溫度對惡臭假單胞菌生物學特性的影響【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設計）</p><p>　　論文題目：溫度對惡臭假單胞菌生物學特性的影響</p><p>　　所在學院 生物與環(huán)境學院 </p><p>　　專業(yè)班級 環(huán)境科學 </p><p>　　學生姓名 學號 <

2、/p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本研究開展培養(yǎng)溫度對惡臭假單胞菌生物學特性的影響研究，包括不同培養(yǎng)溫度下產酶特性、外膜蛋白和脂多

3、糖種類與產量等。選取4℃-30℃范圍內5個不同溫度進行培養(yǎng)，測定上清液及胞內產物的產酶特性，結果只有用杯碟法測得在25℃下產胞內淀粉酶，其它蛋白酶、磷脂酶、尿酶等在所有溫度下均未檢測到；以十二烷基肌氨酸鈉法提取菌株外膜蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE檢測主要條帶的差異，15℃培養(yǎng)的菌體外膜蛋白與另兩種培養(yǎng)溫度譜帶相比表現(xiàn)出差異性，出現(xiàn)分子量約26kDa的特征譜帶；隨著培養(yǎng)溫度的升高所產外膜蛋白含量增加；采用酚水法提取脂多糖，

4、SDS-PAGE后銀染，檢測了分子量和主要條帶的差異，結果顯示隨培養(yǎng)溫度的升高，出現(xiàn)更高分子量的特征譜帶，粗提脂多糖中蛋白質含量也隨培養(yǎng)溫度升高而增加。研究結果為闡明惡臭假單胞菌不同溫度條件下的致病機理提供了部分基礎。</p><p>　　關鍵詞：惡臭假單胞菌；胞外酶；胞內酶；脂多糖；外膜蛋白</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p>

5、<p>　　In this study, carried out the incubation temperature on the biological characteristics of Pseudomonas putida, including the characteristics of different incubation temperature for enzyme production, outer me

6、mbrane proteins and lipopolysaccharide types and yield, etc. Select five different temperatures within the range of 4℃-30℃ were cultured in the determination of characteristics of the products in the supernatant and intr

7、acellular enzyme production, the results only using the cylinder plate m</p><p>　　Keywords: Pseudomonas Putida; Extracellular enzyme; Intracellular enzyme; Lipopolysaccaride; Outer membrane protein</p>

8、<p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><b>　　2 材料與方法2</b></p><p>　　2.1 實驗材料2</p><p>　　2.1.1 菌株2</p><p&g

9、t;　　2.1.2 試劑2</p><p>　　2.1.3 主要儀器及型號2</p><p>　　2.2 實驗方法3</p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)基和溶液的配制3</p><p>　　2.2.2 菌株的保藏5</p><p>　　2.2.3 酶活性的分析5</p><p>　

10、　2.2.4 外膜蛋白的提取6</p><p>　　2.2.5 脂多糖的提取7</p><p>　　2.2.6 SDS-PAGE8</p><p><b>　　3 結果與分析8</b></p><p>　　3.1 產酶特性8</p><p>　　3.1.1 不同平板中胞外產酶情況觀察8

11、</p><p>　　3.1.2 杯碟法觀察胞內產酶情況9</p><p>　　3.2 不同培養(yǎng)溫度的Pt-01外膜蛋白分析910</p><p>　　3.3 不同培養(yǎng)溫度的Pt-01脂多糖特性分析11</p><p><b>　　4 討論13</b></p><p><b>　

12、　參考文獻15</b></p><p><b>　　致 謝17</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　大黃魚(Pseudosciaena crocea)隸屬于硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科、黃魚屬，又名黃花、大鮮、黃瓜魚、大黃花魚，為暖溫性近海集群洄游魚類，是我國傳統(tǒng)“四

13、大海產”之一的近海主要經濟魚類[1]。近年來,浙江省大黃魚養(yǎng)殖發(fā)展迅猛，特別是沿海的寧波象山港、臺州大陳島等海域，網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚已成為該地區(qū)的主要產業(yè)之一。但隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病害日趨嚴重[2-5]，病害問題已成為該養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展重要的制約因素之一。2004年春, 浙江寧波象山港海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚發(fā)生大量死亡, 死亡魚的體表正常，解剖發(fā)現(xiàn)其脾臟和腎臟都有許多白點狀結節(jié)。2005年4月，在浙江臺州深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚中也發(fā)生同樣癥狀的病例,

