溫州大學(xué)本科畢業(yè)論文終稿

1、<p>　　溫度對(duì)黑線倉鼠抗氧化能力和解偶聯(lián)蛋白表達(dá)的影響</p><p>　　作者：周思思 導(dǎo)師：趙志軍教授</p><p>　?。刂荽髮W(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州，325027）</p><p>　　摘要：根據(jù)自由基的假說，高代謝率應(yīng)該會(huì)增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生。然而，“解偶聯(lián)生存”假說認(rèn)為解偶聯(lián)蛋白（UCPs）可以通過降低線粒體內(nèi)膜的勢(shì)能

2、減少ROS的產(chǎn)生，在這種情況下，代謝速率和ROS的產(chǎn)生之間的關(guān)系將是負(fù)相關(guān)而不是正相關(guān)。在本研究中，我們研究黑線倉鼠能量攝入、氧化應(yīng)激水平、抗氧化活性，以及褐色脂肪組織(BAT)、肝臟、心臟、骨骼肌和大腦解偶聯(lián)蛋白的表達(dá)。將黑線倉鼠馴化于5℃和32.5℃的環(huán)境，而對(duì)照組飼養(yǎng)在室溫下 (21°C)。相對(duì)于對(duì)照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠能量攝入增加了70.7%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠能量攝入

3、減少31.3%。相對(duì)于對(duì)照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的丙二醛（MDA）水平、總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）在BAT中顯著降低。相對(duì)于對(duì)照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的UCP1在BAT中的表達(dá)顯著上升，而在32.5°C環(huán)境中顯著下降。在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP3在骨骼肌的表達(dá)也大幅上升。這些結(jié)果表明，活性氧的產(chǎn)生和代謝率之間的關(guān)系是負(fù)相關(guān)，而不是正

4、相關(guān)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：抗氧化劑；褐色脂肪組織(BAT)；氧化應(yīng)激；黑線倉鼠；溫度；解偶聯(lián)蛋白</p><p>　　Barabensis temperature oxidation resistance and uncoupling protein expression</p><p>　　Author: Zhou Sisi Tutor: Zhao

5、 Zhijun</p><p>　　(College of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou Zhejiang, 325027)</p><p>　　Abstract: In line with living-free radical surmise, higher metabolic rates sh

6、ould subjoin reactive oxygen species (ROS) production. But, the “uncoupling survival” surmise assume that uncoupling proteins (UCPs) by reducing mitochondrial membrane potential to lessen the operation of ROS, in this ca

7、se, the relationship between metabolic rate and ROS production will be a negative correlation between rather than positive. We barabensis into 5 °C and 32.5 °C environment domesticated. The control group</p&

8、gt;<p>　　Key words: Antioxidants; Brown adipose tissue (BAT); Oxidative stress; Striped hamster; Temperature; Uncoupling proteins</p><p><b>　　一、背景介紹</b></p><p>　　21世紀(jì)是生物的世紀(jì)，在這

9、樣的社會(huì)大環(huán)境下，對(duì)于生物體的研究也是越發(fā)的超前，學(xué)者們花大量的時(shí)間和精力去研究前人的實(shí)驗(yàn)以及探究發(fā)現(xiàn)新的結(jié)論。通過不斷的研究來探索生命的現(xiàn)象的本質(zhì)因素。自由基理論認(rèn)為細(xì)胞的代謝過程離不開氧的存在，生物氧化的過程是細(xì)胞獲得能量的過程。自由基理論把衰老與代謝聯(lián)系起來，并認(rèn)為呼吸代謝氧化磷酸化過程中產(chǎn)生過多的自由基對(duì)生物體大分子物質(zhì)的氧化損傷會(huì)加速衰老的進(jìn)程，從而減短了壽命。其中最主要的是活性氧（ROS）水平。因?yàn)楦逺OS水平會(huì)增強(qiáng)氧化來損

