生物科學畢業(yè)論文東海陸架沉積物古菌多樣性研究

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　東海陸架沉積物古菌多樣性研究</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物科學

2、 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b><

3、/p><p><b>　　摘要i</b></p><p>　　Abstractii</p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1.材料與方法2</b></p><p><b>　　1.1實驗材料2</b

4、></p><p>　　1.1.1實驗樣品2</p><p>　　1.1.2 主要生化試劑（盒）2</p><p>　　1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基配制3</p><p>　　1.1.4 實驗儀器4</p><p><b>　　1.2實驗方法5</b></p><

5、;p>　　1.2.1樣品DNA的提取5</p><p>　　1.2.2 16S rDNA基因的PCR擴增6</p><p>　　1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化6</p><p>　　1.2.4 重組載體的構(gòu)建7</p><p>　　1.2.5 重組載體的轉(zhuǎn)化7</p><p>　　1.2.6 重組子的克隆

6、7</p><p>　　1.2.7 基因文庫克隆的鑒定8</p><p>　　1.2.8 系統(tǒng)發(fā)育分析8</p><p>　　1.2.9 溫度梯度凝膠電泳(TGGE)分析8</p><p>　　2.結(jié)果與分析10</p><p>　　2.1 樣品DNA的提取10</p><p>　　

7、2.2 16S rDNA基因擴增與純化10</p><p>　　2.3 克隆文庫的構(gòu)建與鑒定11</p><p>　　2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析12</p><p>　　2.4.1古菌多樣性分析12</p><p>　　2.4.2 古菌各類群分布分析14</p><p>　　2.4.3 古菌系統(tǒng)發(fā)育分析16<

8、;/p><p>　　2.5 溫度梯度凝膠電泳（TGGE）結(jié)果16</p><p><b>　　3.討論17</b></p><p>　　3.1 實驗方法的改進17</p><p>　　3.1.1 16S rDNA基因擴增體系的優(yōu)化17</p><p>　　3.1.2 核酸序列分析方法研究古菌多

9、樣性的優(yōu)缺點18</p><p>　　3.2 古菌群落特征分析18</p><p>　　3.2.1 古菌群落垂直分布特征分析18</p><p>　　3.2.2古菌多樣性分析19</p><p><b>　　參考文獻20</b></p><p>　　附譯文：南海西沙海槽表層沉積物微生物多

10、樣性錯誤!未定義書簽。</p><p>　　附譯文原文錯誤!未定義書簽。</p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　[摘要]海底沉積物中蘊含大量的微生物類群，它們是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。通過對海洋沉積物古菌多樣性的研究，有助于人們更深入地了解海洋

11、。本文利用基于16S rDNA的分子生物學技術(shù)對東海陸架表層沉積物的古菌進行了研究，結(jié)果表明：沉積物中古菌序列分屬兩個大類：泉古生菌(Crenarchaeota)和廣古生菌(Euryarchaeota) 。以Marine Crenarchaeotic Group I(MG I，51.1%）和Miscellaneous Crenarchaeotic Group (MCG，37.2%)為主要類群，其余還有少量Marine Benthic G

12、roup C (MBGC，4.3%)、Marine Benthic Group A (MBGA，1.1%)和Anaerobic Methanotrophic Euryarchaeota（ANME，1.1%）。通過研究發(fā)現(xiàn)東海陸架沉積物蘊含著大量的古菌資源，同時也為進一步研究海洋沉積物古菌多樣性奠定基礎(chǔ)。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 東海陸架；沉積物；16S rDNA；古菌多樣性</p><

13、p><b>　　Abstract</b></p><p>　　[Abstract]Marine sediments were estimated to contain a huge amount of microbe, which was of great importance to the marine ecology. It would help us explore the oc

14、ean by the analysis of archaeal diversity in sediments. We used molecular technology based on 16S rDNA to study the archaeal community of marine sediments from the East China Sea. The result showed that all the archaea w

15、ere uncultivable and could be divided into two groups, Crenarchaeota and Euryarchaeota, respectively. Two archaea gro</p><p>　　[Key words] the East China Sea; Sediments; 16S rDNA; archaeal diversity</p>

16、;<p><b>　　引言</b></p><p>　　海洋是一個巨大的生態(tài)系統(tǒng)，海洋中的各種微生物是構(gòu)成海洋生態(tài)系統(tǒng)的基本元素，而海洋沉積物是海洋歷史的見證，在漫長的地質(zhì)年代里，由河流和大氣輸入海洋的物質(zhì)以及人類活動中落入海底的東西，這些物質(zhì)包括軟泥沙、灰塵、動植物的遺骸、宇宙塵埃等[1]。海底沉積物中蘊藏著巨大的生物量，是地球上微生物分布最為豐富的地區(qū)，其含量可能占全球生物

17、量1/10～1/3，甚至達到原核生物量的65%[2]。</p><p>　　由于沉積物大部分都位于水面以下數(shù)百米甚至數(shù)千米，處在一個寒冷、黑暗、高壓等特殊的環(huán)境中，因此微生物代謝活動很低，然而這種特殊生境對于全球物質(zhì)循環(huán)發(fā)揮了重要作用：首先，海洋微生物在深海沉積物的碳、硫循環(huán)中作用顯著，它們是甲烷的產(chǎn)生與消耗、硫酸鹽的還原和硫化物的氧化的重要部分；其次，由于它們能夠釋放出甲烷、二氧化碳和硫化氫等溫室氣體，因此對上

18、層海水乃至全球氣候的變化都具有重要影響；同時微生物的群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子有顯著的相關(guān)性，是反映海底沉積物環(huán)境特征的重要標志物。</p><p>　　海洋微生物生活在高鹽、高壓、低氧、低光照等極端條件，具有在物種、基因組成和生態(tài)功能等方面的多樣性，已發(fā)現(xiàn)的類群主要包括: 病毒、古菌、細菌、粘細菌、真核微生物。</p><p>　　然而，由于技術(shù)的限制，海底99%以上的原核生物不可培養(yǎng)，因此無法

