, R.F., Bacigalupe, L.D., Sabat, P., Bozinovic, F., 2002. Interplay among energy metabolism, organ mass and digestive enzyme activity in the mouse-opossum Thylamys elegans: the role of thermal

65、acclimation. J. Exp. Biol. 205, 2697–2703.</p><p>　　[5] Brand, M.D., 2000. Uncoupling to survive? The role of mitochondrial inefficiency in ageing. Exp. Gerontol. 35, 811-820.</p><p>　　[6] Bueg

66、e, J.A., Aust, S.D., 1978. Microsomal lipid peroxidation, Methods Enzymol. 52, 302-311.</p><p>　　[7] Bustamante, D.M., Nespolo, R.F., Rezende, E.L., Bozinovic, F., 2002. Dynamic thermal balance in the leaf-e

67、ared mouse: the interplay among ambient temperature, body size, and behavior. Physiol. Biochem. Zool. 75, 396-404. </p><p>　　[8] 楊茂林,孟思進. 線粒體氧化損傷在衰老發(fā)生機制中的作用[J]——醫(yī)學綜述 2010年 5月第16卷第19期 </p><p>

68、　　[9] Barja de Quiroga, G., 1992. Brown fat thermogenesis and exercise: two examples ophysiological oxidative stress? Free Radic. Biol. Med. 13, 325-340. </p><p>　　[10] Beckman, K.B., Ames, B.N., 1998. The f

69、ree radical theory of aging matures. Physiol. Rev. 78, 547-581. </p><p>　　[11]趙志軍，曹靜，王桂英等.隨機饑餓和重喂食對小鼠能量代謝和行為的影響[J] .獸類學報,2009，29(3):277 -285.</p><p>　　[12]吳宿慧，苗明三，李寒冰.決明子對家蠶代謝率與壽命的關(guān)聯(lián)研究。中醫(yī)藥理與臨床20

70、14；30（4）.</p><p>　　[13] Brand, M.D., 2000. Uncoupling to survive? The role of mitochondrial inefficiency in ageing. Exp. Gerontol. 35, 811-820.</p><p>　　[14]楊淑慎，高俊風.活性氧、自由基與植物衰老[J].西北植物學報2001,21

71、（2）.</p><p>　　[15] Nespolo, R.F., Bacigalupe, L.D., Sabat, P., Bozinovic, F., 2002.</p><p>　　[16] Interplay among energy metabolism, organ mass and digestive enzyme activity in the mouse-opossum

72、 Thylamys elegans: the role of thermal acclimation. J. Exp. Biol. 205, 2697–2703.</p><p>　　[17] Argyropoulos, G., Harper, M.E., 2002. Uncoupling proteins and thermoregulation. J. Appl. Physiol. 92, 2187-2198

73、. [14]</p><p>　　[18] 史玉琴, 牛翠嬌, 殷志萍等.赤霉素GA3 對小鼠機體氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡的影響[J] .北京工商大學學報(自然科學版),2010，第28卷第5期.</p><p>　　[19] Zhao, Z.J., Cao, J., Meng, X.L., Li, Y.B., 2010a. Seasonal variations in metabolism

74、and thermoregulation in the striped hamster. J. Therm. Biol. 35, 52-57.</p><p>　　[20]王金濤．冷應(yīng)激對雛雞神經(jīng)內(nèi)分泌及抗氧化功能的影響［D］．哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學，2006.</p><p>　　[21]王金濤，李寧，徐世文．急、慢性冷應(yīng)激對雛雞腓腸肌及血清抗氧化功能的影響［J］，中國農(nóng)學通報，2007，

75、23(3):28－32．</p><p>　　[22] 楊茂林,孟思進. 線粒體氧化損傷在衰老發(fā)生機制中的作用[J]——醫(yī)學綜述 2010年 5月第16卷第19期 </p><p>　　[23] Barja de Quiroga, G., 1992. Brown fat thermogenesis and exercise: two examples ophysiological o