10、傷生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA，因此高ROS水平被認(rèn)為是減少預(yù)期壽命的原因。</p><p>　　然而有關(guān)對(duì)鳥類的研究表明，有些物種的代謝率越高其壽命反而越長(zhǎng)。此外，與保持在室溫下的小鼠相比，暴露在相對(duì)低溫情況下的小鼠其代謝較高并且壽命也較長(zhǎng)。對(duì)于代謝率與ROS產(chǎn)生的關(guān)系，在一些研究中發(fā)現(xiàn)這兩者之間是存在著明顯的負(fù)相關(guān)，對(duì)其的一個(gè)可能的解釋是“解偶聯(lián)求生存”假說。該假說提出，解偶聯(lián)蛋白降低ROS的產(chǎn)生，通過降

11、低線粒體內(nèi)膜的電位來實(shí)現(xiàn)的。</p><p>　　UCPs是線粒體膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，迄今為止，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)5 種UCPs：UCP1 主要分布在褐色脂肪組織中；UCP2能在白色脂肪組織、骨骼肌和免疫系統(tǒng)等多種組織中出現(xiàn)；UCP3主要存在于骨骼肌和脂肪組織里。UCP4和UCP5主要在大腦和肝臟中出現(xiàn)。UCP1調(diào)節(jié)機(jī)體產(chǎn)熱，可介導(dǎo)任意食物誘導(dǎo)的產(chǎn)熱。UCP2 因?yàn)榫哂匈|(zhì)子漏功能，而減少了線粒體ROS(活性氧）產(chǎn)物

12、的產(chǎn)生。UCP3 有較強(qiáng)的減少ROS的產(chǎn)生和從線粒體基質(zhì)中輸出脂肪酸陰離子或脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的能力，這樣可以進(jìn)一步減少氧化應(yīng)激等?？偟膩碚f，UCPs能控制線粒體內(nèi)ROS 生成，與氧化應(yīng)激等過程也有密切聯(lián)系。</p><p>　　“解偶聯(lián)求生存”假說預(yù)測(cè)，暴露在寒冷環(huán)境下動(dòng)物的組織應(yīng)該會(huì)降低ROS的產(chǎn)生而解偶聯(lián)蛋白的表達(dá)量會(huì)增高。但是一些研究結(jié)果并不符合解偶聯(lián)生存假說，比如暴露在寒冷環(huán)境下大鼠的肝臟、心臟和骨骼肌中過

13、氧化氫（H2O2）水平增加，暴露在寒冷環(huán)境下短尾田鼠的肝臟和肌肉組織蛋白質(zhì)羰基水平顯著增加。</p><p>　　我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來測(cè)定溫度對(duì)黑線倉鼠的代謝率、氧化應(yīng)激、抗氧化水平和mRNA的表達(dá)的影響。我們翻閱大量的資料，仔細(xì)分析之前相關(guān)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，以及之前實(shí)驗(yàn)的相關(guān)結(jié)論，考究這些之間的相關(guān)性。并且參考之前實(shí)驗(yàn)的相關(guān)原理以及實(shí)驗(yàn)存在的不足之處，為我們自己的實(shí)驗(yàn)做好充分的準(zhǔn)備。先前的一個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，暴露在適度寒冷或氣溫

14、相對(duì)溫和的環(huán)境中，對(duì)黑線倉鼠氧化應(yīng)激和抗氧化水平并沒有造成顯著變化。當(dāng)前研究的目的是測(cè)定溫度對(duì)黑線倉鼠代謝率、氧化應(yīng)激和抗氧化水平的影響，以及與“解偶聯(lián)求生存”假說關(guān)系。</p><p><b>　　二、實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所使用的黑線倉鼠來自于河北省的農(nóng)田 (115°13’E, 38°12’S)，被飼養(yǎng)于溫州大學(xué)。黑線倉鼠

15、被單獨(dú)安置在裝有適量鋸末的塑料籠子里(29 × 15 × 18 cm)，定期更換干凈的鋸末并且清理籠子；保證黑線倉鼠有充足的食物(北京科奧飼料有限公司的標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物食物)和水。實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物都安置在21±1°C溫度的環(huán)境中。</p><p>　　成年倉鼠3.5 到4.5個(gè)月的年齡，隨機(jī)分成3組，低溫馴化組5±1°C (n = 9)和溫暖氣溫馴化組32.5