19、通過常規(guī)手段對其進行深入研究。上世紀八十年代中期，美國科學家Norman Pace和他的同事們首先展開了對環(huán)境微生物的培養(yǎng)，直接利用環(huán)境樣品的總DNA進行16S rDNA的PCR擴增并進行鑒定[3]，開辟了將分子生物學技術(shù)直接應(yīng)用于微生物生態(tài)學及多樣性研究的新紀元。近年來，由于分子生物學和PCR技術(shù)的在分類上的應(yīng)用日益廣泛，使得基于16S rDNA基因的分子生物技術(shù)成為研究海底沉積物原核生物多樣性的不可替代的手段[2]。</p&g

20、t;<p>　　古菌是目前生物地球化學研究的熱點之一，它們能在各種極端條件下存在，是海洋微生物生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在全球的生物地球化學作用中扮演重要角色。通過對該領(lǐng)域研究，可以深化對特殊極端環(huán)境古菌的研究，揭示生命起源和物種進化，闡明古菌群落與生物地化循環(huán)之間的關(guān)系，所以對其研究就有著極其重要的現(xiàn)實意義[4,5]。</p><p>　　在本文中，我們利用非培養(yǎng)的分子技術(shù)研究東海區(qū)某站點沉積物（編

21、號13）中的古菌群落，構(gòu)建東海古菌16S rDNA基因文庫，然后對克隆序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，研究沉積物中古菌群落的多樣性，為生態(tài)系統(tǒng)功能的理解和海洋微生物資源的開發(fā)利用提供重要的理論指導。</p><p><b>　　1.材料與方法</b></p><p><b>　　1.1實驗材料</b></p><p><b&g

22、t;　　1.1.1實驗樣品</b></p><p>　　采用多管采樣器采集13號站點的表層沉積物柱狀樣品（0-10cm），根據(jù)層次不同依次編號：編號：131，132，133，134（取樣深度分別為水-沉積物界面以下0~3cm，3~5cm，5~8cm，8~10cm），船上-20℃冰箱保存，回實驗室后進行樣品分裝，將樣品分裝為5ml（2管）和10ml（1管）凍存管，等，然后在-72℃超低溫冰箱中保存，以備

23、后續(xù)實驗使用。</p><p>　　圖1.1 13號樣品采集站點位置圖</p><p>　　Fig1.1 The location of NO.13 Sample</p><p>　　1.1.2 主要生化試劑（盒）</p><p>　　土壤核酸快速提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司</p>

24、<p>　　瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司</p><p>　　TaKaRa pMD19-T Vector試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司</p><p>　　TaKaRa Taq 寶生物工程（大連）有限公司</p><p>　　T

25、aKaRa Premix Ex taq 寶生物工程（大連）有限公司</p><p>　　DL2000 DNA marker 寶生物工程（大連）有限公司</p><p>　　DH5α感受態(tài)細胞 天根生化科技（北京）有限公司</p><p>　　引物

26、 上海生工科技公司</p><p>　　1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基配制</p><p>　　* 50×TAE的配制（1L）</p><p>　　Tris 242g</p><p>　　冰醋酸 5

27、7.1ml</p><p>　　EDTA（0.5mol/L,pH=8.0） 100ml</p><p>　　使用前50倍稀釋為1×TAE，即可用于瓊脂糖凝膠的配制和電泳。</p><p>　　* 6×甘油上樣緩沖液的配制（100ml）</p><p>　　甘油

28、 50ml</p><p>　　1%溴酚藍 5ml</p><p>　　EDTA 30mmol</p><p>　　使用前取1ml該溶液，按1:2000的比例加入0.5μl SYBR Green I（invitrogen）核酸染料。</p>&

29、lt;p>　　* LB培養(yǎng)基（1L，pH=7.5）</p><p>　　Trypetone 10g</p><p>　　Yeast Extract 5g</p><p>　　NaCl 10g</p><p&

30、gt;　　向液體培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂粉即為LB固體培養(yǎng)基；向培養(yǎng)基中加入300μl 20%（200mg/ml）氨芐青霉素即為Amp抗性LB培養(yǎng)基。</p><p>　　* X-gal貯液</p><p>　　將X-gal粉末溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配成20mg/mL的貯液，分裝后避光保存于-20℃以備使用，無須過濾或滅菌。</p><p><b

31、>　　* IPTG溶液</b></p><p>　　將IPTG粉末溶于無菌水中，配成200mg/mL的溶液，分裝后保存于-20℃以備使用，無須過濾或滅菌。</p><p>　　* 丙烯酰胺（40%，37.5:1）</p><p>　　將38.96g的丙烯酰胺，以及1.03g的甲叉雙丙烯酰胺溶于雙蒸水中，定容到100ml，過濾后備用。</p&g

32、t;<p>　　* 固定液（10%乙酸，30%乙醇）</p><p>　　將100ml乙酸，300ml乙醇用雙蒸水定容到1000ml。</p><p>　　* 敏化液（30%乙醇）</p><p>　　將300ml乙醇用雙蒸水定容到1000ml。</p><p>　　* 銀染液（0.1%AgNO3）（新鮮配制）</p>

33、;<p>　　先配制20%母液，將2g AgNO3溶解于雙蒸水中，定容到10ml，放置于棕色瓶中密閉保存。每次使用時，取2ml母液，稀釋到400ml，再加入400μl福爾馬林溶液（37%甲醛）。</p><p><b>　　* 顯影液</b></p><p>　　溶液1：溶解2gNa2S2O3于雙蒸水中，定容到10ml。</p><p

