一個植酸代謝相關(guān)水稻基因的定位、克隆與特性研究.pdf

1、植酸是作物種子中含磷最豐富的化合物，占種子干重的1％以上，種子全磷含量的65％-85％和酸溶性肌醇磷酸鹽的90％以上，易與K+、Ca2+、Mg2+和Zn2+等金屬離子螯合形成植酸鹽，主要沉積在作物的糊粉層和胚中。植酸及植酸鹽不能被人和非反芻動物吸收，影響了微量元素的生物有效性及對蛋白、脂肪和淀粉的吸收；同時，不能被利用的植酸鹽隨動物糞便排泄進入水系造成水體富營養(yǎng)化。降低種子中植酸的含量，培育低植酸作物，為解決與植酸相關(guān)的營養(yǎng)和環(huán)保問題開

2、辟了新的途徑。 在本試驗中，利用組織培養(yǎng)技術(shù)獲得了純合致死型的低植酸突變體Os-/pa-XS110-3的純合植株和種子：通過突變基因定位和候選基因序列分析，明確了Os-lpa-XS110-2和Os-/pa-XS110-3兩個等位低植酸突變發(fā)生在OsMRP5基因，并利用T-DNA插入突變體進行了驗證；研究了OsMRP5基因表達的時空特征及突變對轉(zhuǎn)錄的影響。主要結(jié)論如下： 1、Os-lpa-XS110-3的純合型成熟種子自然

3、發(fā)芽時，發(fā)芽率低，易發(fā)霉腐爛，出苗率在0.1％以下。但是，用四唑法(TTC法)測定突變種子的生活力發(fā)現(xiàn)，種子的胚具有活力，并證明可以利用組織培養(yǎng)培育純合系。對Os-/pa-XS110-3雜合單株自然結(jié)實和Os-/pa-XS110-3組培后代不同類型種子單粒重所做的研究表明，與野生型(WT)種子相比，突變型(HIP)種子單粒重顯著下降。成熟種子組織培養(yǎng)時，WT種子發(fā)芽率顯著高于突變型，幼苗的素質(zhì)也顯著要高，表現(xiàn)為幼苗根多，苗高。但是，運用

4、未成熟種子挽救突變體時，野生型和突變型材料的發(fā)芽成苗能力沒有顯著差別。通過組培培養(yǎng)技術(shù)獲得近300株Os-lpa-XS110-3純合系。 2、通過創(chuàng)建秈粳交定位群體(F2)，在采用BSA法將低植酸突變基因Os-lpa-XS110-2定位在第3條染色體的基礎(chǔ)上，最終將突變基因定位在SSR標記RM14360和RM1332之間大約400Kb之內(nèi)。InSilico分析表明，該區(qū)段存在一個與玉米lpa1基因同源的基因LOC_Os03904

5、920(OsMP5)，根據(jù)突變體的表型與玉米lpa1的相似性，確定了該基因為Os-lpa-XS110-2突變的候選基因。 3、對Os-lpa-XS110-2，Os-lpa-XS110-3兩個低植酸突變體的OsMRP5全長序列的測序分析表明，Os-lpa-XS110-2在該基因的第6個外顯子上發(fā)生了一個C/G-T/A單堿基突變，造成第1156個氨基酸由脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸；Os-lpa-XS110-3則在第1個外顯子上發(fā)生5個堿基(

6、GGTAG)的缺失，造成從452aa處開始移碼突變，并在474aa處形成終止子，極顯著地縮短了編碼蛋白的長度。同時，對插入到OsMRP5基因的第1個外顯子上的T-DNA插入突變體04A-02500的表型及與T-DNA插入的關(guān)系進行了分析，發(fā)現(xiàn)純合的插入突變種子與Os-lpa-XS110-3一樣，表現(xiàn)為高無機磷含量，不能自然發(fā)芽成苗。由此確定了OsMRP5基因在水稻種子植酸代謝過程中的重要作用。 4、利用Acitin基因為對照，進

7、行半定量RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)OsMRP5基因在水稻幼苗的根、葉鞘和葉片，以及花后7d、14d、21d、28d和35d的籽粒中都有表達，且表達量上基本無差異。同時發(fā)現(xiàn)，Os-lpa-XS110-2、Os-lpa-XS110-3在不同組織中OsMRP5的表達水平與親本秀水110相仿，說明低植酸突變沒有改變OsMRP5的RNA的轉(zhuǎn)錄水平。相反，T-DNA插入使OsMRP5的轉(zhuǎn)錄完全終止。 5、對Os-lpa-XS110-2、Os-l

8、pa-XS110-3和T-DNA插入突變體4A-02500的各磷素含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)與親本相比，總磷含量基本上不變，沒有顯著差異。Os-lpa-XS110-2種子的無機磷含量顯著增加，約是親本的4倍，植酸含量下降了33.8％，Os-lpa-XS110-3和4A-02500的純合突變種子與各自的親本野生型相比，無機磷含量要高出10倍左右；HPLC分析表明，純合Os-lpa-XS110-3植酸含量在限值(0.2mg/g)以下未能檢測到，純