16、±1°C (n = 8)，對(duì)照組保存在室溫下(21±1°C)(n = 8)，分別飼養(yǎng)6周。所有動(dòng)物的體重和食物攝入量是每?jī)商鞙y(cè)量一次并且及時(shí)記錄數(shù)據(jù)。溫度處理結(jié)束后，對(duì)各個(gè)組的組織樣品進(jìn)行收集與保存。</p><p><b>　　三、實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　3.1總能量攝入(GEI)，消化能量攝入(DEI)和消化率

17、</p><p>　　在實(shí)驗(yàn)的最后兩天對(duì)總能量攝入，消化能量攝入進(jìn)行測(cè)定。將每個(gè)籠子中剩下的食物以及從木榍中挑出黑線倉鼠的糞便分別裝好，并且將黑線倉鼠的糞便置于60°C的烘箱中烘干并且測(cè)量記錄數(shù)據(jù)。食物和糞便的總能量用氧彈量熱計(jì)測(cè)定。</p><p>　　總能量攝入(GEI)，消化能量攝入(DEI)和消化率計(jì)算使用以下方程：</p><p>　　總能量攝入

18、(kJ/d) = [食物攝入量(g/d) ×飼料的干物質(zhì)含量(%) –食物碎屑] ×食物總能量含量(kJ/g)；</p><p>　　消化能量攝入(kJ/d) =總能量攝入– [糞便干質(zhì)量(g/d) ×糞便的總能量含量(kJ/g)]；</p><p>　　消化率 (%) =消化能量攝入/總能量攝入× 100%</p><p>

19、　　3.2氧化應(yīng)激標(biāo)記物和抗氧化酶</p><p>　　實(shí)驗(yàn)材料的提取，采用斷頸法取血，將黑線倉鼠處死，快速取其肩胛間的褐色脂肪組織（BAT），腿部骨骼肌、肝臟、心臟和大腦，并且將這些實(shí)驗(yàn)材料儲(chǔ)在液態(tài)氮中迅速冷凍，以保證實(shí)驗(yàn)材料的活性。組織的處理方式：按照一定的質(zhì)量配比將組織放置到冰冷的0.9%的氯化鈉溶液中進(jìn)行勻漿，然后再放到離心機(jī)中用3000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速對(duì)其進(jìn)行離心，15分鐘后取其上清液保存在適宜的環(huán)境中待后續(xù)實(shí)

20、驗(yàn)分析。用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。使用(南京建成生物工程研究所)生產(chǎn)的試劑測(cè)定過氧化氫（H2O2）水平，并通過對(duì)過氧化氫水平的測(cè)定來分析分析黑線倉鼠的氧化應(yīng)激水平。過氧化氫（405nm）的水平表示為毫摩爾/克蛋白質(zhì)（mmol/g protein）。</p><p>　　丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的指標(biāo)。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，用硫代巴比妥酸（TBA）在532nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，并且產(chǎn)生具有粉紅

21、色的產(chǎn)物。組織MDA水平表示為納摩爾/克蛋白質(zhì)（nmol/mg protein）。</p><p>　　3.3總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性</p><p>　　使用(南京建成生物工程研究所)生產(chǎn)的試劑測(cè)定T-AOC和GSH-活性。在之前的大量預(yù)實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)這些試劑都適用于黑線倉鼠。黑線倉鼠機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使3價(jià)的Fe還原成2價(jià)的Fe，后者可

22、與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)和物，通過比色可測(cè)出其抗氧化能力的高低。在測(cè)定過程中，將待測(cè)液按一定要求處理后用雙蒸水調(diào)零1cm光徑，520nm測(cè)各種管吸光度。定義：在37℃時(shí)，每分鐘每毫克待測(cè)液，使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位。</p><p>　　在GSH-PX活性測(cè)定的基礎(chǔ)上還原谷胱甘肽（GSH），過氧化氫產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（GSSG）和H2O反應(yīng)。GSH與二硫化碳代2硝基苯甲

