蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

1、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),李 明臨床生物化學(xué)教研室,一、前言,人類(lèi)基因組序列圖譜初稿的公布，在揭示基因組的精細(xì)結(jié)構(gòu)的同時(shí)，也凸現(xiàn)出基因數(shù)量有限性和基因結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性，這與生命現(xiàn)象的復(fù)雜性和多變性之間存在著巨大反差。這種反差促使人們認(rèn)識(shí)到：基因只是遺傳信息的載體。要研究生命現(xiàn)象，闡釋生命活動(dòng)的規(guī)律，只了解基因組的結(jié)構(gòu)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，這也使得人們對(duì)于生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者——蛋白質(zhì)的重要性有了更深刻的理解，因此，對(duì)蛋白質(zhì)的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、相互

2、關(guān)系和生物學(xué)功能進(jìn)行全面和深入的研究，成為生命科學(xué)研究的追切需要和重要任,務(wù)。一個(gè)以“蛋白質(zhì)組” （proteome）為研究重點(diǎn)的生命科學(xué)新時(shí)代已悄然到來(lái)。二、蛋白質(zhì)組學(xué)的概念及其發(fā)展史隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，蛋白質(zhì)組研究越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者的密切關(guān)注，并以其特有的思維方法和技術(shù)手段在解決生物學(xué)重大問(wèn)題上開(kāi)始顯示出強(qiáng)大威力?？梢韵嘈牛S著蛋白質(zhì)組研究的不斷深入，它在揭示生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡、分化、信號(hào)傳導(dǎo)和代謝調(diào)控等生命活動(dòng)的規(guī)律

3、上將會(huì)有新突破，對(duì)探討重大疾病的發(fā)生機(jī)制、疾病的診斷防治和新藥開(kāi)發(fā)將提供重要的理論基礎(chǔ)。,（一）蛋白質(zhì)組學(xué)的概念“蛋白質(zhì)組”一詞的英文是PROTEOME，它由PROTEins和genOME兩個(gè)詞組合而成，意思是proteins expressed by a genome，即基因組表達(dá)的蛋白質(zhì)。廣義上講，蛋白質(zhì)組（proteome）是指“一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”。它是對(duì)應(yīng)于一個(gè)基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，而不是局限

4、于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。由于同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同，即使是同一細(xì)胞，在不同的發(fā)育階段、不同的生理?xiàng)l件甚至不同的環(huán)境影響下，其蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)也不盡相同。因此，蛋白質(zhì)組是一個(gè)在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體。,蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門(mén)新興學(xué)科，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，提示蛋白質(zhì)功能與細(xì)

5、胞生命活動(dòng)規(guī)律。要對(duì)“全部蛋白質(zhì)”進(jìn)行研究是非常困難的，“功能蛋白組學(xué)（functional proteomics）”的提出解決了這一難題，其研究對(duì)象是功能蛋白質(zhì)組，即細(xì)胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的所有蛋白質(zhì)，它是介于對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)化學(xué)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組學(xué)研究之間的層次，并把目標(biāo)定位在蛋白質(zhì),群體上，這一群體可大可小，從局部入手研究蛋白質(zhì)組的各個(gè)功能亞群體，以便將來(lái)把多個(gè)亞群體組合起來(lái)，逐步描繪出接近

6、于生命細(xì)胞的“全部蛋白質(zhì)”的蛋白質(zhì)組圖譜。功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究為實(shí)際運(yùn)作帶來(lái)方便，人們可利用現(xiàn)有的技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組這一極限群體中的各蛋白質(zhì)功能亞群，從理論和技術(shù)上使以“全部蛋白質(zhì)”為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組學(xué)這一抽象概念具體化，使研究者們更易于從時(shí)、空、量效方面動(dòng)態(tài)、整體、深入地研究生理狀態(tài)下同一組織細(xì)胞在不同發(fā)育階段或同一組織細(xì)胞在不同個(gè)體間或同一基因組在不同組織細(xì)胞間，以及病理情況下同一,疾病的不同發(fā)展階段的蛋白質(zhì)表達(dá)模式和功能模式

7、的變化，揭示一些重要的生命現(xiàn)象和一些重大疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。狹義上講，蛋白質(zhì)組是指不同條件下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化，比如正常細(xì)胞和異常細(xì)胞之間，細(xì)胞用藥和不用藥之間的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差別，這在疾病研究和藥物篩選上很有意義，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)在應(yīng)用研究方面最具前景的領(lǐng)域。當(dāng)然，隨著蛋白質(zhì)組研究的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)的概念也將不斷發(fā)展和深化。（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展20世紀(jì)中期以來(lái)，隨著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和蛋白質(zhì)空,間結(jié)構(gòu)的X射線解析，

8、開(kāi)始了分子生物學(xué)時(shí)代，對(duì)遺傳信息載體DNA和生命功能的主要體現(xiàn)者蛋白質(zhì)的研究，成為生命科學(xué)研究的主要內(nèi)容。20世紀(jì)90年代初期，美國(guó)生物學(xué)家提出并實(shí)施了人類(lèi)基因組計(jì)劃，經(jīng)過(guò)各國(guó)科學(xué)家多年的努力，人類(lèi)基因組計(jì)劃取得了巨大成績(jī)，一些低等生物的DNA序列已被闡明，人類(lèi)DNA序列的框架圖已經(jīng)測(cè)定，迄今已測(cè)定的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）幾乎覆蓋了人類(lèi)所有基因。在這樣的形勢(shì)下，生命科學(xué)已進(jìn)入了后基因組時(shí)代。在后基因組時(shí)代，生物學(xué)研究的重點(diǎn)已從揭示生物所

9、有遺傳信息轉(zhuǎn)移到在整體水平上對(duì)生物功能的研究。這種轉(zhuǎn)向,的第一個(gè)標(biāo)志就是產(chǎn)生了一門(mén)稱(chēng)為功能基因組學(xué)的新學(xué)科。功能基因組學(xué)的主要任務(wù)是解析和綜合大量的遺傳信息，闡明基因遺傳信息與人類(lèi)生命活動(dòng)之間的聯(lián)系?；虻墓δ苁峭ㄟ^(guò)其產(chǎn)物mRNA和蛋白質(zhì)來(lái)體現(xiàn)的。近年來(lái)利用基因表達(dá)連續(xù)分析（SAGE）、微陣列（microarray）和DNA芯片（chip）等新技術(shù)研究mRNA水平上的基因活動(dòng)規(guī)律取得了較大進(jìn)展。但mRNA水平的基因表達(dá)狀況并不能完全代表

