惡臭假單胞菌生物膜多糖對大黃魚的免疫學(xué)活性研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計）</p><p>　　論文題目：惡臭假單胞菌生物膜多糖對大黃魚的免疫學(xué)活性研究</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 環(huán)境工程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號

2、 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　惡臭假單胞菌在其生長過程中產(chǎn)生大量粘性的生物膜多糖，該多糖具有免疫增強(qiáng)活性等多種生物

3、學(xué)功能，可以用于開發(fā)免疫增強(qiáng)劑和其他多糖類藥物。為了進(jìn)一步開發(fā)利用生物膜多糖，本研究通過測定白細(xì)胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、特異性抗體效價以及免疫保護(hù)率來探討惡臭假單胞菌生物膜多糖抗原對大黃魚免疫機(jī)能的影響，旨在掌握生物膜多糖的免疫學(xué)特性，為惡臭假單胞菌疫苗的研制開發(fā)提供理論依據(jù)。研究結(jié)果表明，惡臭假單胞菌生物膜多糖能有效增強(qiáng)大黃魚的免疫性能。</p><p>　　關(guān)鍵詞：惡臭假單胞菌；生物膜多糖；大黃魚；免疫&

4、lt;/p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　Pseudomonas putida in their growth process to produce large amounts of sticky biofilm polysaccharide,the polysaccharide with immune-enhancing activi

5、ty of a variety of biological functions can be used for the development of immunostimulants and other polysaccharides drugs. In order to further the development of the biofilm polysaccharide, this study by measuring the

6、phagocytic activity, serum lysozyme activity, the titer of specific antibodies and immune protection rate of Pseudomonas putida biof</p><p>　　Key Words:Pseudomonas putida; biofilm polysaccharide; P

7、seudosciaena crocea; immune目 錄</p><p><b>　　1.引言1</b></p><p><b>　　2.材料1</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)用魚1</p><p><b>　　2.2 菌株2</b>&l

8、t;/p><p>　　2.3 主要試劑2</p><p>　　2.4 主要儀器和設(shè)備2</p><p><b>　　3.方法3</b></p><p>　　3.1 免疫成分的制備—抗原3</p><p>　　3.2 口灌全菌抗原的制備3</p><p>　　3.3 生

9、物膜多糖抗原的制備4</p><p>　　3.3.1 口灌生物膜菌體抗原的制備4</p><p>　　3.3.2 注射生物膜多糖抗原的制備4</p><p>　　3.4 免疫試驗(yàn)魚4</p><p>　　3.5 免疫指標(biāo)的測定5</p><p>　　3.5.1 樣品的采集5</p><p

10、>　　3.5.2 吞噬原的制備5</p><p>　　3.5.3 血漿中白細(xì)胞的吞噬活性、吞噬指數(shù)的測定5</p><p>　　3.5.4 血清中溶菌酶活性的測定5</p><p>　　3.5.5 間接ELISA法檢測血清抗體效價6</p><p><b>　　3.6 攻毒7</b></p>

11、<p><b>　　4.結(jié)果7</b></p><p>　　4.1 生物膜多糖的電泳檢測及銀染結(jié)果7</p><p>　　4.2 血漿中白細(xì)胞的吞噬活性、吞噬指數(shù)的影響8</p><p>　　4.3 血清中溶菌酶活力的影響9</p><p>　　4.4 間接ELISA法檢測血清抗體效價10</

12、p><p>　　4.5 大黃魚的免疫保護(hù)率11</p><p><b>　　5.討論12</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)14</b></p><p><b>　　致 謝15</b></p><p>　　附錄1 電泳及銀染法16&l

13、t;/p><p><b>　　1.引言</b></p><p>　　大黃魚（Pseudosciaena crocea）隸屬鱸形目、石首魚科、黃魚屬，又名黃魚、大黃花魚、黃瓜魚，是我國主要海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類之一，因其肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，營養(yǎng)豐富而備受消費(fèi)者青睞，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值[1-3]。原為我國海洋四大主捕對象之一，在我國及太平洋海洋漁業(yè)中，均占有重要位置。但由于人為因素酷魚濫捕，