14、 經調查此病傳染性強，在自然狀態(tài)下的發(fā)病死亡率可達70%-80%[6]。為了摸清引起大黃魚內臟白點病的主要原因，本實驗室對2011年象山港病魚進行了病原分離、理化特性測試，并經16S rDNA序列比對鑒定該致病菌為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）[7]。已有報道表明，除大黃魚外，惡臭假單胞菌能夠引起多種水產動物疾病，如歐洲鰻鱺[8]、羅氏沼蝦[9]、中華絨螯蟹[10]等水</p><p>　　

15、假單胞菌引起的疾病在世界各地的溫水性或冷水性的海、淡水魚中都可能發(fā)生, 是海水中的正常菌群,為條件致病菌，其致病性主要取決于魚體的生理狀態(tài)及水環(huán)境的理化條件。大量研究表明，革蘭氏陰性菌如大腸桿菌（Escherichia coli）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、耶爾森氏菌（Yersinia）、愛德華氏菌（Edwardsiella）等的外膜蛋白(Outer membrane Protein,OMP)是細菌的粘附素[13]，在

16、致病和免疫中起重要作用。Merino等[14]曾報道溫度影響嗜水氣單胞菌外膜的組成成分和毒力,孫建和等采用SDS-PAGE技術研究發(fā)現(xiàn)，溫度對嗜水氣單胞菌外膜蛋白的表達量具有明顯影響，但并未有新條帶的增加[15]。Gonzalez-Serrano等人[16]也指出嗜水氣單胞菌在不同溫度下所表達的溶血素和細胞毒素的活性不同。任靜等[17]研究表明原料乳中嗜冷菌所產脂肪酶的最大酶活力隨培養(yǎng)溫度的升高而升高。國外研究顯示，在不同生長溫度條件下

17、，極地嗜冷菌生成的胞外蛋白酶量存在差異，但蛋白水解活性組分的組成卻是一致的[l8,l9]。革蘭氏陰性菌胞壁上的脂多糖(l</p><p>　　本研究開展培養(yǎng)溫度對惡臭假單胞菌生物學特性的影響研究，包括不同培養(yǎng)溫度下產酶特性、外膜蛋白種類和脂多糖特性等,旨在為闡明惡臭假單胞菌不同溫度條件下的致病機理提供部分基礎。</p><p><b>　　2 材料與方法</b><

18、;/p><p><b>　　2.1 實驗材料</b></p><p><b>　　2.1.1 菌株</b></p><p>　　惡臭假單胞菌菌株Pt-01分離自2011年象山港發(fā)病大黃魚、Pt-38、593、643、645、1819、1820、1836、1839、2309購自中科院微生物所菌種保藏中心。</p>

19、<p><b>　　2.1.2 試劑</b></p><p>　　三氯乙酸、盧哥氏碘液、苯酚、PBS 、SDS、過硫酸銨、Tris-Hcl、TEMED、Acrylaymide、甲醇、甲醛、硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、硝酸銀、醋酸、異丙醇、十二烷基肌氨酸鈉等為國產分析純，由上海生工生物技術有限公司提供。</p><p>　　2.1.3 主要儀器及型號</p&

20、gt;<p>　　表1 主要儀器及型號</p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)基和溶液的配制</p><p>　　LB液體培養(yǎng)基： Nacl 1.00g</p><p>　　蛋白胨 1

21、.00g</p><p>　　酵母提取物 0.5g</p><p>　　蒸餾水 100mL</p><p>　　pH 7.0</p><p>　　滅菌：121℃,20min</p><p>　　LB固體培養(yǎng)基： Nacl

22、 1.00g</p><p>　　蛋白胨 1.00g</p><p>　　酵母提取物 0.5g</p><p>　　瓊脂粉 1.5-2.0g</p><p>　　蒸餾水 100mL</p><p>　　pH