10、蛋白質(zhì)水平的狀況， mRNA與蛋白質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)僅為0.4-0.5，蛋白質(zhì)才是生命功能的主要執(zhí)行者，由于它存在著翻譯后的加工修飾、轉(zhuǎn)移定位、構(gòu)象變化、,蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)與其他生物大分子相互作用等自身特點(diǎn)，因此難以從DNA和mRNA水平得到解答，從而促使人們從組織或細(xì)胞內(nèi)整體蛋白質(zhì)的組成、表達(dá)和功能模式去研究生命活動(dòng)的基本規(guī)律。自1994年澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins首先提出與基因組相對(duì)應(yīng)的“蛋白質(zhì)組”概念，并開(kāi)始從

11、整體蛋白質(zhì)水平研究生命現(xiàn)象以來(lái)，蛋白質(zhì)組研究在國(guó)際上進(jìn)展十分迅速，不論是基礎(chǔ)理論，還是技術(shù)方法，都在不斷地進(jìn)步和完善。許多種細(xì)胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)建立，相應(yīng)的國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)站也層不出窮，眾多的制藥廠和公司在巨大財(cái)力的支持和商業(yè)利益的誘惑下,紛紛加入蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組研究的文章每年成倍增長(zhǎng)。1996年澳大利亞建立了世界上第一個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心（Australia proteome analysis facility, APAF）。在

12、政府部門(mén)的大力支持下，丹麥、加拿大也先后成立了蛋白質(zhì)組研究中心。1997年召開(kāi)了第一次國(guó)際“蛋白質(zhì)組學(xué)”會(huì)議，預(yù)測(cè)21世紀(jì)生命科學(xué)的重心將從基因組學(xué)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)組學(xué)，為生命科學(xué)和醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的研究帶來(lái)了新的生機(jī)。1998年在美國(guó)舊金山召開(kāi)了第二屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議，參加者大都來(lái)自各大藥廠和公司。1999年1月在英國(guó)倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會(huì)議。1999年5月在日本召開(kāi)的,國(guó)際電泳會(huì)議上，約1/3的文章與蛋白質(zhì)組有關(guān)。目前，中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基

13、金委員會(huì)關(guān)于蛋白質(zhì)組重大項(xiàng)目的研究已啟動(dòng)，腫瘤蛋白質(zhì)組研究也已列入我國(guó)973和863項(xiàng)目。中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所、中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、湖南師范大學(xué)、中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院等單位相繼開(kāi)展了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。1998年在中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國(guó)性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會(huì)，并在此基礎(chǔ)上，提出了功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究戰(zhàn)略?？梢韵嘈旁诓痪玫膶?lái)，“人類(lèi)蛋白質(zhì)組計(jì)劃”必將啟動(dòng)，而且規(guī)模比“人類(lèi)基因組計(jì)劃”更大，產(chǎn)生的影響更久遠(yuǎn)，將是繼基因

14、組研究之后的又一“大科學(xué)”。,三、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)方法概述蛋白質(zhì)組學(xué)主要涉及有兩方面的內(nèi)容：一是研究蛋白質(zhì)組的組成成份，即蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究；二是研究蛋白質(zhì)組的功能，即蛋白質(zhì)組功能模式的研究，目前主要集中在蛋白質(zhì)組表達(dá)模式方面。蛋白質(zhì)組表達(dá)模式研究的支撐技術(shù)主要有雙向凝膠電泳和以質(zhì)譜為代表的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)及生物信息學(xué)。雙向凝膠電泳（2-DE）技術(shù)于1975年由O’Farrell等創(chuàng)立，其原理是第一向在高壓電場(chǎng)下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行等電聚焦

15、（IEF），再在第一向垂直方向上進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯,酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。等電聚焦電泳由最初的載體兩性電解質(zhì)管膠電泳發(fā)展到目前的固相pH梯度（IPG）凝膠電泳，由于采用了IPG膠條從而避免了因載體兩性電解質(zhì)引起的聚焦時(shí)間延長(zhǎng)、pH梯度不穩(wěn)定、陰極漂移等現(xiàn)象。目前IPG雙向凝膠電泳的分辨率達(dá)到了1萬(wàn)多個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，但對(duì)過(guò)于偏酸或偏堿、高分子質(zhì)量、極微量蛋白質(zhì)以及難溶性蛋白質(zhì)的分辨仍感困難。由于雙向凝膠電泳對(duì)批量蛋白質(zhì)可實(shí)現(xiàn)

16、一次性分離，具有高靈敏度的高分辨率、便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理、可以很好地與質(zhì)譜分析等鑒定方法匹配的優(yōu)點(diǎn)，因而成為目前分離蛋白質(zhì)組分的核心技術(shù)。此外，雙向高效柱層析、毛細(xì)管電泳也是分,離蛋白質(zhì)組分的有效技術(shù)。對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定是蛋白質(zhì)表達(dá)模式研究的又一重要內(nèi)容，通常采用的有蛋白質(zhì)微量測(cè)序、氨基酸組成分析等傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)鑒定方法，但這些方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不易實(shí)現(xiàn)高通量分析。因此一種新的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)——質(zhì)譜（MS）法受到了人們的重視和應(yīng)

17、用，其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來(lái)分離并確定樣品的分子質(zhì)量。質(zhì)譜在20世紀(jì)初就已經(jīng)產(chǎn)生，多用于無(wú)機(jī)物或小分子有機(jī)物的鑒定，直到80年代末隨著“軟電離”技術(shù)的出現(xiàn)而進(jìn)入生物大分子（如蛋白質(zhì)）的鑒,定領(lǐng)域。所謂“軟電離”是指樣品分子電離時(shí)保留整個(gè)分子的完整性，不會(huì)形成碎片離子。軟電離質(zhì)譜用于大分子的鑒定，主要有以下特點(diǎn)：靈敏度高、快速、能同時(shí)提供樣品的精確分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息、既可定性又可定量、并能有效地與各

18、種色譜聯(lián)用，如用HPLC/MS來(lái)分析復(fù)雜體系。目前用于蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜主要有兩種：電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）。但要精確鑒定某一蛋白質(zhì)通常還得聯(lián)合幾種鑒定技術(shù)。最近，國(guó)處建立了一種將MALDI-MS技術(shù)直接用于組織切片或印片的方法（Pierre C et al, 1999），即組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù)，取得了較,滿(mǎn)意的結(jié)果。生物信息學(xué)是隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃、計(jì)算機(jī)技術(shù)、