14、使其資源幾近枯竭。20世紀(jì)80年代后，全國大黃魚漁場均不能形成漁汛[1]。目前，人們已經(jīng)將重點(diǎn)由捕撈轉(zhuǎn)為養(yǎng)殖，大黃魚的網(wǎng)箱養(yǎng)殖已成為繼鱸魚、石斑魚、鯛科魚類之后的又一新養(yǎng)殖品種。然而隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病害日趨嚴(yán)重，病害問題已成為該養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展重要的制約因素之一。因此，防治病害是刻不容緩的，而最常用的方法主要是依靠藥物，但頻繁地使用藥物可能使病原體對某些藥物產(chǎn)生抗藥性，致使防治失??；且藥物在水體中積累過多，極易污染水體，造成生態(tài)平衡的破

15、壞。所以就需要尋找一種新的方法—免疫學(xué)方法，既可以解決病害問題又能避免藥物帶來的各種弊端。目前研究的免疫防治措施主要是特異性的疫苗和免疫增強(qiáng)劑[4]。</p><p>　　惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)為假單胞菌科假單胞菌屬中的一個種。它是淡水魚白云病和爛鰓病的重要病原菌，并可以引起魚類的死亡[5]。在大黃魚中，該菌感染可引起“內(nèi)臟白點(diǎn)病”，造成嚴(yán)重的死亡[6]。微生物生物膜多糖是其生長過程

16、中產(chǎn)生大量粘性多糖，具有無毒副作用和免疫調(diào)節(jié)能力[7]。它還是免疫增強(qiáng)劑[8,9]，能夠提高機(jī)體的免疫功能，并通過提高機(jī)體的免疫力達(dá)到抗腫瘤的效果，具有良好的防病治病效果。</p><p>　　本研究提取惡臭假單胞菌生物膜多糖來免疫大黃魚，通過測定白細(xì)胞吞噬活性、血清中溶菌酶活性、特異性抗體效價以及免疫保護(hù)率來探討生物膜多糖抗原對大黃魚免疫機(jī)能的影響，旨在掌握生物膜多糖的免疫學(xué)特性，為惡臭假單胞菌疫苗的研制提供理

17、論依據(jù)。</p><p><b>　　2.材料</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)用魚</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)所用大黃魚均購自浙江省象山港養(yǎng)殖網(wǎng)箱。選擇游動活潑，體表無損傷的健康大黃魚。</p><p><b>　　2.2 菌株</b></p>

18、;<p>　　惡臭假單胞菌PT01病原株是從浙江省象山港海水養(yǎng)殖網(wǎng)箱中患病的大黃魚分離而得；金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）購自杭州天和微生物有限公司；溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）凍干粉購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。</p><p><b>　　2.3 主要試劑</b></p><p>　　

19、海藻酸鈉、肝素鈉、十二烷基肌氨酸、苯酚、Giemsa染色液均為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品，其余試劑均為進(jìn)口或者國產(chǎn)分析純。大黃魚免疫球蛋白抗血清由南京金思瑞公司制備，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購于武漢博士德生物工程有限公司。</p><p>　　ELISA實(shí)驗(yàn)所用主要試劑及配方如下：</p><p>　?、?包被液：碳酸鹽緩沖液(0.05mol/L，pH9.6)：Na2CO3 1.

20、59g，NaHCO3 2.93g，1LddH2O，調(diào)pH值至9.6；</p><p>　?、?PBS(pH 7.4，0.0lmol/L )：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，1LddH2O，調(diào)PH值至7.4；</p><p>　?、?洗滌液（PBST）：PBS+0.05%Tween20； </p><p>　　④ 封閉

21、液：PBS+5%脫脂奶粉；</p><p>　?、?顯色底物緩沖液：A液(1.92g檸檬酸溶于100mL ddH2O中)；</p><p>　　B液(2.84g Na2HPO4溶于100mL ddH2O)；</p><p>　?、?顯色液：5mLA液和5mlB液混合，加入4mg OPD，15ul H2O2；</p><p>　　⑦ 終止液（2

22、mol/L硫酸溶液）：濃硫酸22.2mL，ddH2O加至200mL。</p><p>　　2.4 主要儀器和設(shè)備 </p><p>　　本研究用到的主要儀器設(shè)備如表1所示。 </p><p>　　表1 主要儀器設(shè)備表</p><p><b>　　3.方法</b></p><p>　

23、　3.1 免疫成分的制備—抗原</p><p>　　取超低溫凍存的惡臭假單胞菌PT01甘油菌一支，在LB平板上劃線接種復(fù)蘇，28℃培養(yǎng)18h；選取單克隆，挑斑轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)12h以上；以用于制備后面的各免疫成分。</p><p>　　3.2 口灌全菌抗原的制備</p><p>　?、?把菌懸液移入離心管，以4000r/min離心10min，棄去