23、酸（DTNB）反應(yīng)產(chǎn)生2-硝基-5-硫代苯甲酸，可以在412nm處被檢測(cè)的黃色化合物反應(yīng)。</p><p>　　3.4實(shí)時(shí)RT-qPCR的分析</p><p>　　熒光定量PCR分析使用Trizol試劑（TAKARA，中國大連）。提取褐色脂肪組織、肝、心臟、骨骼肌和腦組織總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定的吸光度值確定RNA樣品濃度，然后調(diào)節(jié)到一致水平。取用調(diào)整過濃度的總RNA樣品2μL，用MLV

24、反轉(zhuǎn)錄酶（TAKARA）和oligo（dT18）引物進(jìn)行cDNA的合成，反應(yīng)體系為50μL。用2μL的cDNA樣品作為模板，使用解偶聯(lián)蛋白目的基因的特定引物進(jìn)行PCR反應(yīng)（表1）。</p><p><b>　　3.5統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)</b></p><p>　　數(shù)據(jù)都表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，在SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。體重和食物攝入量的變化檢測(cè)使用重復(fù)

25、測(cè)量方差分析。采用皮爾森相關(guān)系數(shù)分析來檢驗(yàn)H2O2和MDA水平并T-AOC和GSH-Px活性之間的關(guān)系。P<0.05被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著意義。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法處理和分析數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。</p><p><b>　　四、試驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　4.1體重和食物攝入量</p><p>　　3個(gè)小組黑線倉鼠的體重在實(shí)驗(yàn)開始前并

26、沒有顯著的區(qū)別(d0，F(xiàn)2,22 = 0.11，P>0.05， 圖1A)，并且經(jīng)過六個(gè)星期的馴化后，3個(gè)小組黑線倉鼠的體重也沒有顯著的差別(d2，F(xiàn)2,22=0.45，P>0.05；d42，F(xiàn)2,22=0.94，P>0.05)。3個(gè)小組黑線倉鼠的食物攝入量在第一天的時(shí)候沒有顯著的差別(d0，F(xiàn)2,22=0.13，P>0.05，圖1B)，但從第二天開始一直到42天，相對(duì)于對(duì)照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉

27、鼠其食物攝入量明顯增加，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則明顯減少 (d2，F(xiàn)2,22=16.43，P<0.01，d42，F(xiàn)2,22=25.38，P<0.01，圖1B)。</p><p>　　圖1 在不同溫度（5°C，21°C，32.5°C）馴化下黑線倉鼠的體重變化（A）和食物攝入量(B)。數(shù)據(jù)平均值± SE, **P<0.01。</p

28、><p>　　Figure 1. Effect of temperature on body mass (A) and food intake (B) in striped hamsters acclimated to 5°C, 21°C and 32.5°C. Data are means ± SE, **P<0.01.</p><p>　　4.

29、2總能量攝入與消化率</p><p>　　總能量攝入受溫度的影響，相對(duì)于對(duì)照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其總能量攝入增加，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其總能量攝入則減少(F2,22=26.13，P<0.01，post hoc，P<0.05，圖2A)。相對(duì)于對(duì)照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠產(chǎn)生的糞便較多，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則反之(F

30、2,22=35.90，P<0.01，post hoc，P<0.05，圖2B)。3個(gè)小組的消化能量攝入存在著差異，相對(duì)于對(duì)照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其消化能量攝入提高了68.9%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則降低了37.2% (F2,22=20.58，P<0.01，post hoc，P<0.05，圖2C)。然而3個(gè)小組之間的消化率并沒有明顯的差別(F2,22=0.16，P>

31、0.05，圖2D)。</p><p>　　圖2 溫度對(duì)黑線倉鼠總能量攝入（GEI，A），糞便的總能量（GE）（B），消化能量攝入（DEI，C）和消化率（D）的影響。數(shù)據(jù)平均值± SE, **P<0.01。</p><p>　　Figure 2. Effect of temperature on gross energy intake (GEI, A), gross ener