76、xidative stress? Free Radic. Biol. Med. 13, 325-340. </p><p>　　[24] Beckman, K.B., Ames, B.N., 1998. The free radical theory of aging matures. Physiol. Rev. 78, 547-581. </p><p>　　[25]趙志軍，曹靜，王桂英

77、等.隨機饑餓和重喂食對小鼠能量代謝和行為的影響[J] .獸類學報,2009，29(3):277 -285.</p><p>　　[26]吳宿慧，苗明三，李寒冰.決明子對家蠶代謝率與壽命的關(guān)聯(lián)研究。中醫(yī)藥理與臨床2014；30（4）.</p><p>　　[27] Brand, M.D., 2000. Uncoupling to survive? The role of mitochondr

78、ial inefficiency in ageing. Exp. Gerontol. 35, 811-820.</p><p>　　[28]楊淑慎，高俊風.活性氧、自由基與植物衰老[J].西北植物學報2001,21（2）. </p><p>　　[29]Buzadzic, B., Korac, B., Petrovic, V.M., 1999. The effect of adaptati

79、on to cold and readaption to room temperature on the level of glutathione in rat tissues. J. Therm. Biol. 24, 373-377.</p><p>　　[30]Chen, K.X., Wang, C.M., Wang, G.Y., Zhao Z.J., 2014. Energy budget, oxidati

80、ve stress and antioxidant in striped hamster acclimated to moderate cold and warm temperatures. J. Therm. Biol. 44, 35–40. </p><p>　　[31] 王燕,范海虹,周倩,謝瑤,袁群芳,汪華僑,姚志彬. 抗氧化劑TA9902對快速老化小鼠-P/8抗氧化及DNA氧化損傷影響的實驗研究[J]

81、. 國際內(nèi)科學雜志. 2007(04) </p><p>　　[32] 廖亞平,張潔,周俊宜,汪華僑. 人端粒酶催化亞單位hTERT基因重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J]. 神經(jīng)解剖學雜志. 2006(06) </p><p>　　[33] 胡志紅,呂和平,劉好,胡詠梅,孟黎,任愛紅,郝春杰. 饑餓對大鼠血液生化指標和端粒酶活性的影響[J]. 中國臨床康復. 2006(44) </

82、p><p>　　[34] 惠毓坤. RNA研究的新進展[J]. 青島大學學報(自然科學版). 2006(02)</p><p>　　[35] 沈陳軍,劉曉平. 細胞衰老機制與腫瘤抑制[J]. 醫(yī)學理論與實踐. 2012(23) </p><p>　　[36]Halliwell, B., Gutteridge, J.M., 1999. Free radicals in

83、 biology and medicine. Oxford, UK: Oxford University Press.</p><p>　　[37]Hannon, J.P., 1960. Effect of prolonged cold exposure on components of the electron transport system. Am. J. Physiol. 198, 740–744. &l

84、t;/p><p>　　[38]Harman, D., 1956. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J. Gerontol. 11, 200-298. </p><p>　　[39]Holloszy, J.O., Smith, E.K., 1986. Longevity of cold exposed

85、rats: a reevaluation of the rate of living theory. J. Appl. Physiol. 61, 1656-1660.</p><p>　　[40]Jakus, P.B., Sipos, K., Kispal, G., Sandor, A., 2002. Opposite regulation of uncoupling protein 1 and uncoupli

86、ng protein 3 in vivo in brown adipose tissue of cold-exposed rats. FEBS Lett. 519, 210-214. </p><p>　　[41]Jansky, L., 1966. Body organ thermogenesis of the rat during exposure to cold and at maximal metabol

87、ic rate. Fed. Proc. 25, 1279-1302.</p><p>　　[42]Je?ek, P., 2002. Possible physiological roles of mitochondrial uncoupling proteins--UCPn. Int. J. Biochem. Cell Biol. 34, 1190-1206. </p><p>　　[4

88、3]Liu, J.S., Wang, D.H., Sun, R.Y., 2003. Metabolism and thermoregulation in striped hamsters (Cricetulus barabensis) from the Northeast of China. Acta Zool. Sinica 49, 451-457. (in Chinese with English summary)</p>