24、上清液；</p><p>　?、?菌體再用無菌生理鹽水洗滌，以4000r/min離心10min，棄去上清液；</p><p>　　③ 無菌生理鹽水稀釋PT01菌懸液至1×109cells/mL，加入終濃度為0.5%的福爾馬林，28℃滅活24h；</p><p>　?、?以平板培養(yǎng)法檢查滅活效果，確認(rèn)徹底滅活后，保存在4℃冰箱中備用。此即為全菌抗原；<

25、/p><p>　?、?制備好的全菌抗原(1×109cells/mL)和2.0% 的海藻酸鈉溶液以1∶1比例混合均勻，作為口灌成分。</p><p>　　3.3 生物膜多糖抗原的制備</p><p>　　3.3.1 口灌生物膜菌體抗原的制備</p><p>　　生物膜菌體的制備參照文獻(xiàn)[10]，主要步驟如下：</p><

26、;p>　?、?以無菌操作在6孔組織培養(yǎng)板各孔中加入一定量的滅菌LB培養(yǎng)液，按1%的接種量接種之前準(zhǔn)備好的過夜菌種，28℃靜置培養(yǎng)24h；</p><p>　?、?將老培養(yǎng)液移出，添加新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；</p><p>　?、?如此重復(fù)，直到第5天培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液移出，以0.9%滅菌生理鹽水淋洗組織培養(yǎng)板，用細(xì)胞刮子刮下粘附生長的生物膜菌體，以0.9%滅菌生理鹽水懸浮，此即為生物

27、膜菌體，并調(diào)整其濃度為1×109cells/mL；</p><p>　?、?加入終濃度為0.5%的福爾馬林，28℃滅活24h；</p><p>　?、?以平板培養(yǎng)法檢查滅活效果，確認(rèn)徹底滅活后，保存在4℃冰箱中備用。</p><p>　　⑥ 制備好的生物膜菌體(1×109cells/mL)和2.0% 的海藻酸鈉溶液以1∶1比例混合均勻，作為口灌成

28、分。</p><p>　　3.3.2 注射生物膜多糖抗原的制備</p><p>　　生物膜多糖的制備方法參照文獻(xiàn)[10]，主要步驟如下：</p><p>　?、?制備好的生物膜菌體用機(jī)械攪拌儀以500r/min攪拌5min；</p><p>　?、?將攪拌后的菌懸液移入離心管，以5000r/min離心10min，棄去底層菌體細(xì)胞，上清液即為生

29、物膜多糖；</p><p>　?、?將上清液移至透析袋中，以100倍體積的蒸餾水4℃透析24h后，取一定量的溶液采用解離非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳（SDS-PAGE）及銀染法來得到生物膜多糖的特有條帶，其余均保存在-20℃冰箱中備用。</p><p><b>　　3.4 免疫試驗(yàn)魚</b></p><p>　　試驗(yàn)在浙江省象山港海水養(yǎng)殖基地進(jìn)行，

30、充氣暫養(yǎng)。先暫養(yǎng)7d，待試驗(yàn)魚適應(yīng)后正式分池進(jìn)行免疫試驗(yàn)。試驗(yàn)期間水溫為12-16℃，pH為7.8左右，試驗(yàn)期為21d。</p><p>　　選取體重約為100g左右規(guī)格均一的同一批大黃魚種，隨機(jī)分為4個實(shí)驗(yàn)組，每組40尾魚。1、2試驗(yàn)組分別每尾口灌0.2 mL全菌疫苗和生物膜菌體，第3組每尾注射0.2mL生物膜多糖，第4組為對照組，注射相同劑量的滅菌生理鹽水。</p><p>　　3.5

31、 免疫指標(biāo)的測定</p><p>　　3.5.1 樣品的采集 </p><p>　　免疫后第21d，各組分別取6尾魚進(jìn)行尾椎靜脈采血，將所得的血液分為2份，其中1份加肝素鈉抗凝，用于白細(xì)胞吞噬活性、吞噬指數(shù)的測定，另1份血液首先在室溫下靜置1h待其凝固，置4℃冰箱4h，于4℃條件下以4000r/min離心10min，收集血清，用于血清溶菌酶活性的測定和血清效價的檢測。</p>