23、 7.0</p><p>　　滅菌：121℃,20min</p><p>　　奶粉固體培養(yǎng)基（100mL）：1%脫脂奶粉（1g）(加50mL水)115℃,20min滅菌，與已滅菌還未冷卻的LB固體培養(yǎng)基（50mL）在無菌室混勻倒平板。</p><p>　　酪蛋白固體培養(yǎng)基： 酪蛋白 0.4g</p&

24、gt;<p>　　Nacl 1.00g</p><p>　　蛋白胨 1.00g</p><p>　　酵母提取物 0.5g</p><p>　　瓊脂粉 1.5-2.0g</p><p>　　蒸餾水 100m

25、L</p><p>　　pH 7.0</p><p>　　滅菌：121℃,20min</p><p>　　在配制過程中，酪蛋白很難溶解，需要事先加入1%左右的NaOH固體，50-60℃下加熱攪拌才能溶解。</p><p>　　淀粉固體培養(yǎng)基： 淀粉 0.2g<

26、;/p><p>　　Nacl 1.00g</p><p>　　蛋白胨 1.00g</p><p>　　酵母提取物 0.5g</p><p>　　瓊脂粉 1.5-2.0g</p><p>　　蒸餾水

27、100mL</p><p>　　pH 7.0</p><p>　　滅菌：121℃,20min</p><p>　　吐溫-80固體培養(yǎng)基： 吐溫-80 1mL</p><p>　　Nacl 1.00g</p><p>　　蛋

28、白胨 1.00g</p><p>　　酵母提取物 0.5g</p><p>　　瓊脂粉 1.5-2.0g</p><p>　　蒸餾水 100mL</p><p>　　pH 7.0</p><p&

29、gt;　　滅菌：121℃,20min</p><p>　　尿素固體培養(yǎng)基： 尿素 2g</p><p>　　Nacl 1.00g</p><p>　　蛋白胨 1.00g</p><p>　　酵母提取物 0.5g</p&

30、gt;<p>　　瓊脂粉 1.5-2.0g</p><p>　　蒸餾水 100mL</p><p>　　pH 7.0</p><p>　　滅菌：121℃,20min</p><p>　　10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸用蒸餾水定容至100mL

31、；</p><p>　　生理鹽水：4.5gNacl，500mL蒸餾水；</p><p>　　90%苯酚：90mL純苯酚，10mL蒸餾水；</p><p>　　0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液：0.272gK2HPO4，1.074gNa2HPO4·12H2O，100mL蒸餾水；</p><p>　　PBS(pH 7.4，0.0lmol

32、/L )：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，1L蒸餾水，調PH值至7.4；</p><p>　　10%SDS：0.1gSDS,1000μL蒸餾水；</p><p>　　10%過硫酸銨溶液：0.05g過硫酸銨，600μL蒸餾水；</p><p>　　分離膠：3.3mLH2O，4.0mL30%Acry laynide，2.

33、5mL1.5MTris-Hcl(pH8.8)，0.1mL10%SDS，0.1mL10%過硫酸銨，10uLTEMED；</p><p>　　濃縮膠：3.4mL蒸餾水，0.83mL30%Acry laynide,0.63mL1.0MTris-Hcl (pH6.8)，0.05mL 10%SDS，0.05mL10%過硫酸銨,0.01mLTEMED；</p><p>　　甲醛固定液：20mL甲醇，2

34、5μL37%甲醛，定容至50mL；</p><p>　　硫代硫酸鹽顯影液：1.5g無水碳酸鈉，100uL 2g/L硫代硫酸鈉，25μL37%甲醛，定容至50mL；</p><p>　　0.1%硝酸銀:用室溫下密封于棕色瓶中的20%母液新鮮稀釋而成；</p><p>　　20mmol/L的Tris-Hcl緩沖液：稱2.42gTris置于1L燒杯中，加入約800mL蒸餾

35、水充分攪拌溶解，用濃鹽酸調pH至8.0，加水定容至1L；</p><p>　　0.5%十二烷基肌氨酸的Tris-Hcl緩沖液：0.5g十二烷基肌氨酸溶解于100mL已配置好的Tris-Hcl緩沖液中。</p><p>　　2.2.2 菌株的保藏</p><p>　　將購置的菌株分別接種到LB固體培養(yǎng)基上放在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，置4℃暫存，作為工作菌株。<