32、gy (GE) of feces (B), digestive energy intake (DEI, C) and digestibility (D) in striped hamsters. Data are means ± SE, **P<0.01.</p><p>　　4.3褐色脂肪組織（BAT）蛋白質(zhì)含量</p><p>　　如表2所示，在5°C環(huán)境中馴

33、化的黑線倉鼠的褐色脂肪組織（BAT）蛋白質(zhì)含量明顯高于對(duì)照組以及在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠。肝臟、心臟、肌肉以及大腦中的蛋白質(zhì)都不受溫度的影響。</p><p><b>　　4.4氧化應(yīng)激</b></p><p>　　在這3個(gè)小組之間,肌肉的過氧化氫（H2O2）的水平都比較低，然而大腦和褐色脂肪組織（BAT）中的過氧化氫（H2O2）水平比較高。無論是

34、在褐色脂肪組織（BAT）(F2,22=2.14，P>0.05)還是肝臟(F2,22=1.50，P>0.05)、心臟(F2,22=1.50，P>0.05)、肌肉(F2,22=1.09，P>0.05)、大腦(F2,22=2.60，P>0.05，圖3A)，溫度對(duì)于過氧化氫（H2O2）的水平的表達(dá)幾乎沒有影響。這3個(gè)小組之間，在肝臟(F2,22=0.77，P>0.05)、心臟(F2,22=0.17，P>

35、0.05)、肌肉(F2,22=1.50，P>0.05)和大腦(F2,22=0.67，P>0.05)，溫度對(duì)于丙二醛(MDA)的水平的表達(dá)并沒有明顯的差別。然而在褐色脂肪組織（BAT）中溫度對(duì)于丙二醛(MDA)水平的表達(dá)有明顯的影響；相對(duì)于對(duì)照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其BAT中丙二醛(MDA)的水平降低了41.4%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則升高了196.4%(F2,22=10.40，P&

36、lt;0.01，post hoc，P<0.05，圖3B)。</p><p>　　圖3 溫度對(duì)H2O2（A）和黑倉鼠丙二醛（MDA）含量（B）的影響。數(shù)據(jù)平均值±SE, ** P <0.01。</p><p>　　Figure 3. Effect of temperature on H2O2 (A) and malonaldehyde (MDA) levels (B)

37、in striped hamsters. Data are means ± SE, **P<0.01. </p><p><b>　　4.5抗氧化水平</b></p><p>　　在這3個(gè)小組之間，總抗氧化能力（T-AOC）的水平在肝臟、心臟、肌肉、大腦中并沒有明顯的差別(liver，F(xiàn)2,22=0.42，P>0.05；heart，F(xiàn)2,22=0

38、.15，P>0.05；muscle，F(xiàn)2,22=1.43，P>0.05；brain tissue，F(xiàn)2,22=0.38，P>0.05；圖4A)。然而在黑線倉鼠的褐色脂肪組織（BAT）中溫度對(duì)于總抗氧化能力（T-AOC）水平有明顯影響；相對(duì)于對(duì)照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的總抗氧化能力（T-AOC）的水平降低了46.6%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則升高了33.4%(F2,22=3.1

39、9，P=0.06)。與其他組織相比較，大腦和心臟的總抗氧化能力（T-AOC）較低。在黑線倉鼠的肝臟(F2,22=0.52，P>0.05)、心臟(F2,22=2.37，P>0.05)和肌肉 (F2,22=0.92，P>0.05，圖4B)中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）水平并沒有受溫度的影響。</p><p>　　圖4 溫度對(duì)黑線倉鼠T-AOC（A）和GSH-Px活性（B）的影響。數(shù)據(jù)平均值&#

40、177;S,E, ** P <0.01。</p><p>　　Figure 4. Effect of temperature on T-AOC (A) and GSH-PX activity (B) in striped hamsters. Data are means ± SE, *P<0.05. </p><p>　　但是在黑線倉鼠的褐色脂肪組織（BAT）中溫度對(duì)