32、<p>　　3.5.2 吞噬原的制備</p><p>　?、?金黃色葡萄球菌接種在FWA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)36h；</p><p>　?、?收集菌體，無菌生理鹽水洗滌2次，制成菌懸液（1.0×108cells/mL）；</p><p>　?、?在菌懸液中加入終濃度為0.5％的福爾馬林，37℃滅活24h，經(jīng)過平皿法證實(shí)此菌已被徹底滅活后，置4℃

33、冰箱中保存?zhèn)溆?，此即?.5.3試驗(yàn)中的吞噬原。</p><p>　　3.5.3 血漿中白細(xì)胞的吞噬活性、吞噬指數(shù)的測定</p><p>　?、?0.2 ml抗凝血加入 0.2ml 的金黃色葡萄球菌液，搖勻，于25℃水浴 60 min；</p><p>　　② 水浴期間每隔10 min搖動 1次；</p><p>　?、?用吸管吸取混合液涂片

34、，每個血樣涂5片；</p><p>　　④ 甲醇固定10 min；</p><p>　?、?Giemsa染色1～1.5 h，水洗風(fēng)干后油鏡觀察。</p><p>　　⑥ 計算吞噬百分比(pHagocytic percentage，PP)和吞噬指數(shù)(pHagocytic index，PI)。</p><p>　　吞噬百分比（PP）=100個吞噬

35、細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100×100%</p><p>　　吞噬指數(shù)（PI）=吞噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)/參與吞噬的白細(xì)胞數(shù)</p><p>　　3.5.4 血清中溶菌酶活性的測定</p><p>　?、?用pH6.8 濃度為0.067 mol/L 的PBS將溶壁微球菌凍干粉溶解，調(diào)整為0.25mg/mL的菌懸液；</p><p>　　

36、② 每個樣品取3.0mL菌懸液，吸取血清0.04mL加到菌懸液中，混勻后，立刻用紫外分光光度計540nm下測定A0值；</p><p>　?、?然后在28℃水浴中溫育30min，取出后置于4℃冰浴中終止反應(yīng)，再測定A值。</p><p>　?、?按公式計算溶菌酶的活性： U＝（A0－A）/A0</p><p>　　3.5.5 間接ELISA法檢測血清抗體效價 <

37、;/p><p><b>　　(1) 抗原的準(zhǔn)備</b></p><p>　　依照3.2和3.3中制備全菌抗原（1.0×109cells/mL）、生物膜菌體和生物膜多糖等。</p><p>　　(2) 一抗（黃魚抗血清）的準(zhǔn)備</p><p>　　依照3.5.1中方式取血，結(jié)束后采取的血清-20℃保存，便于之后檢測抗

38、體效價。</p><p>　　(3) 夾心ELISA法檢測黃魚血清抗體水平方法的建立</p><p>　　抗原分別為全菌抗原（1.0×109cells/mL）、生物膜菌體抗原及生物膜多糖抗原；一抗為不同方式免疫21d后采取的大黃魚抗血清；二抗和三抗分別為鼠抗黃魚免疫球蛋白多抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG。</p><p>　?、?包被：以pH9.6的碳酸鈉緩

39、沖液稀釋抗原，100ul/孔，37℃孵育60min或4℃過夜。甩干包被液，洗滌液洗滌3次，300ul/孔，3min/次；</p><p>　?、?封閉：加入5%脫脂牛奶封閉液，150ul/孔，37℃2h后甩干，洗滌液洗滌3次，300ul/孔，3min/次；</p><p>　?、?加入一抗：加入PBST稀釋好的黃魚抗血清，100ul/孔，每個樣品重復(fù)2個孔，同時設(shè)陰性樣品和空白對照，37℃

40、1.5h后甩干液體，洗滌液洗滌3次，300ul/孔，3min/次；</p><p>　　④ 加入二抗：用PBST稀釋鼠抗黃魚免疫球蛋白單抗，100ul/孔，37℃1.5h后甩干，洗滌液洗滌3次，300ul/孔，3min/次；</p><p>　?、?加入三抗：HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG按1∶10000稀釋，100ul/孔，37℃1.5h后甩干，洗滌液洗滌3次，300ul/孔，3min/次；&

41、lt;/p><p>　?、?加入顯色液：各反應(yīng)孔中加入新配制的OPD底物顯色緩沖液，100ul/孔，避光，37℃15min；</p><p>　　⑦ 加入終止液：每反應(yīng)孔中加入50ul 2mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)；</p><p>　　⑧ 測OD值，酶標(biāo)儀測定各孔495nm處的0D值。</p><p>　　試驗(yàn)血清吸光度值(P)=待檢血清OD值