36、/p><p>　　2.2.3 酶活性的分析</p><p>　?。?） 菌株的胞外酶活性檢測</p><p>　　分別配制含酪蛋白（0.4%）、淀粉（0.2%）、吐溫-80（1.0%）、尿素（2.0%）、奶粉（1.0%）的LB瓊脂平板各50個，將上述10種惡臭假單胞菌菌株劃線或點種于含上述底物的LB瓊脂平板上（每株菌劃一種平板5個），將平板分為5組放在5個不同的溫度4℃

37、、15℃、20℃、25℃、30℃下培養(yǎng)（一組中含Pt-01：酪蛋白、淀粉、吐溫-80、尿素、奶粉；Pt-38：酪蛋白、淀粉、吐溫-80、尿素、奶粉；依此類推一種菌對應5種不同的平板），培養(yǎng)到長出菌體后，向酪蛋白平板中加入10%三氯乙酸溶液，向淀粉平板中加入盧哥氏碘液，觀察平板是否出現(xiàn)透明圈或不透明圈或變成紅色。</p><p>　　（2） 胞內產物酶活性的分析</p><p>　　胞內酶粗

38、提液的制備：用牙簽將惡臭假單胞菌Pt-01、Pt-38、593、643、645、1819、1820、1836、1839、2309菌株分別接種到10個裝有5mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，這10支試管為一組，共接種5組，將這5組分別放在5個不同溫度4℃、15℃、20℃、25℃、30℃搖床振蕩培養(yǎng)直到菌體長出。用移液槍吸取試管中的菌液到2.0mLEP管中，8000r/min離心10min（若菌體很少，再往各EP管中加相應的試管菌液，再去離心使

39、EP管中離心后菌體盡量多），上清液為胞外物質，倒去上清液，菌體用1mL的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮清洗，再離心10min，這樣反復清洗菌體3次，倒去上清液，再加入300μL的磷酸鹽緩沖液將菌體懸浮混勻，懸浮細胞在JY92-2D型超聲波細胞粉碎機上破碎，破碎條件：溫度4℃左右，輸出功率400W，時間3min(破碎8s間隔4s)。細胞破碎后經8000r/min離心30min。取上清液到EP管中作為無細胞胞內酶粗提液置于-18℃冰箱

40、中凍存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　杯碟法測定酶活性：分別配制含酪蛋白（0.4%）、淀粉（0.2%）、吐溫-80（1.0%）、尿素（2.0%）、奶粉（1.0%）的LB瓊脂平板，將EP管中溶液加于平板上放置的無菌小杯中，放在5個不同溫度4℃、15℃、20℃、25℃、30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，取出小杯，向酪蛋白平板中加入10%三氯乙酸溶液，向淀粉平板中加入盧哥氏碘液，觀察平板是否出現(xiàn)透明圈或不透明圈或變成紅色。</

41、p><p>　　2.2.4 外膜蛋白的提取</p><p>　　以三種溫度15℃、22℃、30℃培養(yǎng)菌體，提取外膜蛋白：將惡臭假單胞菌Pt-01接種到100mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12h獲得對數(shù)生長期的菌體，分別取等量（5mL）對數(shù)生長的菌體到3個300mL的LB液體培養(yǎng)基中放在不同的溫度下經培養(yǎng)相同的時間18h，分別將不同溫度下的菌液5000r/min離心20min收集菌體，用20

42、mmol/L的Tris-Hcl（pH8.0）緩沖液洗滌2次，取沉淀加20mmol/L的Tris-Hcl緩沖液重懸，置冰浴下超聲波破碎30min；4℃，5000r/min離心30min，收集上清液在4℃，13000r/min離心1h，棄上清，沉淀溶解于0.5%十二烷基肌氨酸的Tris-Hcl緩沖液中，28℃作用30min（靜置）；4℃，13000r/min離心1h，棄上清液，用20mmol/L的Tris-Hcl緩沖液洗滌沉淀，沉淀溶解于重