19、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展而誕生的一門(mén)新興學(xué)科，是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)重要的技術(shù)平臺(tái)。生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)不可缺少的部分，其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的研究有兩個(gè)重要應(yīng)用：一是構(gòu)建和分析雙向凝膠電泳圖譜，二是數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索與構(gòu)建。目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫(kù)是NRDB和dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)。NRDB由SWISS-PROT和GENPETP等幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)組成。蛋白質(zhì)功能模式的研究是蛋白質(zhì)組研究的最終目標(biāo)，其主要研究目標(biāo)是要揭示蛋白質(zhì)組成員間的相互作用、相互協(xié),調(diào)的關(guān)系

20、。并深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系。目前，蛋白質(zhì)功能模式研究的主要技術(shù)有酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示、生物傳感芯片質(zhì)譜、基因工程和蛋白質(zhì)工程中的突變表達(dá)分析、磁共振成像、X線晶體衍射分析、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等。四、蛋白質(zhì)樣品制備技術(shù)蛋白質(zhì)組是指某種細(xì)胞或組織中基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。實(shí)踐中更多的情況是研究功能蛋白質(zhì)組，即細(xì)胞在某一特定階段或某一生理狀態(tài)下基因表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)組研究是對(duì)不

21、同時(shí)間和不同空間發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)整體的研究，因此如何從細(xì)胞組織中盡可能完整地將蛋白質(zhì)以溶解狀態(tài)提取出來(lái)，是蛋白質(zhì)組研究的首要步驟。,（一）蛋白質(zhì)制備常用技術(shù)在蛋白質(zhì)制備中主要包括細(xì)胞組織的破碎裂解；蛋白質(zhì)增溶溶解以破壞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間，蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)之間的共價(jià)與非共價(jià)相互作用；變性及還原；去除非蛋白質(zhì)組分，如核酸、脂類(lèi)等。為了達(dá)到這一目的，在蛋白質(zhì)制備過(guò)程中需使用表面活性劑、還原劑及離液劑。離液劑、還原劑及表面活性劑的選擇

22、（1）離液劑（chaotropes）最普遍的離液劑是脲，脲的作用主要是改變或破壞氫鍵等次級(jí)鍵的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)的肽鏈伸展開(kāi)來(lái)，充分暴露疏水,中心，降低接近疏水殘基的能量域，但通常當(dāng)脲和表面活性劑CHAPS聯(lián)合使用時(shí)，會(huì)使某些蛋白質(zhì)吸附在固相pH梯度凝膠中而丟失。因此，近年常將一種新的離液劑硫脲和脲聯(lián)合使用，以增加蛋白質(zhì)在IPG膠中的溶解性。硫脲的使用大大改善了蛋白質(zhì)的溶解性能，特別是改善了膜蛋白的提取。但硫脲在水中溶解性差，需用高濃度的

23、脲助溶。（2）表面活性劑蛋白質(zhì)在去折疊后，會(huì)暴露出大量疏水性殘基，因此常需使用表面活性劑破壞蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用。常使用的表面活性劑有陰離子去污劑SDS，非離子去污劑,Triton X-100和NP-40，兩性離子去污劑CHAPS等。（3）還原劑在蛋白質(zhì)制備中常需要斷裂蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，以利于肽鏈的分離，因此樣品還原的好壞也會(huì)影響到蛋白質(zhì)的分離效果。一般使用β-疏基乙醇和二硫蘇糖醇（DTT）作還原劑，但DTT本身帶有

24、電荷，在等電聚焦時(shí)，常常會(huì)遷移到pH范圍以外，從而使某些蛋白質(zhì)的二硫鍵重新配對(duì)，使溶解度降低而重新沉淀下來(lái)。采用非離子型還原劑如三丁基膦（TBP）可大大增加蛋白質(zhì)的溶解性，并可幫助蛋白質(zhì)從第一向轉(zhuǎn)移到第二向。,（二）腫瘤樣品蛋白質(zhì)的抽提腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要是為了建立腫瘤細(xì)胞和組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜及研究腫瘤細(xì)胞和組織與正常細(xì)胞和組織之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，以期發(fā)現(xiàn)用于腫瘤診斷、預(yù)后和治療的分子標(biāo)志物。如何制備優(yōu)良的腫瘤樣品蛋白質(zhì)是腫瘤蛋白

25、質(zhì)組學(xué)研究的首要問(wèn)題。由于蛋白質(zhì)在類(lèi)型和特性上均存在著很大的差異，因此不同的蛋白質(zhì)樣品的抽提方法也各異。但無(wú)論何種抽提方法最終都是使蛋白質(zhì)能充分溶解、解聚、變性和還原，使期能得到更好的分離和鑒定。常用的組織裂解液配方（用于雙向電泳）為9.8mol/L脲、,2%（W/V）NP-40、1%（V/V）TritonX-100、100mmol/L DTT、0.5mmol/L PMSF、4% CHAPS、0.5mmol/L EDTA、40mmol

26、/L Tris、1μg/mL aprotinin、10μg/mL chymostatin、2%（V/V）pharmalyte。腫瘤組織蛋白質(zhì)抽提的一般步驟：（1）將已經(jīng)處理過(guò)的樣品從-80℃冰箱中取出，各自稱(chēng)重（濕重30-80mg），于液氮中充分研磨至粉末狀。（2）組織研磨后置于400μL裂解液中，充分旋渦混勻。（3）懸液置于37 ℃孵育1h。（4）懸液取出后再充分旋渦，于低溫冷凍離心機(jī)12000g、,離心15min（溫度控制

27、在8-12℃）。（5）吸取上清液即為組織的總蛋白質(zhì)。（6）進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)，確定上樣量。五、蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳分離技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)主要由雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）、微量蛋白質(zhì)化學(xué)及生物信息學(xué)三個(gè)部分組成。1975年O’Farrell等建立了雙向凝膠電泳技術(shù)（O‘Farrell, 1975），第一向是等電聚焦（isoelectric focusing, I