42、-空白OD值；陰性對照血清吸光度值(N)=陰性血清OD值-空白OD值；當(dāng)兩者比值P/N>2.1時，則判斷為陽性；陽性孔的最大稀釋度即為抗體效價。以試驗(yàn)在置信度水平P<0.05計算顯著性差異。</p><p>　　(4) 方陣滴定法測定一抗和二抗的最佳工作濃度</p><p>　　采用方陣滴定法確定大黃魚抗血清和兔抗大黃魚免疫球蛋白血清最佳工作濃度：全菌抗原為經(jīng)煮沸的惡臭假單胞菌

43、PT01的菌懸液，以pH為9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋至1.0×109cells/mL，以100µl/孔的劑量包被酶標(biāo)板孔,以1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512稀釋1號的大黃魚抗血清, 每個稀釋度加并排的兩孔作為重復(fù)；第12孔加100µlPBS作為空白對照。以1∶250、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000稀釋兔抗黃魚免疫球蛋白單

44、抗，HRP一羊抗兔IgG按1∶10000稀釋，在酶標(biāo)儀492nm波長處讀取OD值。</p><p>　　(5) 夾心ELISA法檢測不同時間采取的黃魚抗血清的抗體效價</p><p>　　采用(3)夾心ELISA法檢測大黃魚血清抗體水平的方法檢測1-~4組采取的大黃魚抗血清（注射抗原組）的效價比。其中，全菌抗原以pH9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋至1×109cells/mL。蛋白抗原以

45、pH9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋至5 µg/mL。</p><p><b>　　3.6 攻毒</b></p><p>　　注射21d后，從免疫組和對照組分別撈取10尾供試魚，對每尾魚經(jīng)腹腔注射0.2ml濃度為1.0×107cells/mL活菌液，觀察14d，紀(jì)錄死亡狀況，并進(jìn)行解剖和病原的再分離以確定是否死于攻毒活菌引起的感染。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計算免疫保護(hù)率

46、(Relative percentage of survival, RPS),</p><p>　　RPS=（1－免疫組死亡率/對照組死亡率）×100</p><p><b>　　4.結(jié)果</b></p><p>　　4.1 生物膜多糖的電泳檢測及銀染結(jié)果</p><p>　　粗提的生物膜多糖采用解離非連續(xù)緩沖

47、系統(tǒng)垂直板電泳實(shí)驗(yàn)，并經(jīng)過銀染得到惡臭假單胞菌生物膜多糖的特異性條帶，詳見圖1。由此可知，生物膜多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物含有近10條不同分子式量的條帶，除去其中一條分子量低于14.3kDa的主要條帶外，其它條帶分子量大于29.0kDa，且大于66.4kDa的分子量的條帶較多，圖中的條帶較密集，甚至有大于97.2kDa的大分子多糖存在。這與王正榮[11]等研究所得相符：生物膜多糖是微生物在生物膜狀態(tài)下，其生長過程中合成并分泌的高分子黏性糖類聚合

48、物。</p><p>　　M:蛋白mark，1:PT01生物膜多糖</p><p>　　圖1電泳檢測銀染結(jié)果</p><p>　　4.2 血漿中白細(xì)胞的吞噬活性、吞噬指數(shù)的影響</p><p>　　大黃魚白細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌數(shù)的情況見圖2。真骨魚類中參與顆粒性異物吞噬的主要有單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。從圖中可以看出，部

49、分菌體已經(jīng)被吞噬到白細(xì)胞內(nèi)。</p><p>　　圖2 大黃魚白細(xì)胞吞噬細(xì)菌</p><p>　　根據(jù)SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析可得惡臭假單胞菌生物膜多糖對大黃魚白細(xì)胞吞噬功能的影響，詳見表2。由表2可以看出惡臭假單胞菌全菌疫苗、其生物膜菌體和生物膜多糖無論是吞噬百分比（PP）還是吞噬指數(shù)（PI）均較顯著地高于空白對照（P<0.05）；不同抗原免疫組間無顯著性差異。</p&g

50、t;<p>　　表2 惡臭假單胞菌生物膜多糖對大黃魚白細(xì)胞吞噬功能的影響</p><p>　　注：a 表示顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　4.3 血清中溶菌酶活力的影響</p><p>　　全菌疫苗組、生物膜菌體組和生物膜多糖組的溶菌酶活力基本相同，分別為0.216、0.214和0.217；而空白對照組的溶菌酶活力為0.201。由