43、蒸水（無菌水），-20℃保存，臨用時以無菌生理鹽水稀釋至0.1mg/L備用。</p><p>　　Bradford蛋白濃度測定試劑盒的操作：</p><p>　　1．Bradford Reagent在使用前先預熱到室溫，上下顛倒數(shù)次混勻，預熱酶標儀；</p><p>　　2．取10μL蛋白標準品（BSA）加PBS稀釋至100μL（一般可用PBS稀釋標準品），使終濃度

44、為200μg/mL；</p><p>　　3．將稀釋后的標準品按0，1，2，4，6，8，10，15，20微升分別加到96孔板中，加PBS補足到20微升，每孔蛋白含量分別為0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，3.0μg；</p><p>　　4．加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加PBS到20微升；</p><p>　　5．各孔加入200微升Brad

45、ford Reagent，混勻，室溫放置5分鐘；</p><p>　　6．用預熱的酶標儀測定A595；</p><p>　　7．繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。</p><p>　　2.2.5 脂多糖的提取</p><p>　　菌體的獲得：惡臭假單胞菌Pt-01接種到100mL LB液體培養(yǎng)基中，置30℃培養(yǎng)，收集處于對數(shù)生長的菌體，分別

46、取等量（5mL）對數(shù)生長的菌體到3個300mL的LB液體培養(yǎng)基中放在三個不同的溫度（15℃、22℃、30℃）經培養(yǎng)相同的時間18h，將不同溫度下培養(yǎng)的菌體4000r/min離心20min，沉淀用5倍體積的生理鹽水清洗2次，無菌蒸餾水清洗1次，用3倍體積無菌蒸餾水（即1g濕質量用3mL蒸餾水）懸浮。</p><p>　　LPS粗品的制備：菌懸液反復凍融3次后，超聲波破碎（溫度26℃，功率350w，超聲55S，間隔9

47、S，共70次），加入等體積90%的苯酚，在68℃水浴中攪拌20-30min，冰浴至4℃，6000r/min離心20min，分別吸取上層水相(LPS)和中層酚層（變質蛋白），下層沉淀加入等體積的68℃的水，按上述方法重復提取2次，將3次所得上層清夜（LPS）置于透析袋中，無菌蒸餾水透析48h以上，至FeCl3檢測無酚試劑出現(xiàn)視為透析完成，用聚乙二醇20000濃縮至原體積的1/4，即得不同溫度下LPS粗品。</p><p

48、>　　2.2.6 SDS-PAGE</p><p>　　采用解離非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳，用小針管注射分離膠再注入異丙醇將分離膠壓成一條直線，等分離膠凝固后加入濃縮膠，濃縮膠也凝固后電泳，取樣20μL到EP管中加入20μL緩沖液后與蛋白分子量Marker一起在沸水浴中煮10分鐘，取出放4℃冰箱冷卻再在12000r/min離心2分鐘，加樣10μL，穩(wěn)定電泳，樣品在濃縮膠中電流用20mA，進入分離膠后加大至35

49、mA，直至染料到達分離膠的底部，電泳結束后外膜蛋白采用考馬斯亮藍染色法，而LPS則采用Tsai的銀染色法[21]。</p><p><b>　　銀染步驟：</b></p><p>　　將凝膠放入干凈的培養(yǎng)皿中，加入5mL甲醛固定液，搖動10min；</p><p>　　去掉甲醛固定液，用水洗兩次，每次5min；</p><p

50、>　　去掉水加入硫代硫酸鈉溶液，0.2g/L（母液稀釋），搖動1min；</p><p>　　去掉硫代硫酸鈉溶液，加入水洗2次，每次20s；</p><p>　　去掉水加入50mL0.1%硝酸銀（母液稀釋），搖10min；</p><p>　　去掉0.1%硝酸銀，用少量的硫代硫酸鹽顯影液洗；</p><p>　　加入50mL硫代硫酸鹽顯

51、影液顯影；</p><p>　　1min內就能見圖像，注意終止顯影，加入20%的醋酸即可。</p><p><b>　　3 結果與分析</b></p><p><b>　　3.1 產酶特性</b></p><p>　　3.1.1 不同平板中胞外產酶情況觀察</p><p>　