34、>　　溶液2：溶解10mlNa2CO3于雙蒸水中，定容到400ml。</p><p>　　使用時，將400μl溶液1加入到溶液2中，再加入400μl的福爾馬林溶液。</p><p><b>　　* 終止液</b></p><p>　　溶解5.84g EDTA2Na?2H2O以及8g甘氨酸于雙蒸水中，定容到400ml。</p>

35、<p>　　1.1.4 實驗儀器</p><p>　　快速核酸提取儀 Fast Prep—24（MP Biomedicals，US）</p><p>　　PCR儀 T-Gradient（Biometra，Germany）</p><p>　　TGGE系統(tǒng) Biometra(Ge

36、rman）</p><p>　　冷凍離心機 艾本德中國有限公司Eppendorf 5417R</p><p>　　移液器 艾本德中國有限公司</p><p>　　電泳儀 北京市六一儀器廠DYY-6C型</p><p>　　超凈工作臺

37、 蘇州市潔凈技術(shù)設(shè)計所SW-CJ-IFD型</p><p>　　電熱恒溫振蕩水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司DK2-2型</p><p>　　臺式恒溫震蕩培養(yǎng)箱 江蘇太倉培英一起有限公司HZP-250型</p><p>　　電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司DNP-9272型</p><p&g

38、t;　　隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司GNP-9160型</p><p>　　超低溫冰箱 日本三洋SANYO，MDF-382E</p><p>　　高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備YXQ-LS-SⅡ</p><p>　　凝膠成像系統(tǒng) GD 2000（BIO-RAD

39、，USA）</p><p>　　冰箱 西門子（中國）有限公司 BCD-226</p><p><b>　　1.2實驗方法</b></p><p>　　1.2.1樣品DNA的提取</p><p>　　采用土壤中核酸快速提取試劑盒（Fastprep24 Soil DNA kit，MPBI

40、O）提取沉積物131、132、133、134的環(huán)境基因組總DNA。提取步驟按照試劑盒說明進行，具體如下：</p><p>　　1）將500mg土壤樣品加入Lysing Matrix E裂解管中。</p><p>　　2）加入978ul的磷酸緩沖液Sodium Phosphate Buffer到Lysing Matrix E裂解管中。</p><p>　　加入122u

41、l的MT緩沖液。</p><p>　　4）在快速核酸提取儀中，以6.0m/s的速度對樣品進行提取，時間持續(xù)40秒。</p><p>　　5）14000×g離心5－10分鐘，去除殘片。</p><p>　　（注：離心時間延長至15分鐘，可以去除大的樣品中多余的殘片，或是有利于從復(fù)雜的細胞壁中分離細胞）</p><p>　　6）將上清轉(zhuǎn)

42、移到干凈的2ml離心管中，加250ul PPS（蛋白質(zhì)沉淀液），用手拿住管子上下?lián)u晃10次。</p><p>　　7）14000×g離心5－10分鐘，去除殘片。將上清轉(zhuǎn)移到干凈的15ml離心管中。</p><p>　　（注：這一步用2ml的離心管也可以，但是大的管子對DNA混合和附著更為有效）</p><p>　　8）將Binding Matrix溶液混勻

43、，加入1.0 ml Binding Matrix溶液到含上清的15 ml離心管中。</p><p>　　9）將離心管放在漩渦振蕩器上，或者放在手上顛倒搖勻2分鐘；將離心管放在管架上靜置3分鐘，等待硅石沉淀。</p><p>　　10）小心將500ul的上清移除，注意不要碰到附著的顆粒沉淀。</p><p>　　11）在剩下的上清液中將Binding Matrix重懸

44、，將大約600ul的混合液加入SPIN濾膜中，14000×g離心1分鐘，將截留管catch tube倒空，加入剩下的混合液到SPIN濾膜，重新離心1次，將截留管catch tube再次倒空。</p><p>　　12）加入500ul準備好的SEWS-M液體，用槍頭吸取液體，輕輕的將小球重懸。</p><p>　?。ㄗⅲ捍_保乙醇已經(jīng)加入SEWS-M濃縮液中）</p>

45、<p>　　13）14000×g離心1分鐘，將截留管catch tube倒空，換一個新的管。</p><p>　　14）不加任何液體，14000×g離心1分鐘，再重復(fù)1次，以便將填料中剩余的溶液甩干。將截留管catch tube倒空，更換管子。</p><p>　　15）將SPIN濾膜放置在空氣中，室溫干燥5分鐘。</p><p>　　

46、16）將附著顆粒（SPIN濾膜上）在50－100ul的DES（除熱源和核酸酶的超純水）中溫和重懸。</p><p>　?。ㄗⅲ簽楸苊饧兓腄NA過度稀釋，請加入能起到重懸作用的最少量的DES；如果在55℃熱快或水浴中孵育5分鐘，可能DNA的產(chǎn)量會更高）</p><p>　　17）14000×g離心1分鐘，將洗脫的DNA轉(zhuǎn)移到干凈的截留管catch tube中，將SPIN濾膜丟棄，

47、DNA可以用于PCR或其他下游實驗使用，－20℃長期保存。</p><p>　　提取完成后，以DL2000 DNA marker作為標準的分子量標記，通過瓊脂糖凝膠（1.0%）電泳檢測所提取的沉積物基因組總DNA。</p><p>　　1.2.2 16S rDNA基因的PCR擴增</p><p>　　古菌文庫16S rDNA的PCR 擴增采用古菌16S rDNA擴增

48、通用引物： Arch21F ：5’-TTCYGGTTGATCCYGCCRGA-3’；Arch958R：5'- YCCGGCGTTGAMTCCAATT -3'（該引物對退火溫度56.7℃[6]，上海生工生物工程公司）進行。PCR擴增反應(yīng)體系如下：</p><p>　　模板DNA 1.0μl</p><p>　　Arch958r(10μ

49、M) 1.0μl</p><p>　　Arch21f(10μM) 1.0μl</p><p>　　10×PCR Buffer(Mg2+ free) 2.5μl</p><p>　　dNTP(各2.5mM) 2.0μl</p><