51、此可知，惡臭假單胞菌能提高大黃魚血清中溶菌酶的活性，各免疫組與空白對照組相比有較顯著性差異（P<0.05）；不同抗原免疫組間無顯著性差異。詳見表3。</p><p>　　表3 惡臭假單胞菌生物膜多糖對大黃魚血清中溶菌酶活性的影響</p><p>　　注：a 表示顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　4.4 間接ELISA法檢測血清抗體效價<

52、;/p><p>　　本實(shí)驗(yàn)建立的三抗體夾心間接ELISA的方法檢測大黃魚抗血清的效價比，通過包被全菌抗原或蛋白抗原到固相載體上，無關(guān)蛋白封閉后，加入待檢大黃魚抗血清，則抗原抗體特異性結(jié)合形成固相復(fù)合物。其它蛋白通過洗滌除去，再加入兔抗大黃魚免疫球蛋白多抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。此時固相載體上的酶量與待檢大黃魚抗血清呈一定比例，加入與酶反應(yīng)的底物（OPD）后，底物被酶催化成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與待檢大黃魚抗血清的量直

53、接相關(guān)。測定其OD值（492nm處）可進(jìn)行相關(guān)的定量分析。 本實(shí)驗(yàn)中陽性血清測得的OD492值要比空白對照高很多（比如0.852和0.088），差異顯著（P<0.05），表明可以形成三抗體夾心ELISA結(jié)構(gòu)，三抗體配對良好。從而可以說明，兔抗大黃魚多抗 ELISA檢測法具有一定的可靠性。此外，空白對照（PBS代替一抗）小于1.000時，二抗稀釋度為最佳，本實(shí)驗(yàn)中二抗1∶2000稀釋時，空白對照OD值小于1.000，說明最佳

54、二抗稀釋度為1∶2000。詳見表4。</p><p>　　表4 測定二抗最佳稀釋濃度</p><p>　　使用不同組分免疫后的大黃魚血清抗體效價為：注射生物膜多糖組（1號）達(dá)到210，口服全菌疫苗組（2號）達(dá)到25，口服生物膜菌體（3號）組達(dá)到24，空白對照組（4號）達(dá)到22。由此可見，全菌疫苗組、生物膜菌體組和生物膜多糖組的抗體效價均顯著高于空白對照組，即惡臭假單胞菌及其生物膜多糖均能提

55、高大黃魚的免疫性能；且生物膜多糖注射組的抗體效價顯著高于其他兩口服免疫組。詳見圖3。</p><p>　　圖3 大黃魚免疫后血清抗體效價檢測結(jié)果</p><p>　　4.5 大黃魚的免疫保護(hù)率</p><p>　　受免和對照大黃魚經(jīng)活菌攻擊后14d內(nèi)出現(xiàn)不同程度的死亡，死亡時間集中在攻擊后4至9天，而在此以后死亡率就趨于穩(wěn)定，未免疫的對照組（對照1）全部死亡。從瀕死

56、的各組大黃魚的肝、脾、腎中重新分離到了惡臭假單胞菌，可以確定試驗(yàn)中的死亡是由于受到惡臭假單胞菌感染而引起。各免疫組對人工攻擊表現(xiàn)了有效保護(hù)，3號生物膜多糖注射免疫組獲得了70%的免疫保護(hù)率；1號全菌體口服免疫和2號生物膜菌體口服免疫組的保護(hù)率稍低，均為60%。同期注射生理鹽水的對照組健康魚（對照2）生存情況良好，未出現(xiàn)發(fā)病和死亡。詳見表5。</p><p>　　表5 人工攻毒后14天內(nèi)大黃魚的累計死亡率和免疫保護(hù)

57、率(RPS)</p><p>　　注：1號為口服全菌疫苗，2號為口服生物膜菌體，3號為注射生物膜多糖，</p><p>　　對照1為未免疫經(jīng)活菌攻擊組，對照2為未免疫注射生理鹽水的空白對照組。</p><p><b>　　5.討論</b></p><p>　　生物膜多糖是分泌于菌體外的一種含復(fù)雜多糖成分的黏液，具有利于菌