41、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）水平有顯著的影響；相對(duì)于對(duì)照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的總抗氧化能力（T-AOC）的水平降低了39.4%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則升高了41.8%(F2,22=4.87，P<0.05，post hoc，P<0.05)。與對(duì)照組和在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠相比，在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的總抗氧化能力（T-AOC）水平大概降低

42、了40%；但這種差距在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不是很顯著(F2,22=3.31，P=0.06)。雖然在肝臟中過氧化氫（H2O2）、丙二醛(MDA)、 總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）存在明顯的相關(guān)性，但是在褐色脂肪組織（BAT）、心臟、肌肉和大腦中并沒有發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)性(表3)。</p><p>　　4.6 UCP mRNA的表達(dá)</p><p>　　在褐色脂肪組織（BAT

43、）中，UCP1 mRNA的表達(dá)明顯受溫度的影響，并且在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其表達(dá)明顯高于對(duì)照組和在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠(F2,22=7.92，P<0.01，post hoc，P<0.05)；對(duì)照組與在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠之間并沒有明顯的差別(post hoc，P>0.05，圖5)。在肌肉中UCP3 mRNA的表達(dá)明顯受溫度的影響，并且在5°C環(huán)境中馴

44、化的黑線倉鼠中的表達(dá)是對(duì)照組的4.48倍(F2,22=17.00，P<0.01，post hoc，P<0.05)。溫度對(duì)于UCP2在肝臟中的表達(dá)并沒有影響(F2,22=1.88，P>0.05)；溫度對(duì)于UCP3在心臟中的表達(dá)也沒有影響(F2,22=2.20，P>0.05)；以及溫度對(duì)于UCP2、UCP4、UCP5在大腦的表達(dá)中也沒有影響(UCP2，F(xiàn)2,22=0.36，P>0.05，UCP4，F(xiàn)2,22=0

45、.25，P>0.05，UCP5，F(xiàn)2,22=0.94，P>0.05，圖5)。</p><p>　　圖5 溫度對(duì)黑線倉鼠解偶聯(lián)蛋白（UCP）mRNA在褐色脂肪組織（BAT）、肝臟、心臟、肌肉以及大腦中表達(dá)的影響。數(shù)據(jù)平均值±S,E, ** P <0.01。</p><p>　　Figure 5. Effect of temperature on uncouplin

46、g protein (UCP) mRNA expression in brown adipose tissue (BAT), and liver, heart, muscle and brain tissue, in striped hamsters. Data are means ± SE, **P<0.01. </p><p><b>　　五、實(shí)驗(yàn)討論</b></p

47、><p>　　環(huán)境溫度是影響小型哺乳動(dòng)物的能量收支的最重要的因素之一。我們的研究結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組(21±1°C)在5±1°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其總能量攝入增加，而在32.5±1°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其總能量攝入則減少。這個(gè)結(jié)果與之前對(duì)黑線倉鼠的研究的結(jié)果是相一致；并且表明黑線倉鼠在寒冷的環(huán)境條件下其能量代謝增加，而在炎熱的環(huán)境條件下能量代謝降低。&

48、lt;/p><p>　　褐色脂肪組織（BAT）是中小型哺乳動(dòng)物在寒冷的環(huán)境中參與非顫抖性產(chǎn)熱的重要組織，非顫抖性產(chǎn)熱是一種不涉及肌肉活動(dòng)而釋放的化學(xué)能的熱量，在能量代謝過程中起到非常重要的作用。這種產(chǎn)熱主要受交感神經(jīng)支配和甲狀腺激素的調(diào)控。就像布氏田鼠(Microtus brandti)在5℃環(huán)境下馴化一個(gè)月的時(shí)間，其在靜止?fàn)顟B(tài)下的代謝率比在25℃恒溫狀態(tài)下增長(zhǎng)34%，并且其非顫抖性產(chǎn)熱增加了91%之多；阿拉斯加紅背