50、p>　　Mg2+(25mM) ?2.5μl</p><p>　　TaKaRa Taq(5U/μl) 0.5μl</p><p>　　用雙蒸水（ddH2O）補足25μl；</p><p>　　利用梯度PCP擴增古菌（一式四管），反應(yīng)條件為95℃變性30s，55~60℃復(fù)性30s，72℃延伸60s，如

51、此反應(yīng)進行35個循環(huán)，然后在72℃再延伸10min，最后4℃保存。反應(yīng)完成后PCR產(chǎn)物通過1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗，以DL2000 DNA marker作為標準的分子量標記。</p><p>　　1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化</p><p>　　經(jīng)PCR反應(yīng)獲得的DNA溶液用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根，北京）進行純化，用1.2%的瓊脂糖凝膠，操作按照試劑盒說明進行：</p&g

52、t;<p>　?、僦胶猓合蛭街鵆A2（吸附柱放入收集管中）中，加入500μL平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。</p><p>　?、趯我坏哪康腄NA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分），放入干凈的離心管中，稱取重量。</p><p>　?、巯蚰z中加入3倍體積（0.1g視為100μl）溶膠液PN，50℃水浴放置

53、約10min，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。</p><p>　?、軐⑸喜剿萌芤杭尤胛街鵆A2中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。倒去收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。</p><p>　?、菹蛭街鵆A2中加入600μL漂白液PW，12000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。</p><p>

54、;　?、尴蛭街鵆A2中加入600μL漂白液PW，12000rpm離心1min，倒掉廢液。</p><p>　?、邔⑽街呕毓苤校?2000rpm離心2min，盡量除盡漂洗液，將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。</p><p>　?、鄬⑽街诺揭粋€干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm

55、離心2min，收集DNA溶液，—20℃保存，防止DNA降解。</p><p>　　純化完成后PCR產(chǎn)物通過1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗，以DL2000 DNA marker作為標準的分子量標記。</p><p>　　1.2.4 重組載體的構(gòu)建</p><p>　　利用連接反應(yīng)試劑盒TaKaRa pMD19-T Vector進行，連接體系（總體積10μl）為：&l

56、t;/p><p>　　Solution I 5.0μl</p><p>　　PCR產(chǎn)物 4.2μl</p><p>　　TaKaRa pMD19-T vector 0.8μl</p><p>　　具體操作為：待載體與Solution于

57、冰上化開后按體系中順序逐一加入各物質(zhì)，后將連接混合液輕輕混勻，16℃連接過夜。</p><p>　　1.2.5 重組載體的轉(zhuǎn)化</p><p><b>　　操作步驟為：</b></p><p>　　①取感受態(tài)細胞DH5α，冰下融解5min，其間將100μL的槍頭在冰箱里冰凍（—20℃）預(yù)冷，最后將100μL DH5α加入連接產(chǎn)物中。</p

58、><p>　?、趯CR管42℃熱激90S，然后迅速置于冰上靜置3min。</p><p>　?、蹖CR管中的液體（連接產(chǎn)物+DH5α）加入不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，然后在37℃以180rpm振蕩培養(yǎng)1h。</p><p>　?、茉谂囵B(yǎng)過程中，將40μL（20mg/ml）X-Gal和7μL（200mg/ml）IPTG均勻涂布在預(yù)先準備好的含有氨芐青霉素的LB固

59、體平板上，使其充分吸收。</p><p>　?、菖囵B(yǎng)結(jié)束后，將菌液以4000rpm離心5min，去除大部分上清液，留約100μL液體，菌落重懸后加入到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，均勻涂布，并標記相關(guān)信息，置于37℃培養(yǎng)過夜。</p><p>　?。ㄒ陨纤胁僮髟诔瑑艄ぷ髋_中進行）。</p><p>　　1.2.6 重組子的克隆</p><p&

60、gt;　　將平板放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h～16h后可出現(xiàn)菌落，置于4℃數(shù)分鐘可使其顯色，用無菌牙簽在每個平板中挑取24個白色菌落（具體數(shù)量根據(jù)平板上實際菌落多少確定），置于已分裝好的裝有800μl含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的EP管中，編號，然后在37℃搖床以180rpm振蕩培養(yǎng)4~6h。</p><p>　　1.2.7 基因文庫克隆的鑒定</p><p>　　利用pMD19-T載

61、體引物M13F(-47) 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’和M13R(-48)5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’作為PCR反應(yīng)的引物，鑒定所篩選的克隆是否為真正的陽性克隆和辨別插入片斷的大小是否正確。以菌液為模板，PCR反應(yīng)體系為：</p><p>　　模板 0.5μl</p><p>　

62、　M13F(-47)(10mM) 0.2μl</p><p>　　M13R(-48)(10mM) 0.2μl</p><p>　　Premix Ex Taq 5.0μl</p><p>　　加雙蒸水補足至10μl；</p><p>　　PCR反應(yīng)條件為95℃變性30s，55~

63、60℃復(fù)性30s，72℃延伸60s，如此反應(yīng)進行32個循環(huán)，然后72℃再延伸10min，最后4℃保存。反應(yīng)完成后PCR產(chǎn)物通過1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗，以DL2000 DNA marker作為標準的分子量標記。</p><p>　　將陽性克隆子挑選出來，送生物公司（上海美吉生物技術(shù)公司）測序。</p><p>　　1.2.8 系統(tǒng)發(fā)育分析</p><p>　

64、　首先對原始序列進行初步處理，包括正反向序列的拼接、引物的剔除等操作，并將空載體或其他不正常的序列去除；對于剩余的古菌16SrDNA序列，然后逐一提交BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 來確定其16S rRNA基因同源序列（相似度大于95%），通過GenBank數(shù)據(jù)庫獲得其同源類群，再通過CLUSTALX 1.83程序?qū)ζ渫葱蛄羞M行歸類，最后利用MEGA軟件構(gòu)建261個真核克隆子的無根系統(tǒng)發(fā)育樹。&l