52、　觀察培養(yǎng)平板，發(fā)現(xiàn)所有培養(yǎng)溫度下10株菌的奶粉平板均未出現(xiàn)透明圈，而對照菌高產蛋白酶菌株銅綠假單胞菌1129在奶粉平板生長良好，并出現(xiàn)了明顯的透明溶解帶，表明這10株菌不產生胞外蛋白酶（圖1）。</p><p>　　向10株菌的酪蛋白平板中加入10%的三氯乙酸溶液觀察，5種培養(yǎng)溫度下的酪蛋白平板均未出現(xiàn)透明圈，只是滴加三氯乙酸的菌體變成了白色（圖2），說明5種溫度下惡臭假單胞菌也不產胞外酪蛋白酶。</p&

53、gt;<p>　　在所有菌株的淀粉平板中滴加盧哥氏碘液觀察，5種溫度培養(yǎng)平板周圍均變黑，未出現(xiàn)透明溶解圈，表明上述10株菌在所有培養(yǎng)溫度下均不產淀粉酶。</p><p>　　觀察10株菌在吐溫-80平板的情況，菌體周圍均未出現(xiàn)透明圈，說明也不產磷脂酶。</p><p>　　觀察10株菌在含尿素的瓊脂平板的生長和變色現(xiàn)象，周圍未出現(xiàn)透明圈和顏色變紅現(xiàn)象，提示了所有菌株均不產尿素

54、酶。</p><p>　　圖1 奶粉平板產蛋白酶觀察 圖2 酪蛋白平板產酶觀察</p><p>　　左邊劃線的是銅綠假單胞菌1129， 兩個劃線菌株為10株菌其中兩株</p><p>　　右邊劃線的是惡臭假單胞菌Pt-01

55、 </p><p>　　3.1.2 杯碟法觀察胞內產酶情況</p><p>　　觀察4℃、15℃、20℃、25℃、30℃各溫度的奶粉平板，酪蛋白平板中滴加10%的三氯乙酸溶液后觀察，淀粉平板滴加盧哥氏碘液觀察，吐溫-80平板觀察，10株菌的所有平板中菌體周圍均未出現(xiàn)透明圈，尿素平板菌體周圍也未變紅，只有25℃培養(yǎng)的淀粉平板10株菌菌體在滴加碘液之后周圍變透明，出現(xiàn)溶解圈

56、，其余溫度淀粉平板在滴加碘液之后菌體周圍變黑，表明10株菌只有25℃下產生胞內淀粉酶，而不產生其它檢測的酶類。</p><p>　　3.2 不同培養(yǎng)溫度的Pt-01外膜蛋白分析</p><p>　　采用SDS-PAGE檢測惡臭假單胞菌Pt-01在不同生長溫度下的外膜蛋白（如圖1），從電泳圖可以看出，同一種菌在三種不同溫度下培養(yǎng)提取的外膜蛋白的種類和含量存在差異，30℃與22℃主要譜帶一致，

57、22℃條帶數(shù)比30℃時稍少；15℃下高分子量條帶較少，但在分子量約為 26.0 kDa位置出現(xiàn)一條另兩種溫度所沒有的條帶，可能與更低溫度的生長和生存有關。</p><p>　　圖1. 不同培養(yǎng)溫度Pt-01外膜蛋白SDS-PAGE圖</p><p>　　M，蛋白分子量標準；1，2，30℃培養(yǎng)的Pt-01外膜蛋白；3，4，22℃培養(yǎng)的Pt-01外膜蛋白；5，6，15℃培養(yǎng)的Pt-01外膜蛋白

58、。</p><p>　　表1. 外膜蛋白在96孔板中酶標儀檢測下A595值</p><p>　　A，標準品；C，稀釋了20倍的OMP；E，OMP；1、2，15℃培養(yǎng)提取的OMP，3、4，22℃培養(yǎng)提取的OMP；5、6 ，30℃培養(yǎng)提取的OMP。</p><p>　　Bradford蛋白濃度測定試劑盒的操作中每孔標準品的蛋白質濃度為橫坐標X軸依次為0、0.01、0.0