49、鼠平(Clethrionomys rutilus)冬季的非顫抖性產(chǎn)熱是基礎(chǔ)代謝產(chǎn)熱的10倍，在根田鼠(Microtus oeconomus)是3.7倍。在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到相對(duì)于對(duì)照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的蛋白質(zhì)含量升高了53.9%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則降低了36.2%。丙二醛(MDA)脂質(zhì)過氧化的次級(jí)產(chǎn)物在2個(gè)小組中含量發(fā)生了明顯的變化，相對(duì)于對(duì)照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠降

50、低41.1%，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則升高了196.4%；由此可知丙二醛(MDA)和能量代謝呈負(fù)相關(guān)。</p><p>　　類似的差異也存在于總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的表達(dá)水平。先前的研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的脂質(zhì)過氧化物、超氧化物歧化酶水平和T-AOC水平，分別為27.9％、29.9％和48.5％。這個(gè)結(jié)果與（代謝

51、率與ROS的產(chǎn)生存在著負(fù)相關(guān)）這一假設(shè)相一致。</p><p>　　哺乳動(dòng)物通過增加能量代謝來適應(yīng)寒冷的環(huán)境，剛開始時(shí)迅立即過骨骼肌的顫抖性產(chǎn)熱來進(jìn)行能量代謝的，隨后由褐色脂肪組織（BAT）通過非顫抖性產(chǎn)熱來維持能量代謝，而哺乳動(dòng)物在炎熱的環(huán)境下則是以相反的方式進(jìn)行能量代謝的。雖然骨骼肌在寒冷的環(huán)境下產(chǎn)熱顯著增加，但是骨骼肌的產(chǎn)熱是屬于顫抖產(chǎn)熱而不是非顫抖產(chǎn)熱；事實(shí)證明骨骼肌在非顫抖產(chǎn)熱中所扮演的是一個(gè)次要的角色

52、。然而，我們的研究結(jié)果顯示，無論是ROS的產(chǎn)生通過過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）水平表明，還是抗氧化劑（T-AOC、GSH-PX）的水平都不受到溫度的影響。在之前的研究中并沒有發(fā)現(xiàn)置于寒冷溫度(15°C)或保持在室溫（23°C）的條件下，倉鼠的氧化應(yīng)激和抗氧性存在差異。相反，在另一項(xiàng)研究中確實(shí)檢測(cè)到短尾場(chǎng)田鼠骨骼肌的過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的含量增加。此外，在長(zhǎng)期受凍的情況下，短尾場(chǎng)田鼠的過氧化氫酶活性

53、先增加，然后再回到基礎(chǔ)水平。在這項(xiàng)研究中， ROS和抗氧化活性穩(wěn)定性的機(jī)制還不清楚。</p><p>　　與褐色脂肪組織（BAT）和骨骼肌相比，氧化應(yīng)激和抗氧化水平在黑線倉鼠的肝臟、心臟、大腦并沒有因?yàn)闇囟榷艿矫黠@的影響，表明在這些器官中氧化應(yīng)激和抗氧化活性之間存在著相關(guān)性。有人提出動(dòng)物具有各種防止氧化應(yīng)激的機(jī)制，并且這樣的抗氧化防御系統(tǒng)的正確調(diào)節(jié)能保持氧化與抗氧化的平衡。各種研究已經(jīng)表明，為了以應(yīng)付ROS的產(chǎn)

54、生，抗氧化防御系統(tǒng)可以被刺激而產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答措施。</p><p>　　“解偶聯(lián)求生存”假說表明，解偶聯(lián)蛋白降低線粒體膜電位，從而減少活性氧的產(chǎn)生。UCP1在BAT中完全表達(dá)，在適應(yīng)性產(chǎn)熱的過程中起到重要的作用。正如預(yù)期的那樣，我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP1在BAT中的表達(dá)顯著增加，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則降低，這個(gè)結(jié)果與在能量代謝中觀察到的變化是一