65、t;/p><p>　　1.2.9 溫度梯度凝膠電泳(TGGE)分析</p><p>　　變性梯度凝膠電泳，是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。它是一種很有用分子標記方法,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物多樣性調(diào)查、親緣關(guān)系鑒定、基因突變檢測等多個領(lǐng)域。具體操作如下：</p><p>　　1）去離子水

66、仔細洗滌制膠玻璃板，用紙巾擦干。再用酒精棉球擦一遍，用紙巾擦干。將支持膜夾在兩塊玻璃板之間，用夾子夾住，放置在桌上。</p><p>　　2）配膠（每塊配膠5ml），成分表1.1：</p><p>　　表1.1 凝膠成分表</p><p>　　Table 1.1 The consists of the TGGE gel </p><p>　　

67、3）將玻璃板傾斜放置，用1ml移液器將上面配制的膠緩緩灌入兩玻璃板之間。將玻璃板水平放置半小時以上，使膠凝固。</p><p>　　4）待膠凝固后，先用手撥去沒有點樣孔的玻璃板。用去離子水將支持膜背面沖洗干凈，用紙擦干，再揭開支持膜。</p><p>　　5）用1ml移液器在TGGE溫度面板上加800μl0.1% Triton。</p><p>　　6）用手抓住支持

68、膜的兩邊，先將膜中部放于加熱面板上，再慢慢將膜鋪展開，在膜和加熱面板間盡量不要形成氣泡。溫度梯度方向和電泳方向一致。</p><p>　　7）先將預(yù)先準備好的樣品加入上樣孔，每孔最多加3μl樣品。</p><p>　　8）在膠的兩端蓋上Waterman濾紙，濾紙的另一端浸入電泳緩沖液中。</p><p>　　9）蓋上蓋子，預(yù)電泳（200V，7min）。</p&

69、gt;<p>　　10）預(yù)電泳快結(jié)束時（6min50sec），暫停反應(yīng)。打開蓋子，揭開濾紙。在凝膠中間慢慢蓋上一層塑料膜。再將濾紙蓋在膠上，然后用一塊玻璃板壓在濾紙上。</p><p>　　11）蓋上蓋子，繼續(xù)電泳（200V，3h）。</p><p>　　12）電泳結(jié)束后，終止程序。將支持膜取出，先用去離子水沖洗一次。</p><p>　　13）將膜轉(zhuǎn)

70、移至固定液中，放置5min。</p><p>　　14）將膜轉(zhuǎn)移至去離子水中沖洗一次，再轉(zhuǎn)移至印染液中，放置在搖床上搖蕩，染色10min。</p><p>　　15）將膜在去離子水中沖洗2次，轉(zhuǎn)移至顯色液中。</p><p>　　16）待條帶出現(xiàn)后，將膜用去離子水沖洗3次，拍照。</p><p><b>　　2.結(jié)果與分析</

71、b></p><p>　　2.1 樣品DNA的提取</p><p>　　按照實驗操作說明，采用土壤核酸快速提取試劑盒（Fastprep24 Soil DNA kit，MPBIO）提取沉積物131、132、133、134的環(huán)境基因組總DNA。提取結(jié)束，以DL2000 DNA marker作為標準的分子量標記，通過1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗，從凝膠圖片（圖2.1）可以看出，基因組總

72、片段長度超過2000bp（其實際片段長度約為23.1kbp[7]）。</p><p>　　圖2.1 總DNA電泳圖</p><p>　　Fig 2.1 Environment genome DNA in the agarose gel</p><p>　　2.2 16S rDNA基因擴增與純化</p><p>　　使用古菌通用引物對Arch2

73、1F/ Arch958R對古菌16S rDNA基因進行PCR擴增，在本實驗中，共設(shè)置1×，5×，10×，20×四個濃度梯度和50~60℃間的8個退火溫度，反應(yīng)完成后，以DL2000 DNA marker作為標準的分子量標記對PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗，32個樣品都有大小合適的條帶出現(xiàn)，其凝膠圖像見圖2.2（詳細分析見討論部分）。</p><p>　　圖2.

74、2 16S rDNA基因擴增電泳圖</p><p>　　Fig2.2 The amplification of 16S rDNA gene in the agarose gel</p><p>　　參照操作說明，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目的片段進行純化回收。由于已經(jīng)除去那些非特異的擴增片段，在純化后的凝膠圖像（圖2.3）中，每個樣品只剩下一條約1,000bp的片段，說明純化的效果較

75、好。</p><p>　　圖2.3 PCR產(chǎn)物純化后電泳圖</p><p>　　Fig 2.3 The purification of PCR production in the agarose gel</p><p>　　2.3 克隆文庫的構(gòu)建與鑒定</p><p>　　將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，

76、經(jīng)培養(yǎng)過，在平板上長出了藍色和白色（為陽性重組子）的單菌落，其中以白色菌落在數(shù)量上占優(yōu)勢。</p><p>　　利用pMD19-T載體引物M13F(-47)和M13R(-48)對隨機挑去的陽性重組子進行檢測，以凝膠圖像中片段長度約為1,000bp左右的重組子為陽性克隆，并送至上海美吉生物科技公司測其16S rDNA核酸序列。最后從生物公司共得到95個古菌16S rDNA序列。</p><p&g

77、t;　　2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析</p><p>　　在測序得到的核苷酸序列中，95個古菌克隆子序列構(gòu)成了古菌16S rDNA文庫，其中131、132、133、134分別為33個、22個、24個、15個。</p><p>　　2.4.1古菌多樣性分析</p><p>　　從古菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2.4）可以看出，古菌文庫未檢索到已培養(yǎng)類型,全部同源序列來自水體（海洋、湖泊