58、體附著、形成生物膜保護(hù)菌體的作用[12]。它還具有抗感染、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射及抗變性反應(yīng)的作用[13]。隨著對生物膜多糖免疫活性的研究，人們發(fā)現(xiàn)，它還是一類無毒、高效、無殘留的免疫增強(qiáng)劑[14,15]，其能夠提高機(jī)體的免疫功能，并通過提高機(jī)體的免疫力達(dá)到抗腫瘤的效果，具有良好的防病治病效果。其應(yīng)用于養(yǎng)殖動物中時，通過動物的消化吸收或直接注射進(jìn)入動物體內(nèi)，激活了免疫系統(tǒng)，使動物的非特異性和特異性免疫機(jī)能均得到較大加強(qiáng)，提高了其對細(xì)菌性

59、疾病等的抵御能力，使養(yǎng)殖動物的成活率提高。</p><p>　　惡臭假單胞菌是假單胞菌科假單胞菌屬中的一個種，是魚類的一種病原菌，常從腐敗的魚類中檢出[16]。而假單胞菌引起的疾病在世界各地的溫水性或冷水性的海、淡水魚中都可能發(fā)生，是海水中的正常菌群，為條件致病菌，其致病性主要取決于魚體的生理狀態(tài)及水環(huán)境的理化條件。樊海平[17]在論述魚的爛鰓病時也提到惡臭假單胞菌是魚的白云病和爛鰓病的病原菌，并可以引起魚類的死

60、亡。該菌也是近年來東海海域養(yǎng)殖大黃魚、黑鯛等的重要病原，引起較高的死亡率[6,18]。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)用惡臭假單胞菌的全菌疫苗、生物膜菌體及生物膜多糖來免疫大黃魚，在經(jīng)過21d的免疫后，檢測大黃魚血漿中血細(xì)胞的吞噬百分比和吞噬指數(shù)和血漿中溶菌酶活性，并用間接ELISA法檢測血清抗體效價，通過人工攻擊法獲得免疫保護(hù)率的數(shù)據(jù)。研究結(jié)果表明，免疫組大黃魚白細(xì)胞的吞噬活性均顯著高于對照組；溶菌酶活性也是如此；

61、且受免組的抗體效價均明顯高于對照組，顯示了生物膜多糖免疫有效地激發(fā)了大黃魚的非特異性免疫和特異性的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答；雖然生物膜菌體口服免疫組在人工攻擊中保護(hù)率不是十分理想，這可能是由于生物膜經(jīng)口給予時被部分消化和降解的緣故。</p><p>　　當(dāng)前，網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚病害頻發(fā)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的藥物治理已顯現(xiàn)出它的缺陷（如抗藥性的生成），因此盡快尋找到一種新的能迅速普及的方法來防治這些病害是刻不容

62、緩的。雖然近年來免疫活性多糖的研究已成熱點(diǎn)，但是對于細(xì)菌生物膜多糖的免疫學(xué)研究還是較少。本研究初步顯示了惡臭假單胞菌生物膜多糖可以有效增強(qiáng)大黃魚的免疫功能，未來或許可用作開發(fā)水產(chǎn)動物的免疫增強(qiáng)劑，它不僅可以提高動物抗病力，同時具有無藥物殘留、無污染等優(yōu)勢，具有較好的應(yīng)用前景。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 胡慧子,任淑華,高

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66、荔朋.微生物胞外多糖對養(yǎng)殖動物的免疫增強(qiáng)作用[J]. 福建畜牧獸醫(yī),2006,28(1):53-54.</p><p>　　[10] Kives J., Orgaz B., SanJose C. Polysaccharide differences between planktonic and biofilm-assosciated EPS from Pseudomonas fluoresens B52”, Co

67、lloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2006, 52, 123-127.</p><p>　　[11] 王正榮,生吉萍,申琳. 細(xì)菌胞外多糖的生物合成與基因控制[J].生物技術(shù)通報,2010(11):48-55.</p><p>　　[12] 張樹政.糖生物學(xué)與糖生物工程[M].北京,清華大學(xué)出版社,2002,1-13.</p><

68、;p>　　[13] 許金花.生孢噬纖維菌的分離鑒定及胞外多糖的免疫作用的研究[D].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.</p><p>　　[14] 黃曉波,趙良啟.細(xì)菌胞外多糖的研究和應(yīng)用[J].山西化工,2006,26(1):10-13.</p><p>　　[15] 謝荔朋.微生物胞外多糖對養(yǎng)殖動物的免疫增強(qiáng)作用[J]. 福建畜牧獸醫(yī),2006,28(1):53-54.</p>