28、EF），第二向是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。第一向的IEF電泳，經(jīng)歷了從,最初的載體兩性電解質(zhì)pH 梯度等電聚焦電泳到20世紀(jì)80年代固相pH梯度等電聚焦電泳（immobilized pH gradient, IPG）的發(fā)展過(guò)程。盡管傳統(tǒng)的O’Farrell系統(tǒng)雙向電泳有較高的分辨率，曾報(bào)道可以分離到約1000多種蛋白質(zhì)，但這種系統(tǒng)仍存在不少問(wèn)題，如重復(fù)性差，特別是第一向因陰極漂移而丟失堿性蛋白質(zhì)，載體兩性電解質(zhì)pH梯

29、度不穩(wěn)定，受電場(chǎng)和時(shí)間影響大，脲在低溫下容易在毛細(xì)管中析出影響聚合及蛋白質(zhì)分離等。1982年由Bjellgvist等發(fā)展并完善了固相pH梯度等電聚焦技術(shù)，Goeg（1997）等成功地將之應(yīng)用于雙向電泳的第一向分離，從而解決了以上,存在的問(wèn)題，大大提高了雙向電泳的分辨率及重復(fù)性。在一張雙向電泳圖譜上已可以分離到近萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，這是目前分離蛋白質(zhì)的最好方法，因此已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究不可缺少的核心技術(shù)。目前Pharmacia公司推出2DE-M

30、S自動(dòng)化系統(tǒng)以及大通量的2-DE技術(shù)，在第二向電泳中發(fā)展了6-12塊膠同時(shí)電泳的Ettan系統(tǒng)，從而加快電泳速度和電泳的重復(fù)性，并推出了自動(dòng)取點(diǎn)、酶解，以使2-DE膠上所有樣品的酶解和轉(zhuǎn)移能平行化進(jìn)行。亞蛋白質(zhì)組陣列重疊群技術(shù)：由于蛋白質(zhì)溶解性、豐度等的差異，要在單一2-D膠上展現(xiàn)所有的蛋白質(zhì)仍存在困難。,為了研究整個(gè)蛋白質(zhì)組，必須采用亞蛋白質(zhì)組陣列策略。該策略以重疊群技術(shù)為基礎(chǔ)。即首先將組織細(xì)胞分成不同的亞細(xì)胞組分或順序分級(jí)抽提具有

31、不同溶解度范圍的蛋白質(zhì)亞群，用寬pH范圍的2-D膠檢測(cè)樣品的復(fù)雜性，再用一套具有交叉重疊的高分辨、高上樣量的窄pH范圍IPG等電聚焦和用不同濃度的SDS-PAGE膠進(jìn)行分離，最后在計(jì)算機(jī)上根據(jù)重疊群的原理進(jìn)行拼接和分析，從而顯示蛋白質(zhì)組中幾乎所有的組分，這類(lèi)方法能有效分離低豐度蛋白質(zhì)，pI與分子質(zhì)量非常接近的蛋白質(zhì)，并能大致確定分離蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。,（一）固相 pH梯度-SDS雙向凝膠電泳（IPG-DALT）方法1、固相pH梯度等

32、電聚焦凝膠電泳（第一向）①準(zhǔn)備膠條架②樣品處理③放置IPG膠條④水化及聚焦電泳⑤平衡2、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（第二向）①凝膠配制及灌膠,②第一向膠條的轉(zhuǎn)移③電泳④脫膠⑤染色六、雙向凝膠電泳圖像分析PDQUEST分析2-D圖像的基本流程：獲取圖像→切割與定位圖像→蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測(cè)→蛋白質(zhì)斑點(diǎn)匹配→數(shù)據(jù)分析。七、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（一）概述,蛋白質(zhì)組研究中對(duì)于通過(guò)雙向電泳或其他方法分離的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行鑒定（iden

33、tification）或稱(chēng)注釋?zhuān)╝nnotation）是蛋白質(zhì)組研究中最為關(guān)鍵的一步。分析鑒定蛋白質(zhì)的方法從20世紀(jì)早期Stein和Moore開(kāi)創(chuàng)的氨基酸組成分析算起，經(jīng)過(guò)了大半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，建立了一系列方法技術(shù)包括蛋白質(zhì)N端、C端序列測(cè)定，等電點(diǎn)，分子質(zhì)量的測(cè)定，肽譜分析鑒定技術(shù)等。但目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比，至少有以下三個(gè)特點(diǎn)：其一，蛋白質(zhì)組學(xué)研究中對(duì)鑒定方法的靈敏度比傳統(tǒng)方法有更高的要求，一個(gè)雙向凝膠上的

34、蛋白質(zhì)點(diǎn)的量通常只有幾,個(gè)或不到一個(gè)皮摩爾（pmol），鑒定方法的靈敏度必須高于這一要求。其二，傳統(tǒng)方法通常都是對(duì)個(gè)別和幾個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，而蛋白質(zhì)組研究中要求同時(shí)對(duì)幾十個(gè)、幾百個(gè)甚至上千個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，因而對(duì)鑒定方法的通量和速度的要求要大大超過(guò)傳統(tǒng)方法。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的第三個(gè)特點(diǎn)是將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)查尋緊密關(guān)聯(lián)。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃而建立起來(lái)的人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)及相應(yīng)的分析查尋軟件，是目前人類(lèi)

35、疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究必不可少的手段。所謂對(duì)蛋白質(zhì)組研究中展現(xiàn)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定或注釋?zhuān)?是把展現(xiàn)的某個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)或一個(gè)組分的名稱(chēng)和它在數(shù)據(jù)庫(kù)中的進(jìn)入名碼（accession code）確定下來(lái)，或者鑒定出其是否為數(shù)據(jù)庫(kù)中未曾鑒定過(guò)的新蛋白質(zhì)。某種意義上說(shuō)，注釋和鑒定是將蛋白質(zhì)氨基酸序列與基因的DNA序列聯(lián)系起來(lái)。如果該種基因編碼的蛋白質(zhì)有已知的確定的功能，那么注釋和鑒定則可把蛋白質(zhì)氨基酸序列與其生物學(xué)活性聯(lián)系起來(lái)，這也是蛋白質(zhì)組研究最

36、重要的目的之一。（二）質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜儀一般由進(jìn)樣器、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器、控制電腦及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成，其中離子化源和質(zhì)量,分析器是兩個(gè)關(guān)鍵的部件，用于生物大分子研究的質(zhì)譜儀的離子化源主要是電噴霧（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸附離子化源（MALDI），而質(zhì)量分析器則主要有四級(jí)桿，離子肼和飛行時(shí)間三種。當(dāng)前市面上質(zhì)譜儀中ESI源多與四級(jí)桿，離子肼質(zhì)量分析器相匹配，而MALDI源常與飛行時(shí)間質(zhì)量分析器相匹配。當(dāng)前在蛋白質(zhì)組研究中