78、、沼澤等）沉積物，其中大部分來自海洋沉積物。古菌文庫分別來自兩個大類:泉古生菌（Crenarchaeota）和廣古生菌（Euryarchaeota），泉古生菌在克隆文庫中占絕對優(yōu)勢。在泉古生菌中，共檢索到4個類群：Marine Crenarchaeotic Group I（MGI，占克隆文庫的51.1%）、Miscellaneous Crenarchaeotic Group（MCG，占克隆文庫的37.2%）、Marine Benthic

79、 Group C（MBGC，占克隆文庫的4.3%)和Marine Benthic Group A （MBGA，占克隆文庫的1.1%)，由于缺少相關(guān)文獻，另有3個OUT暫時不能確定其所屬類群；在克隆文庫中，僅檢索到1種廣古生菌，屬于Anaerobic Methanotrophic Euryarchaeota（ANME）類群，占克隆文庫的1.1%。還有2個OUT（克隆子131A46和131A56）與所有檢索到的克隆序列都不同源，相似度分別低

80、于80%和81%。</p><p>　　從古菌16S rDNA克隆子的親緣關(guān)系（表2.1）可以看出，在古菌克隆文庫中，大部分克隆子的同源序列在GenBank數(shù)據(jù)庫均已檢測到。MGI類群在克隆文庫中的含量相當高，而在MGI類群中，又以克隆子131A51和131A25為主，其相同克隆子的個數(shù)分別達到了15個和10個，最相近克隆子主要來自大港油田石油污染物鹽堿土壤、印度西海岸Mandovi河口沉積物。MCG類群是僅次于

81、MGI的第二大優(yōu)勢類群，131A50相同的克隆子有32個，在克隆文庫中的比例多達34%，最相近克隆子主要來自印度西海岸Mandovi河口沉積物，這說明該進化型在13號站點沉積物中含量極為豐富。ANME、MBGA和MBGC類群在沉積物中也有少量發(fā)現(xiàn)。</p><p>　　圖2.4 基于16S rDNA序列的東海陸架古菌多樣性系統(tǒng)發(fā)育分析</p><p>　　Fig. 2.4　Phylogen

82、etic analysis of the East China Sea archaeal diversity based on 16S rDNA sequen</p><p>　　表2.1 沉積物古菌16S rDNA克隆子的親緣關(guān)系</p><p>　　Table2.1 Taxonomic affiliation of clones recovered in the archaeal cl

83、one libraries from the sediments</p><p>　　2.4.2 古菌各類群分布分析</p><p>　　圖2.5 古菌類群分布柱狀圖</p><p>　　Fig2.5 the bar chart of the distribution of each group in every layer</p><p>

84、　　從古菌類群分布柱狀圖（圖2.5）可以看出，同一類群古菌在不同深度沉積物克隆文庫中所占比例具有較大的差別。隨著沉積物深度的增加，只有MBGC類群的同源序列在克隆文庫中所占比例有增加的趨勢，而其他類群并沒有呈現(xiàn)出有規(guī)律的變化趨勢。</p><p>　　圖2.6 古菌各類群在每層樣品中比例</p><p>　　Fig2.6 The percentage of archaea groups i

85、n every layer</p><p>　　從古菌類群在各層沉積物克隆文庫比例的餅狀圖（圖2.6）可以看出，除了131層外，其余三個層次沉積物古菌克隆文庫都是由泉古菌群的同源序列構(gòu)成，而且每層沉積物中各類群的所占比例具有很大的差異。MG I和MCG兩大類群的同源序列在古菌克隆文庫中占有絕對優(yōu)勢，二者所占比例已超過80%，而MBGA、MBGB等類群的同源序列只是零星分布，占有較小的比例。</p>

86、<p>　　2.4.3 古菌系統(tǒng)發(fā)育分析</p><p>　　MGⅠ為13號站點沉積物古菌的優(yōu)勢類群，有多個系統(tǒng)發(fā)育型，涵蓋克隆文庫中的48個克隆子，其同源序列分布較為廣泛，包括印度西海岸Modovi河口和Zuari河口、東南太平洋沉積物、海南島東部501位點沉積物、鄂霍次克海沉積物以及地中海東部深?；鹕交业?，其同源性較高，相似度均在98%以上。</p><p>　　MCG在13

87、號站點沉積物古菌克隆文庫中為僅次于MG I的第二大優(yōu)勢類群，有4中進化型，共35個克隆子。古菌16S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中比對最相似的序列均是不可培養(yǎng)的古菌，這些最相似的參考序列分布廣泛，主要來自于也有發(fā)現(xiàn)，相似度都在98%以上，同源性較高。</p><p>　　MBGA在13號站點沉積物古菌克隆文庫中僅分離到1種進化型，來自1個克隆子。其同源序列來源于印度中部西海岸熱帶河口沉積物（96%）、馬里亞

88、納海溝熱液口沉積物（95%）以及多米尼加Manantial del Toro洞穴的超鹽水（95%）中。</p><p>　　MBGC在13號站點沉積物古菌克隆文庫中也僅分離到1種進化型，來自1個克隆子，但在四層沉積物樣品中都分離到MBGC類群的同源序列。我們在鄂霍次克海深海甲烷水流沉積物（99%）、黃河三角洲沉積物（99%）以及南極深海沉積物中均檢索到期同源序列，但并不是其所在區(qū)域的優(yōu)勢物種。</p>

89、<p>　　ANME為13號站點沉積物僅分離到的唯一一條屬于泉古菌群的克隆序列，其同源序列來源于東地中海深?；鹕交页练e物，同源性較高（98%的相似性）。在鄂霍次克海甲烷水合物區(qū)和南海北部陸坡神狐海域也有發(fā)現(xiàn)其同源序列。</p><p>　　另外，還有2個克隆子（131A46和131A56）與所有檢索到的克隆序列都不同源，相似度分別低于80%和81%，具體原因有待更深入的研究。</p>