55、致的；但與預(yù)期結(jié)果不一致的是MDA、T-AOC、GSH-PX，相對(duì)于對(duì)照組在32.5℃環(huán)境中馴化的黑線倉鼠這些指標(biāo)顯著增加，而在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則反之。</p><p>　　與UCP1相比，UCP3的表達(dá)主要在骨骼肌中；UCP3的主要功能可能不是能量代謝的調(diào)節(jié)。相對(duì)于對(duì)照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP3在肌肉中的表達(dá)顯著增加。一般情況下，在寒冷環(huán)境中馴化的倉鼠其BAT和骨骼

56、肌會(huì)顯示出氧化消耗與線粒體能量代謝增加的結(jié)果。</p><p>　　有人提出，BAT極其容易受到氧化應(yīng)激，這主要是由于其高濃度的線粒體以及高產(chǎn)熱能力，由此增加ROS產(chǎn)生。在寒冷環(huán)境馴化下的骨骼肌由于其肥大也可能容易誘使氧化應(yīng)激。然而，包括黑線倉鼠在內(nèi)的處于寒冷環(huán)境中的動(dòng)物，它們的ROS的產(chǎn)生水平并沒有增加，并且在整個(gè)生物個(gè)體或組織中并沒有發(fā)現(xiàn)ROS的產(chǎn)生水平與代謝率之間存在正比的關(guān)系，這與“解偶聯(lián)求生存”假說的觀

57、點(diǎn)一致。</p><p>　　一些研究已經(jīng)證實(shí)解偶聯(lián)蛋白特別是UCP3會(huì)降低在骨骼肌中的線粒體ROS的產(chǎn)生水平。不幸的是，到目前為止在生物個(gè)體或細(xì)胞水平并沒有大量的證據(jù)支持這個(gè)假說。我們發(fā)現(xiàn)UCP3在骨骼肌中表達(dá)的變化，尤其是UCP1在BAT中表達(dá)的變化，與之前在氧化應(yīng)激和抗氧化性研究的方向是相反的。雖然這些發(fā)現(xiàn)符合 “解偶聯(lián)求生存”假說在整個(gè)生物體和組織的水平，但是其他的影響因素對(duì)于氧化應(yīng)激的影響不能排除在外。

58、</p><p><b>　　六、實(shí)驗(yàn)結(jié)論</b></p><p>　　相對(duì)于對(duì)照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的能量攝入提高，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的能量攝入則降低。這表明在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠和在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠它們的代謝率顯著不同。相對(duì)于對(duì)照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的

59、MDA、T-AOC、 GSH-PX水平明顯下降，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則上升，表明氧化應(yīng)激和抗氧化性與代謝之間呈負(fù)相關(guān)。這既不是受ROS產(chǎn)生的影響，也不受存在于骨骼肌、肝臟、心臟或腦組織中的抗氧化劑的影響，而是受溫度的影響。這表明氧化應(yīng)激和抗氧化性之間存在著一種相關(guān)性，這與抗氧化防御系統(tǒng)在防止氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮著重要的作用這一想法是一致的。</p><p>　　相對(duì)于對(duì)照組，在5°

60、;C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP1在BAT中的表達(dá)明顯升高，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP1在BAT中的表達(dá)明顯降低。這一趨勢(shì)與溫度引起能量代謝的變化是一致的，但是與溫度引起氧化應(yīng)激的變化是相反的。另外相對(duì)于對(duì)照組，在5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其UCP3在骨骼肌中的表達(dá)明顯上升，而在32.5°C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則反之。這些結(jié)果表明ROS產(chǎn)生水平與代謝率之間并沒有存在著正相關(guān)性，因此在生物個(gè)

61、體水平和組織水平上是存在證明“解偶聯(lián)求生存”假說的證據(jù)。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　在此我衷心地感謝趙志軍老師對(duì)在畢業(yè)論文實(shí)驗(yàn)過程中以及在寫作上的悉心指導(dǎo)。同時(shí)也要感謝曹麗麗、徐維東、鄭國梟和林江濤同學(xué)在實(shí)驗(yàn)中給予的協(xié)助！</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p>

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