37、用質(zhì)譜技術(shù)鑒定和注釋蛋白質(zhì)主要通過(guò)兩種路線，一種是通過(guò)肽質(zhì)譜指紋圖（peptide mass fingerprinting）和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配的路線，進(jìn)行這種分析的質(zhì)譜儀首選是MALDI-TOF質(zhì)譜儀；另一種是通過(guò)測(cè)出,樣品中部分肽段二級(jí)質(zhì)譜信息或氨基酸序列標(biāo)簽與數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配的路線，適合于進(jìn)行這種分析的儀器主要是電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀。由于當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究中2-D膠電泳仍然是分離蛋白質(zhì)的主導(dǎo)技術(shù)，對(duì)2-D膠上蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定，目前普遍認(rèn)為MA

38、LDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行肽質(zhì)譜指紋圖（PMF）分析是合適的第一步。而MALDI-TOF質(zhì)譜儀由于其靈敏度高（可達(dá)fmol），分析速度快，譜圖易于解析以及受緩沖液/鹽分的干擾小等諸多優(yōu)點(diǎn)，非常適合于進(jìn)行PMF分析。然而單靠PMF路線來(lái)鑒定蛋白質(zhì)并非總能獲得成功，經(jīng)常,有獲得的肽質(zhì)譜指紋圖在數(shù)據(jù)庫(kù)中得不到可靠的匹配的情況。其可能的原因有：①由于樣品量太少，PMF圖的信噪比太低、因而輸入庫(kù)中搜尋的數(shù)據(jù)質(zhì)量不好。②2-D膠上所取的一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)

39、并非單一蛋白質(zhì)，所獲得的PMF圖實(shí)際上是兩個(gè)以上蛋白質(zhì)PMF圖的混合圖。③操作中角蛋白或其他蛋白質(zhì)的污染。④該蛋白質(zhì)發(fā)生了較多的轉(zhuǎn)譯后修飾，數(shù)據(jù)庫(kù)中未有記載。⑤所用胰蛋白酶質(zhì)量不夠好，蛋白酶自融片段多。⑥所分析的蛋白質(zhì)是一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有的未知的新蛋白質(zhì)。⑦有些生物材料的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)模太小。在上述情況下PMF方法未能鑒定的蛋白質(zhì)可通過(guò)其,他質(zhì)譜技術(shù)獲得該蛋白質(zhì)一段或數(shù)段多肽的串聯(lián)質(zhì)譜信息或序列標(biāo)簽（Sequence tag）并將其輸入數(shù)

40、據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜尋來(lái)鑒定該蛋白質(zhì)。（三）基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)（MALDI）在質(zhì)譜分析中，為了測(cè)定待測(cè)物分子的質(zhì)量，首先必須在系統(tǒng)中導(dǎo)入能量，而能量的導(dǎo)入必須滿(mǎn)足以下兩點(diǎn)要求：第一，能量能有效并受控制地轉(zhuǎn)換到樣品中以使樣品分子充分地解吸附并離子化；第二，為避免熱不穩(wěn)定性物質(zhì)的熱降解，能量必須在非常短的時(shí)間內(nèi)導(dǎo)入。激光具有脈沖短、靈敏度高的特點(diǎn)，是一種較理想的能量導(dǎo)入方式。早,在20世紀(jì)60年代初期，激光就被科學(xué)工作者用來(lái)在質(zhì)譜分析中產(chǎn)

41、生離子，他們將具有不同波長(zhǎng)和不同脈沖寬度的激光與各種不同類(lèi)型的質(zhì)譜結(jié)合進(jìn)行研究。20世紀(jì)70年代初期首次用激光產(chǎn)生有機(jī)分子離子，但在20年以后，激光才用于大分子物質(zhì)的解吸和電離。這一突破性的進(jìn)展關(guān)鍵在于基質(zhì)輔助激光解吸離子化技術(shù)的創(chuàng)立。在基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)中，采用了一種小分子物質(zhì)即基質(zhì)幫助大分子物質(zhì)進(jìn)入氣相。當(dāng)基質(zhì)以較高的比例與樣品混合后，高分子待測(cè)樣品便以單分子狀態(tài)均勻地分散于基質(zhì)中，在所采用的激光波長(zhǎng)下，由于基質(zhì)對(duì)激光有較,

42、強(qiáng)的吸收，而待測(cè)物只吸收很弱的激光，故不會(huì)造成大分子物質(zhì)的破壞和降解。當(dāng)大量被激發(fā)的基質(zhì)分子由于熱釋放而揮發(fā)時(shí)，會(huì)同時(shí)將非揮發(fā)性的大分子待測(cè)物質(zhì)帶入氣相?；|(zhì)的加入使得除待測(cè)物基質(zhì)以外的分子之間的相互作用減少，因而降低了解吸能，解決了大分子物質(zhì)的汽化問(wèn)題?；|(zhì)在MALDI-TOF-MS方法中的作用主要包括三個(gè)方面：第一，從激光光源吸收能量以防止被測(cè)大分子物質(zhì)的分解；第二，使被測(cè)物分子分離成單分子狀態(tài)以防止它們聚集；第三，在被測(cè)物離子化

43、過(guò)程中充當(dāng)質(zhì)子化試劑。第一,條作用要求基質(zhì)對(duì)激光光源有很強(qiáng)的吸收，到目前為止文獻(xiàn)報(bào)道的基質(zhì)化合物均為含苯環(huán)的有機(jī)化合物；第二條作用要求基質(zhì)與被測(cè)分子物質(zhì)具有很好的相容性，同時(shí)不能有分子間的相互作用；第三條作用要求基質(zhì)為酸性物質(zhì)。基質(zhì)化合物視其物理狀態(tài)的不同可分為固態(tài)基質(zhì)和液態(tài)基質(zhì)兩 大類(lèi)，其中固態(tài)基質(zhì)用于大分子分析時(shí)具有較好的分辨率，而液態(tài)基質(zhì)用于大分子分析時(shí)需要用較高強(qiáng)度的激光來(lái)產(chǎn)生離子，容易導(dǎo)致碎片離子的產(chǎn)生，因此一般不用于大分子