90、<p>　　2.5 溫度梯度凝膠電泳（TGGE）結(jié)果</p><p>　　我們曾多次使用TGGE對東海13號位點進行分析，可能是由于對電泳時間控制不好，每次都不能得到垂直電泳的清晰圖像，甚至凝膠上沒有出現(xiàn)條帶，水平電泳也僅有一條條帶，因而無法通過此方法對古菌群落進行多樣性分析。</p><p>　　圖2.7 水平TGGE結(jié)果示意圖</p><p>　　Fi

91、g2.7 The result of parallal TGGE</p><p><b>　　3.討論</b></p><p>　　3.1 實驗方法的改進</p><p>　　3.1.1 16S rDNA基因擴增體系的優(yōu)化</p><p>　　在2.2部分提到，本實驗使用古菌通用引物對Arch21F/ Arch958R對

92、古菌16S rDNA基因進行PCR擴增。由于對各擴增體系中各物質(zhì)的用量缺乏較為系統(tǒng)的認識，因此在實驗過程中不能順利擴增出16S rDNA基因片段，成為實驗中的瓶頸，使實驗陷入困局，不利于后續(xù)實驗。在經(jīng)過大量查閱文獻和多次試驗后發(fā)現(xiàn)如下配比最為合適：</p><p>　　模板DNA 1.0μl</p><p>　　Arch958r(10μM)

93、 1.0μl</p><p>　　Arch21f(10μM) 1.0μl</p><p>　　10×PCR Buffer(Mg2+ free) 2.5μl</p><p>　　dNTP(各2.5mM) 2.0μl</p><

94、p>　　Mg2+(25mM) 2.5μl</p><p>　　TaKaRa Taq(5U/μl) 0.5μl</p><p>　　用雙蒸水（ddH2O）補足25μl</p><p>　　但是，在本實驗中，提取總DNA后并沒有進行相關(guān)實驗測定總DNA濃度，因此我們不知道體系中模板DNA的用量。

95、再者，PCR過程中的退火溫度對16S rDNA基因的擴增也有很大影響，在得知引物對Arch21F/ Arch958R退火溫度為56.7℃后，我們需要對實驗條件進行深入探索，故設(shè)計如下實驗：設(shè)置1×，5×，10×，20×四個濃度梯度和50~60℃間的8個退火溫度（依次為60.0℃，59.3℃，58.1℃，56.3℃，54.0℃，52.3℃，50.9℃，50.0℃）擴增古菌16S rDNA基因，擴增結(jié)

96、果參見圖2.2。</p><p>　　從圖3可以看出，隨著總DNA濃度稀釋倍數(shù)的增大，條帶的亮度并沒有發(fā)生較大改變，因此在以后的實驗中，我們選擇以10×稀釋濃度為主，這樣可以減少總DNA的用量，節(jié)約實驗成本，更主要的是可以稀釋環(huán)境限制因子對PCR的抑制作用；從在50~60℃間的8個溫度梯度擴增的結(jié)果來看，16S rDNA基因的擴增與溫度并沒有太大關(guān)系，這8個溫度都能擴增出目的條帶，但是我們可以看出隨著退

97、火溫度的降低，非特異擴增條帶條數(shù)明顯增多，以至于后面的條帶的變得模糊，所以我們在后續(xù)實驗中采用57℃以上的退火溫度，以減少非特異條帶個數(shù)，有時候只有一條1000bp附近（實際應(yīng)為920bp附近）的一條條帶，更有利于擴增產(chǎn)物的純化回收?？紤]到我們即已得到較為合適的擴增條件，就沒有對60℃以上的退火溫度和更高倍數(shù)的總DNA稀釋進行研究，希望感興趣者能對16S rDNA基因的擴增條件進行更為深入細致的實驗，為以后的實驗提供便利。</p&

98、gt;<p>　　3.1.2 核酸序列分析方法研究古菌多樣性的優(yōu)缺點</p><p>　　本實驗采用16S rDNA基因擴增構(gòu)建克隆文庫的方法研究沉積物中古菌多樣性，通過對隨機的挑選陽性克隆子16S rDNA基因的測序，構(gòu)建古菌群落的基因文庫，最后比對分析古菌16S rDNA基因序列，得到古菌群落的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及群落中各類群所占比例，以達到實驗的最終目的。該方法的優(yōu)點是各項操作簡單，實驗?zāi)康拿鞔_，

99、步驟清晰明了，在短期內(nèi)能夠得到實驗結(jié)果，實驗過程綠色無毒；同時，使用這種方法能夠得到大量的目的基因信息，便于更深入的分析。</p><p>　　但是，這種方法也有一些缺點：首先，從經(jīng)濟方面來說，我們需要對得到的陽性克隆子進行測序，隨著樣品的增多，實驗成本也相應(yīng)地升高，單就測序費用就是一筆不小的開支；其次，挑選陽性克隆子有一定的隨機性，如果構(gòu)建的克隆文庫含有較少的克隆子序列，就不能準確評估沉積物群落的多樣性。在本實

100、驗中，我們得到了95條克隆子序列，建立了較大的沉積物古菌克隆文庫，能夠在很大程度上反應(yīng)總體的水平。</p><p>　　為了更準確地得到沉積物中微生物群體的多樣性，我們曾嘗試過溫度梯度凝膠電泳（TGGE）方法和對PCR產(chǎn)物進行限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析。</p><p>　　溫度梯度凝膠電泳作為環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析研究的主要手段之一，分析分子大小相同但序列不同的16S rDNA

