蘿卜鎘脅迫響應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus L)為起源于我國的一種重要的根菜類蔬菜作物。重金屬是蔬菜生產(chǎn)中最隱蔽、最難控制的污染源之一，鎘(Cd)是生物毒性極強(qiáng)的重金屬之一，過量的鎘進(jìn)入環(huán)境參與水體-土壤-生物系統(tǒng)循環(huán)，并通過食物鏈而被動(dòng)物和人體攝入，嚴(yán)重威脅人體健康。隨著環(huán)境污染問題的日益突出，鎘污染已嚴(yán)重影響蘿卜的安全生產(chǎn)。目前，植物對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)機(jī)理已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重要課題。蛋白質(zhì)組學(xué)在后基因組時(shí)代發(fā)揮著越來越重要的作用。雙向電

2、泳(2-DE)技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)的支撐之一，被應(yīng)用于生物學(xué)研究的許多領(lǐng)域。目前在蛋白質(zhì)水平上闡述蘿卜對(duì)鎘脅迫響應(yīng)機(jī)理的研究還非常少。
　　 本研究以蘿卜高代自交系‘NAU-RG’為材料，首先對(duì)蘿卜蛋白質(zhì)提取方法進(jìn)行篩選優(yōu)化、建立起蘿卜蛋白質(zhì)提取體系，為蘿卜蛋白質(zhì)組學(xué)的深入開展奠定了基礎(chǔ)，利用雙向電泳技術(shù)研究了蘿卜葉片和根組織在不同濃度的鎘脅迫下的蛋白質(zhì)差異表達(dá)情況，并對(duì)根組織中差異非常顯著的點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定與功能分析，利用半定量

3、RT-PCR技術(shù)，對(duì)部分鎘脅迫響應(yīng)基因進(jìn)行了克隆與轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析，為揭示蘿卜鎘脅迫響應(yīng)機(jī)理提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：⑴將5種在植物蛋白質(zhì)提取中常用的方法應(yīng)用于蘿卜葉片的蛋白質(zhì)提取，并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，建立了蘿卜葉片與根組織的蛋白質(zhì)提取技術(shù)體系：葉片蛋白質(zhì)提取方法為Tris-HCl/TCA-丙酮法；利用正交實(shí)驗(yàn)方法對(duì)根組織蛋白質(zhì)提取方法-改良的酚提取法進(jìn)行了優(yōu)化。⑵利用營養(yǎng)液水培的方式對(duì)蘿卜幼苗進(jìn)行重金屬鎘處理，處理濃度為0mg·

4、L-1CdCl2.2.5H2O，50mg·L-1CdCl2·2.5H2O，100mg·L-1CdCl2·2.5H2O。獲取實(shí)驗(yàn)材料，利用雙向電泳技術(shù)分析鎘脅迫條件下蘿卜葉片的蛋白質(zhì)組的響應(yīng)情況，在蘿卜葉片中共檢測到10個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中有1個(gè)被Cd脅迫條件誘導(dǎo)表達(dá)，2個(gè)上調(diào)表達(dá)，5個(gè)下調(diào)表達(dá)，1個(gè)消失，1個(gè)在低濃度處理時(shí)下調(diào)，高濃度時(shí)上調(diào)。在蘿卜根組織中共檢測到31個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF/TOF成功鑒定23個(gè)

5、蛋白點(diǎn)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索表明，細(xì)胞防衛(wèi)相關(guān)蛋白占差異表達(dá)的蛋白質(zhì)的56.5％，細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白占30.4％，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白占8.7％。⑶根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，選擇3個(gè)已知功能的差異蛋白質(zhì)--蛋白質(zhì)二硫化異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerase)、磷酸甘油酸酯激酶(Phosphoglycerate kinase)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)，利用半定量RT-PCR對(duì)編碼這三個(gè)蛋白的基因(Rs