44、質(zhì)量物質(zhì)的測(cè)定。鑒于以上三條要求，基質(zhì)化合物通常選用固體狀態(tài)的弱有機(jī)酸，常用的基質(zhì)化合物有,2,5-二羥基苯甲酸（DHB），α-氰基-4-羥基肉桂酸（CCA），3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸或稱(chēng)芥子酸（SA）等。對(duì)于不同物質(zhì)的測(cè)定，合適基質(zhì)的選擇是至關(guān)重要的，因?yàn)椴煌奈镔|(zhì)其氣化能力有所不同，而基質(zhì)的吸熱能力也有強(qiáng)弱之分。DHB適合于蛋白質(zhì)、多肽、低聚糖、脂以及合成多聚物的測(cè)定，CCA適合于分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)和多肽的測(cè)定，SA則一般

45、用于分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)的測(cè)定。（四）飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF- MS）飛行時(shí)間質(zhì)譜主要由離子源（ion source），質(zhì)量分析器,（mass analyzer）以及離子檢測(cè)器（ion detector）組成。1、離子源①M(fèi)ALDI離子源包括激光脈沖發(fā)生器、可調(diào)衰減器、聚焦調(diào)節(jié)光學(xué)系統(tǒng)等三個(gè)主要部分。②離子源中用來(lái)完成基質(zhì)輔助激光解吸電離最關(guān)鍵的參數(shù)是激光打在樣品上的照射強(qiáng)度，蛋白質(zhì)樣品產(chǎn)生離子的最小值（閾值）大約為1MW/cm

46、2。2、質(zhì)量分析器飛行時(shí)間分析器是最簡(jiǎn)單的質(zhì)量分析裝置之一，它是基于對(duì)一套離子施加能量使其到達(dá)檢測(cè)器來(lái)測(cè)定它們到達(dá)的時(shí),間。離子到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間（t）與其在分析器中的飛行速度（v）密切相關(guān)（t=v/d），由于飛行距離（d）是一定的，因而飛行時(shí)間t取決于它們的飛行速度（v）。而飛行速度又與離子質(zhì)量（m）所帶電荷（e）以及動(dòng)力學(xué)能量（E）有關(guān)，由于動(dòng)力學(xué)能量E=1/2mv2，故v=(2E/m)1/2，這即表明當(dāng)具有不同質(zhì)量（m）的離子被

47、施加同樣的能量（E）時(shí)，質(zhì)量小的離子飛行速度會(huì)快一些，而質(zhì)量大的離子飛行速度則慢一些，因而不同質(zhì)量的離子到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間就會(huì)出現(xiàn)不同。這個(gè)過(guò)程類(lèi)似于某個(gè)人用同樣的力量向同一個(gè)目標(biāo)拋設(shè)兩個(gè)相同體積的鐵球和塑料球，結(jié)果塑料球由于質(zhì)量較小，速度較快將會(huì)先于鐵球到達(dá)目的地。,3、離子檢測(cè)器由基質(zhì)輔助激光解吸電離產(chǎn)生的高質(zhì)量的離子必須在轉(zhuǎn)換電板上轉(zhuǎn)換成電子或低質(zhì)量的離子才能得到檢測(cè)。 （五）MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定肽質(zhì)量指紋圖（PMF）每

48、種蛋白質(zhì)或肽都有著自身特定的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即氨基酸序列，蛋白質(zhì)或肽被酶解后所產(chǎn)生的肽片段也各具特性。因此，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或肽被特異性的酶如Trpysin, Lys-C等酶切后再進(jìn)行肽混合物質(zhì)量測(cè)定，會(huì)得到一套具有特征性的肽質(zhì)量圖，稱(chēng)為肽質(zhì)量指紋圖（peptide mass fingerprinting, PMF）。正如人的指紋能辨明一個(gè)人的身份，肽質(zhì)量指紋,圖也能鑒定該蛋白到底屬于哪一種蛋白質(zhì)。具體來(lái)說(shuō)，要鑒定一個(gè)2-D膠上蛋白質(zhì)點(diǎn)一般需要經(jīng)過(guò)

49、：蛋白質(zhì)原位酶解，MALDI-TOF肽質(zhì)量指紋圖測(cè)定，蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋三個(gè)主要步驟。1、蛋白質(zhì)原位酶解①取點(diǎn)與脫色②還原和烷基化③酶解與萃取2、MALDI-TOF肽質(zhì)量指紋圖①基質(zhì)的選擇與制備,②樣品盤(pán)的清洗與樣品制備③質(zhì)譜測(cè)定制備好的樣品可使用各公司生產(chǎn)的不同類(lèi)型的MALDI-TOF質(zhì)譜來(lái)進(jìn)地肽質(zhì)量指紋圖測(cè)定。儀器操作時(shí)一般需要選擇下列參數(shù)：線性或反射模式，離子源加速電壓及導(dǎo)出電壓，紫外或紅外激光波長(zhǎng)，離子延遲抽取

50、時(shí)間，飛行管道達(dá)到的真空度，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加次數(shù)，正離子或負(fù)離子譜測(cè)定。④數(shù)據(jù)校正3、蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋,當(dāng)獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)的準(zhǔn)確肽質(zhì)量指紋數(shù)據(jù)后，接下來(lái)的工作就是將該套肽片段數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋以確定蛋白質(zhì)的最后歸屬。由于蛋白質(zhì)組研究已日趨國(guó)際化，通過(guò)因特網(wǎng)可以方便、快捷、有效地交換和共享信息資源。目前因特網(wǎng)上有很多專(zhuān)門(mén)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域的WWW服務(wù)網(wǎng)站，其中ExPASY（蛋白質(zhì)分析專(zhuān)家系統(tǒng)）是蛋白質(zhì)組研究經(jīng)常訪問(wèn)的一個(gè)網(wǎng)站

51、，從它可以鏈接到各種相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)。八、生物信息學(xué)與蛋白質(zhì)組信息學(xué),生物信息學(xué)是生命科學(xué)和信息科學(xué)以及數(shù)學(xué)等學(xué)科交叉、結(jié)合的產(chǎn)物，它的誕生極大地推動(dòng)了生命科學(xué)研究的進(jìn)展。諾貝爾獎(jiǎng)獲得者W.Gilbert在1991年曾經(jīng)指出：“傳統(tǒng)生物學(xué)解決問(wèn)題的方式是實(shí)驗(yàn)的。現(xiàn)在，基于全部基因都將知曉，并以電子操作的方式駐留在數(shù)據(jù)庫(kù)中，新的生物學(xué)研究模式的出發(fā)點(diǎn)應(yīng)是理論的。一個(gè)科學(xué)家將從理論推測(cè)出發(fā)，再回到實(shí)驗(yàn)中去，追蹤或驗(yàn)證這些理論假設(shè)。”因此，在未來(lái)