101、片段，根據(jù)不同細菌其核糖體小亞基基因可變區(qū)堿基序列的不同，對PCR擴增的DNA片段進行有效分離,對其種群多樣性、數(shù)量比例和系統(tǒng)進化等進行更為詳盡的描述[10]。DNA限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析廣泛應(yīng)用于環(huán)境中微生物多樣性的研究，通過用限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物特定序列酶切，電泳分離得到不同長度的DNA片段，從而實現(xiàn)物種的多樣性分析，同時亦可免去對不必要的克隆子測序，降低實驗成本[11]。</p><p>

102、　　可能是由于當初實驗操作的生疏及理論知識的缺乏，實驗屢次失敗，最終放棄了這兩種方法。希望在后續(xù)的實驗中，能夠繼續(xù)嘗試使用這些方法，得到更為令人信服的結(jié)果。</p><p>　　3.2 古菌群落特征分析</p><p>　　在本研究中，我們構(gòu)建了東海13號位點沉積物古菌克隆文庫，通過對其多樣性分析建立古菌群落的系統(tǒng)進化關(guān)系?，F(xiàn)就古菌群落特征進行分析。</p><p>

103、;　　3.2.1 古菌群落垂直分布特征分析</p><p>　　我們在實驗準備階段曾假設(shè)古菌的分布會隨著沉積物層次變化而在垂直分布有所改變，但從古菌類群分布柱狀圖（圖2.5）可以看出，MGI和MCG是各層的優(yōu)勢類群，在各層中的比例差異并不明顯。隨著沉積物深度的增加，只有MBGC類群的同源序列在克隆文庫中所占比例有增加的趨勢，而其他類群并沒有表現(xiàn)出來。這可能是由于13號站點每層沉積物的厚度有限，微環(huán)境中各種物理化學

104、因子（溫度、鹽度、氧化還原電位等）的梯度變化不明顯，因此不足以影響古菌群落的分布。李友訓博士在研究東太平洋海隆北緯13°熱液噴口邊緣區(qū)的柱狀沉積物的微生物時發(fā)現(xiàn)，MGI隨深度的增加而減少，MBGA、MBGC隨深度增加而增加[9,19]，但并不表示微環(huán)境中古菌的分布隨著沉積物層次變化而有所改變。</p><p>　　3.2.2古菌多樣性分析</p><p>　　MG I是13號站點

105、沉積物古菌的優(yōu)勢物種，廣泛存在于四層沉積物中。MGⅠ最先發(fā)現(xiàn)于海水，是海水中古菌的主要類群，也廣泛分布于表層沉積物中，是海洋環(huán)境中最豐富的類群[8,15]。這一類具有硝化作用的古菌, 廣泛分布于海水和沉積物上表面低氧和低氨的環(huán)境中，在全球氮循環(huán)過程中具有關(guān)鍵的作用[9,18]。在MG I的參考序列中，我們同樣發(fā)現(xiàn)了與氨的氧化有關(guān)的序列，因此我們可以證實實驗結(jié)果的準確性。</p><p>　　MCG最初發(fā)現(xiàn)于陸地，

106、后來在海洋中得到大量發(fā)現(xiàn)，在海洋各種環(huán)境中都有大量分布，它是秘魯邊緣海1227和1229位點、地中海腐殖質(zhì)、鄂霍茨克海火山灰沉積物以及南開海槽沉積物的優(yōu)勢類群，其中大部分克隆與生活在含有甲烷水合物環(huán)境中[9,11,15]，因此我們推測MCG與全球碳的循環(huán)有關(guān)，參與地球物理化學循環(huán)。</p><p>　　MBGA是海洋古菌類群重要的組成部分之一。MBGA最先在大西洋深海沉積物分離得到[19]。在黃石國家公園溫泉中曾

107、分離的MBGA的同源序列，為厭氧嗜熱菌[12]。因此，我們猜測，MBGA類群中有不少種類可以適應(yīng)高溫、高滲透壓等極端的生存環(huán)境，為新型生物活性物質(zhì)的篩選提供更廣闊的空間，具有很大的經(jīng)濟和社會價值。</p><p>　　MBGC也是海洋古菌類群重要的組成部分之一，廣泛分布于海洋環(huán)境中。在13號位點四個斷層沉積物樣品中，均分離到MBGC類群的同源序列。我們在鄂霍次克海深海甲烷水流沉積物（99%）、黃河三角洲沉積物（9

108、9%）以及南極深海沉積物中均檢索到期同源序列，但并不是其所在區(qū)域的優(yōu)勢物種。</p><p>　　ANME在廣古生菌中為一個獨立的進化分支，并不能歸類到其他類群中ANME作為近年來新發(fā)現(xiàn)的古菌類群之一，為硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria, SRB)的共生菌[9]，參與甲烷的厭氧氧化（AOM），與地球碳循環(huán)有密切聯(lián)系。ANME在沉積物中的含量受甲烷濃度、溫度、鹽度等環(huán)境因子的影響[4

109、,13,16,17]。由于ANME能夠在厭氧環(huán)境中氧化甲烷，為甲烷的氧化提供一種全新的模式，對進一步認識中元古代古海洋與古氣候條件具有重要意義[20]。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] T. Li, P. Wang, P. Wang. Microbial diversity in surface sediments of th

110、e Xisha Trough, the South China Sea [J]. Acta Ecologica Sinica, 2008, 28(3): 1166?1173.</p><p>　　[2] 劉璞,王紅梅.海洋沉積物微生物多樣性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學, 2009, 37(10): 4569–4571.</p><p>　　[3] 李秋芬. 分子世界里的海洋微生物生態(tài)學——未來

111、的發(fā)展趨勢[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2007, 6(28): 83–96.</p><p>　　[4] 張林寶. 鄂霍次克海天然氣水合物區(qū)與東海內(nèi)陸架泥質(zhì)區(qū)沉積物古菌多樣性研究[D]. 中國科學院研究生院, 2009, 45–60.</p><p>　　[5] 李曙光, 皮昀丹, Zhang Chuan-lun. 古菌研究及其展望[J]. 中國科學技術(shù)大學學, 2007, 37(8): 8