59、2、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20μg/mL與標準品在酶標儀檢測下A595值為縱坐標Y軸分別為0.570、0.587、0.605、0.629、0.644、0.660、0.685、0.730、0.775繪制濃度標準曲線，建立一次方程求出樣品的蛋白濃度。</p><p>　　圖2. Bradford法檢測蛋白濃度標準曲線</p><p>　　將15℃、22℃、30℃

60、下OMP平均酶標儀讀數(shù)1.084、1.176、1.236分別代入一次函數(shù)Y=0.9946X+0.581中可求的15℃、22℃和30℃培養(yǎng)條件下提取的外膜蛋白含量分別為0.503μg/mL、0.598μg/mL和0.659μg/mL，結果表明，隨著培養(yǎng)溫度的升高，經相同時間培養(yǎng)的惡臭假單胞菌Pt-01所產的外膜蛋白含量增加。</p><p>　　3.3 不同培養(yǎng)溫度的Pt-01脂多糖特性分析</p>

61、<p>　　惡臭假單胞菌Pt-01在不同生長溫度下的粗提脂多糖的SDS-PAGE圖譜如圖3所示。從電泳圖可得出，同一種菌在三種不同溫度下培養(yǎng)提取的粗品LPS中蛋白質的種類和含量存在差異，經30℃與22℃培養(yǎng)后提取的脂多糖電泳條帶基本一致，15℃培養(yǎng)后提取的脂多糖主要條帶（分子量約為48.0 kDa、28.0 kDa、14.3 kDa和11 kDa的4條）基本一致，高分子量條帶存在差異，基本沒有超過97.2 kDa的條帶；同時該

62、溫度下的脂多糖條帶顯色淺、帶型細，顯示了其表達量比前兩種溫度少。</p><p>　　圖3. 不同培養(yǎng)溫度Pt-01粗提脂多糖SDS-PAGE圖</p><p>　　M，蛋白分子量標準；1，2，30℃培養(yǎng)的Pt-01粗提脂多糖；3，4，22℃培養(yǎng)的Pt-01粗提脂多糖；5，6，15℃培養(yǎng)的Pt-01粗提脂多糖。</p><p>　　Bradford法測定粗提LPS中

63、蛋白質在酶標儀檢測下相對于96孔板中相應位置樣品的A595值（見表2），定量測出經相同時間培養(yǎng)對應不同溫度下脂多糖含量。</p><p>　　表2. 脂多糖在96孔板中酶標儀檢測下A595值</p><p>　　A，標準品； B，稀釋了20倍的LPS粗品；D，LPS粗品；1、2，15℃培養(yǎng)提取的LPS粗品，3、4，22℃培養(yǎng)提取的LPS粗品；5、6，30℃培養(yǎng)提取的LPS粗品。</p

64、><p>　　將15℃、22℃、30℃下粗提LPS中蛋白質的平均酶標儀讀數(shù)0.9485、1.032和1.112分別代入（圖2）Bradford法檢測蛋白濃度繪制標準曲線所得的一次函數(shù)Y=0.9946X+0.581中可求得15℃、22℃、30℃培養(yǎng)條件下提取的粗品LPS中蛋白質含量分別為0.369μg/mL、0.453μg/mL和0.534μg/mL，顯示了隨著溫度的升高，相同培養(yǎng)時間內的惡臭假單胞菌Pt-01所產粗品

65、LPS中蛋白質的含量增加，與SDS-PAGE圖顯示的結果相符。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　本研究選取4℃-30℃范圍內5個不同溫度對惡臭假單胞菌Pt-01進行培養(yǎng)，測定了不同溫度下惡臭假單胞菌的產酶特性，觀察劃線平板菌體周圍既未出現(xiàn)透明圈（奶粉、淀粉、吐溫-80、酪蛋白的瓊脂平板），也沒有變成紅色（尿素瓊脂平板），說明惡臭假單胞