52、的科研工作中，科學(xué)家,們可能首先是從生物信息學(xué)的角度入手尋找自己感興趣的生物學(xué)對(duì)象，然后回過(guò)頭來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作以證明已有的科學(xué)知識(shí)或發(fā)現(xiàn)新的科研領(lǐng)域。隨著人類(lèi)基因計(jì)劃的順利實(shí)施，人們的注意力已從基因組測(cè)序轉(zhuǎn)向?qū)蚪M表達(dá)的功能產(chǎn)物進(jìn)行分析，即對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的分析，因此蛋白質(zhì)組信息學(xué)已成為當(dāng)前生物信息學(xué)面臨的主要課題。（一） 生物信息學(xué)概述,隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的快速推進(jìn)，生物信息學(xué)逐漸受到人們的重視。這主要有兩個(gè)原因：首先是

53、計(jì)算機(jī)科學(xué)本身的快速發(fā)展，導(dǎo)致了計(jì)算能力的迅速提高；另一個(gè)則是隨著人類(lèi)基因組研究逐漸深入，核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的快速積累，導(dǎo)致對(duì)生物信息學(xué)的渴望急驟增加，目前這一領(lǐng)域內(nèi)集中了來(lái)自數(shù)學(xué)、生物學(xué)、計(jì)算機(jī)專(zhuān)業(yè)等方面的人才。在此，對(duì)生物信息學(xué)的定義、工作方式及其誕生等做一簡(jiǎn)單介紹。,1、生物信息學(xué)的定義20世紀(jì)90年代初，美籍學(xué)者林華安（Hwa A.Lim）首先創(chuàng)造和使用了生物信息學(xué)（bioinformatics）一詞。對(duì)于生物信息學(xué)的定義，不同

54、領(lǐng)域內(nèi)的人有不同的提法，因此至今尚無(wú)一個(gè)明確、簡(jiǎn)單的定義。目前比較多的學(xué)者認(rèn)為生物信息學(xué)是由于生命科學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的迅速發(fā)展、相互交叉融合而衍生出來(lái)的一門(mén)新興的邊緣學(xué)科。它通過(guò)對(duì)生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行獲取、加工、存儲(chǔ)、檢,索與分析，進(jìn)而達(dá)到揭示數(shù)據(jù)中所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義的目的。雖然生物信息學(xué)這一名詞創(chuàng)立于20世紀(jì)90年代初期，但其萌芽最早可追溯至20世紀(jì)60年代。早在1956年，便有人在美國(guó)田納西州召開(kāi)了名為“生物學(xué)中的信息理論討論會(huì)”，而

55、就其發(fā)展而言，卻是一門(mén)相當(dāng)年輕的學(xué)科。因此，無(wú)論從理論上來(lái)講還是從現(xiàn)實(shí)情況來(lái)看，它的誕生和發(fā)展都是應(yīng)時(shí)代所需，是歷史的必然。2、生物信息學(xué)的誕生,20世紀(jì)后半葉，生命科學(xué)與分子生物學(xué)研究取得重要進(jìn)展，特別是DNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步、人類(lèi)基因組計(jì)劃（human genome project, HGP）的實(shí)施，人類(lèi)迅速積累了大量的DNA序列數(shù)據(jù)。對(duì)此，傳統(tǒng)的研究方法難以快速消化這些數(shù)據(jù)產(chǎn)生新的知識(shí)。在這種強(qiáng)大的數(shù)據(jù)壓力之下，人們開(kāi)始探索采用新

56、的數(shù)據(jù)分析方法來(lái)解決這一難題。與此同時(shí)，計(jì)算機(jī)技術(shù)的網(wǎng)絡(luò)技術(shù)進(jìn)入了快速發(fā)展階段，人類(lèi)的計(jì)算能力、信息傳遞與交互能,力得到了極大的提高，為解決這一難題提供了基本條件。人們的注意力逐漸聚焦到生物信息學(xué)，即通過(guò)計(jì)算機(jī)、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)來(lái)解決生物學(xué)中的信息問(wèn)題。3、生物信息學(xué)的工作方式生物信息學(xué)既然主要是利用計(jì)算機(jī)的網(wǎng)絡(luò)開(kāi)展工作，當(dāng)然其工作方法離不開(kāi)計(jì)算機(jī)的內(nèi)容，比如數(shù)據(jù)庫(kù)、軟件、算法、分部式計(jì)算等等。數(shù)據(jù)庫(kù)，顧名思義就是數(shù)據(jù)的集合，也是生物信息學(xué)

57、工作的起點(diǎn)。目前，多數(shù)人,都是通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)來(lái)訪問(wèn)遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)。隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的界面越來(lái)越友好，已能夠很容易地進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)等操作。軟件則是用戶(hù)面臨的主要操作對(duì)象，一般生物信息學(xué)軟件的獲得主要有以下幾種方法：①利用現(xiàn)有的免費(fèi)或商業(yè)軟件，安裝在本地計(jì)算機(jī)上進(jìn)行使用。免費(fèi)軟件通常可以在互聯(lián)網(wǎng)上找到，并且下載，但服務(wù)上不及商業(yè)軟件那樣及時(shí)、便利。商業(yè)軟件的好處是有相應(yīng)的安裝與維護(hù)，使用時(shí)有相應(yīng)的說(shuō)明可以參照進(jìn)行，但,費(fèi)用比較昂貴。對(duì)于免費(fèi)軟件，在安

58、裝使用之前最好先閱讀軟件作者編寫(xiě)的幫助文檔或使用說(shuō)明之類(lèi)的文件，以免安裝使用過(guò)程中走彎路。②通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)瀏覽器程序、軟件客戶(hù)端程序或E-mail電子郵件程序向遠(yuǎn)程服務(wù)器發(fā)送計(jì)算請(qǐng)求，軟件服務(wù)器端程序?qū)⒃谶h(yuǎn)程服務(wù)器上進(jìn)行計(jì)算，然后將計(jì)算結(jié)果返回至互聯(lián)網(wǎng)瀏覽器程序或者軟件客戶(hù)端程序，以及通過(guò)電子郵件方式返回服務(wù)器端運(yùn)算結(jié)果。③自己動(dòng)手編制程序。真正在研究工作,中，會(huì)發(fā)現(xiàn)任何現(xiàn)成的軟件都會(huì)有這樣或那樣的不足。這時(shí)可以自己動(dòng)手，或者與計(jì)算機(jī)工作人