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70、(3):23-28.</p><p><b>　　致 謝</b></p><p>　　本文是在我的導(dǎo)師毛博士的悉心指導(dǎo)下完成的。在課題研究和論文撰寫的整個過程中，毛老師給予了細(xì)心的指導(dǎo)和不懈的支持。毛老師的淵博學(xué)識，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，孜孜不倦的進(jìn)取精神以及誨人不倦的高尚師德都深深影響著我，使我受益良多，這對我以后的工作和生活也有了很大的幫助。本文從選題到完成，都傾注

71、了毛老師大量的心血，學(xué)生的每一點(diǎn)進(jìn)步都是在毛老師的耐心教導(dǎo)下取得的。在此，謹(jǐn)向毛老師表示衷心的感謝！ </p><p>　　另外，感謝邱師姐在此工程中給予的指導(dǎo)與幫助，邱師姐嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)態(tài)度深深影響了我。感謝在大學(xué)四年里所有教育過我的老師們，感謝他們四年來對我的教導(dǎo)、關(guān)心和支持，讓我學(xué)到了很多生活的道理。在此對他們給予我的諸多幫助表示由衷的感謝！另外，我要感謝一直關(guān)心我、支持我的親人和朋友，是你們給了我堅(jiān)持不解的

72、勇氣和克服困難的信心。謹(jǐn)以此文對關(guān)心和幫助我的人們表示衷心的感謝！</p><p>　　最后，再次向所有關(guān)心和幫助過我的領(lǐng)導(dǎo)、老師、同學(xué)和朋友們表示感謝！同時向參加論文評閱、評議及答辯組的老師們，致以誠摯的謝意，感謝你們能在百忙中給予指導(dǎo)！</p><p>　　附錄1 電泳及銀染法</p><p>　　采用解離非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳</p><

73、p>　　（1）SDS-PAGE電泳板的處理：用中性洗滌劑清洗后，再用雙蒸水淋洗，然后用無水乙醇浸潤的棉球擦拭，用吹風(fēng)機(jī)吹干備用；（2）12%分離膠的制備（ddH2O 2mL,30%Acr/Bis 4mL，4×分離膠緩沖液2mL，10%過硫酸銨50uL，TEMED 5uL）：充分混勻凝膠組分，立即灌膠：將膠液緩慢倒入固定在垂直電泳槽中的兩電泳板之間的狹槽中(注意不要產(chǎn)生氣泡)。立即在分離膠上面輕輕覆蓋一層ddH2O；室溫

74、靜置30min，使膠完全聚合，除去上層水相，然后用濾紙吸干水份；（3）5%濃縮膠的制備（ddH2O 2.3mL,30%Acr/Bis 0.67mL，4×分離膠緩沖液1mL，10%過硫酸銨30uL，TEMED 5uL）：充分混勻凝膠組分，立即灌膠：將膠液緩慢倒入分離膠上的狹槽中(不要產(chǎn)生氣泡)，插入樣品梳；室溫靜置聚合，待聚合完全后拔去梳子；（4）樣品的準(zhǔn)備：取裂解液與相應(yīng)量的5×上樣緩沖液混合，煮沸10min，稍

75、微離心后，取上清；（5）電泳：在電泳槽中加滿緩沖液。用微量玻璃注射器上樣。穩(wěn)流15mA電泳約3.5h，至溴酚藍(lán)遷移至膠下緣結(jié)束電泳；（6）染色：電泳完畢，小心取</p><p><b>　　銀染法</b></p><p><b>　　1. 試劑：</b></p><p>　　（1）甲醛固定液：20mL甲醇、25 uL

76、37%甲醛定容至50mL</p><p>　?。?）硫代硫酸鈉（母液）：2g/L</p><p>　?。?）硫代硫酸鹽顯影液：1.5g無水碳酸鈉，100uL 2g/L硫代硫酸鈉、25 uL 37%甲醛定容至50mL</p><p>　?。?）20%硝酸銀（母液）</p><p><b>　　2.操作步驟</b></

77、p><p>　?。?）將凝膠放入干凈的培養(yǎng)皿中，加入50mL甲醛固定液，搖動10min</p><p>　?。?）去掉甲醛固定液，用水洗2次，每次5 min</p><p>　　（3）去掉水，加入硫代硫酸鈉液0.2g/mL（母液稀釋），搖動1 min</p><p>　?。?）去掉硫代硫酸鈉液，加水洗2次，每次20秒</p><