66、菌在這5種溫度下不產胞外蛋白酶、酪蛋白酶、淀粉酶、磷酯酶和尿素酶；杯碟法測惡臭假單胞菌的胞內產酶狀況，結果只有25℃的淀粉平板菌體周圍在滴加盧哥氏碘液之后出現(xiàn)透明圈，說明惡臭假單胞菌只在25℃下產胞內淀粉酶，不產胞內蛋白酶、酪蛋白酶、磷酯酶和尿素酶。常規(guī)的魚類病原菌如嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、熒光假單胞菌等，均產生一種或數(shù)種胞外蛋白酶、磷脂酶、溶血素等毒力因子，表現(xiàn)出對魚類機體的致病性，本研究未檢測到惡臭假單胞菌產蛋白酶、磷酯酶

67、、尿素酶等，也不產生溶血素（數(shù)據(jù)未在此文顯示），提示了該菌的致病機制與上述數(shù)種病原菌均不同，可能存在一種獨特的方式，引起魚類發(fā)病。</p><p>　　本研究提取了三個不同培養(yǎng)溫度下惡臭假單胞菌Pt-01的脂多糖和外膜蛋白，進行了含量和組成特性分析，結果表明，15℃培養(yǎng)的菌體外膜蛋白帶譜與其它兩個溫度存在較大差異，15℃與30℃均存在各自不同的特征條帶；隨著培養(yǎng)溫度的升高，外膜蛋白的量呈增大的趨勢；粗提脂多糖的種

68、類，隨培養(yǎng)溫度的升高，出現(xiàn)更高分子量的特征譜帶，粗提脂多糖中蛋白質含量也隨培養(yǎng)溫度升高而增加。本研究所用惡臭假單胞菌大黃魚病原株Pt-01，其在高溫區(qū)（20-30℃）和低溫區(qū)（10-15℃）條件下，均能感染魚體，但高溫期較少發(fā)病，反而在低水溫季節(jié)大量發(fā)病和死亡，外膜蛋白和脂多糖隨培養(yǎng)溫度不同而表現(xiàn)的種類的差異性可能與其致病機制有關，如本研究中15℃培養(yǎng)時出現(xiàn)一分子量約為26.0 kDa的條帶，可能與低溫致病有關。</p>

69、<p>　　革蘭氏陰性菌LPS是大多數(shù)魚類病原菌重要的內毒素，戴書靜等[22]的研究結果表明LPS會導致小鼠多臟器損傷。鄢慶枇等[23]用從大黃魚病原溶藻弧菌中提取的LPS溶液，對大黃魚進行肌肉注射毒實驗，LPS濃度在2mg/mL時，大黃魚的死亡率為100%。本研究的致病菌惡臭假單胞菌脂多糖可能是該菌的重要毒力因子，在低水溫期，感染魚本身已不攝食，免疫水平低下，大量繁殖的菌體消耗魚體營養(yǎng)、擠占、破壞肝、腎、脾等組織的正常結構造

70、成組織代謝障礙，同時菌體死亡釋放的LPS的毒性加劇了魚體的病理反應，可能是造成大量的發(fā)病與死亡的重要原因。</p><p>　　在水產動物疾病研究中發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性菌OMP可以刺激宿主產生強的保護性免疫應答[24]。近年來，OMP對細菌致病機理和免疫性作用機理的研究取得了很大進展。本研究中15℃表達的26.0 kDa的特異性蛋白條帶可能與低溫致病有關，有必要深入探究與培養(yǎng)溫度相關的特異表達外膜蛋白和脂多糖的種類，

71、為研制惡臭假單胞菌疫苗奠定基礎。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 王娟, 封永輝, 曲憲成等. 來自大黃魚腸道的弧菌拮抗菌的篩選與鑒定[J]. 海洋與湖沼. 2010, 41(5): 707-709.</p><p>　　[2] 徐建峰. 大黃魚本尼登蟲病的診治[J]. 科學養(yǎng)魚. 2001, 11:

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85、孜不倦的進取精神以及誨人不倦的高尚師德都深深影響著我，使我受益良多，這對我以后的工作和生活也有了很大的幫助。本文從選題到完成，都傾注了毛老師大量的心血，學生的每一點進步都是在毛老師的耐心教導下取得的。在此，謹向毛老師表示衷心的感謝！</p><p>　　感謝在大學四年里所有教育過我的老師們，感謝他們四年來對我的教導、關心和支持，讓我學到了很多生活的道理。在此對他們給予我的諸多幫助表示由衷的感謝！另外，我要感謝一直