59、員進(jìn)行合作，開(kāi)發(fā)新的軟件以彌補(bǔ)現(xiàn)有軟件的不足。算法，顧名思義就是解決問(wèn)題的計(jì)算方法，由于它比較抽象、枯燥，而且是隱含在軟件之中，一般人并不關(guān)心，在此不做詳細(xì)討論。（二）蛋白質(zhì)組信息學(xué)概述由于蛋白質(zhì)組學(xué)是從蛋白質(zhì)的整體水平進(jìn)行研究，這就決定了蛋白質(zhì)組研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù),具有高信息量的特點(diǎn)，比如那“滿(mǎn)天星”似的雙向凝膠電泳圖譜。為了有效而快速地對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，生物信息學(xué)正在成為人們解決問(wèn)題的希望所在。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)與生物信息學(xué)的相互交

60、叉、融合就顯得格外引人注目。本節(jié)介紹蛋白質(zhì)組信息學(xué)的興起，其主要研究?jī)?nèi)容以及未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。1、蛋白質(zhì)組信息學(xué)的興起前已述及，人類(lèi)基因的計(jì)劃是生物信息學(xué)產(chǎn)生的主要?jiǎng)恿χ?。因此，通常談及的生?信息學(xué)指的是其狹義概念，即基因組信息學(xué)。目前基因信息學(xué)的研究領(lǐng)域主要集中在以下幾個(gè)方面：大規(guī)?；蚪M測(cè)序中的信息分析；新基因和新SNP的發(fā)現(xiàn)與鑒定；非編碼區(qū)信息結(jié)構(gòu)分析；遺傳密碼起源與生物進(jìn)化的研究；完整基因組的比較研究；生物大分子的結(jié)構(gòu)模擬

61、與藥物設(shè)計(jì)；生物信息學(xué)分析方法的研究等。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃接近尾聲，生命科學(xué)已步入了后基因組時(shí)代。蛋白質(zhì)組研究正是后基因組計(jì)劃中的一個(gè)重要,組成部分，由于蛋白質(zhì)組研究高信息量的特點(diǎn)，其對(duì)生物信息學(xué)的渴望正在不斷加大，故圍繞蛋白質(zhì)組研究而展開(kāi)的生物信息學(xué)研究也正在逐漸興起，包括對(duì)蛋白質(zhì)組研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行獲取、加工、存貯、檢索與分析等。另外對(duì)蛋白質(zhì)組研究的分析也導(dǎo)致了新的方法學(xué)問(wèn)題，從數(shù)學(xué)角度來(lái)看并不是簡(jiǎn)單的NP問(wèn)題、動(dòng)力系統(tǒng)問(wèn)題或不確定

62、問(wèn)題，而是基因表達(dá)的網(wǎng)絡(luò)問(wèn)題，故需要發(fā)展新的方法和工具。因此，圍繞蛋白質(zhì)組研究而開(kāi),展的蛋白質(zhì)組信息學(xué)可視為生物信息學(xué)的一個(gè)新的分支。2、蛋白質(zhì)組信息學(xué)的研究?jī)?nèi)容目前蛋白質(zhì)組研究采用的實(shí)驗(yàn)方法，主要有雙向電泳、質(zhì)譜、蛋白質(zhì)微量測(cè)序、酵母雙雜交等。因?yàn)樯镄畔W(xué)是通過(guò)對(duì)生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行獲取、加工、存貯、檢索與分析，進(jìn)而達(dá)到揭示數(shù)據(jù)中所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義的目的，故生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用將主要圍繞雙向電泳、蛋白質(zhì)測(cè)序等,實(shí)驗(yàn)技

63、術(shù)進(jìn)行生物信息的獲取、加工等。具體而言，大致有以下幾個(gè)方面：對(duì)雙向電泳結(jié)果進(jìn)行圖像分析，從中尋找出疾病與生理狀態(tài)下表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)、構(gòu)建雙向電泳圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)；參與對(duì)雙向電泳凝膠中的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的鑒定，包括單獨(dú)或綜合運(yùn)用質(zhì)譜數(shù)據(jù)、氨基酸測(cè)序結(jié)果、氨基酸組成分析結(jié)果等數(shù)據(jù)查詢(xún)數(shù)據(jù)庫(kù)以鑒定蛋白質(zhì)；輔助大規(guī)模的酵母雙雜交技術(shù)分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，包括構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)巨大的蛋白質(zhì)相,互作用網(wǎng)絡(luò)(huge protein network)以及對(duì)蛋白

64、質(zhì)相互作用進(jìn)行功能分析(functionanalysis)等；對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行大規(guī)模的分析，有人稱(chēng)之為計(jì)算蛋白質(zhì)組學(xué)(computational proteomics)是蛋白質(zhì)組信息學(xué)的又一重要內(nèi)容。3、蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)展望隨著蛋白質(zhì)組研究的不斷深入，蛋白質(zhì)組研究已出現(xiàn)技術(shù)平臺(tái)與信息處理一體化趨勢(shì)，例如早期蛋白質(zhì)組研究采用的雙向凝膠電泳,、圖像分析、蛋白質(zhì)鑒定等技術(shù)都是分開(kāi)的。目前已有多家公司推出了整合實(shí)驗(yàn)和信息處理一體化的

65、平臺(tái)，如Invertigator、Rosetta、Netgenics等。同時(shí)蛋白質(zhì)組研究對(duì)生物信息學(xué)的要求正在不斷提高。隨著數(shù)據(jù)量的迅猛增加，數(shù)據(jù)庫(kù)容量正在不斷加大，造成數(shù)據(jù)庫(kù)維護(hù)成本不斷攀升；數(shù)據(jù)量快速增長(zhǎng)同時(shí)導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析任務(wù)的急劇加重，需要開(kāi)發(fā)出功能越來(lái)越強(qiáng)大而使用越來(lái)越簡(jiǎn)單的分析軟件，這些都使得個(gè)人、單個(gè),的研究所和大學(xué)力不從心。為此，蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)出現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化的趨勢(shì)，越來(lái)越多的免費(fèi)軟件轉(zhuǎn)化為商業(yè)化軟件；同時(shí)越來(lái)越多的計(jì)算機(jī)制