牛骨膠原蛋白提取條件的優(yōu)化【開(kāi)題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開(kāi)題報(bào)告</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　牛骨膠原蛋白提取工藝研究</p><p><b>　　選題的背景與意義</b>&l

2、t;/p><p>　　我國(guó)每年在畜禽屠宰中產(chǎn)生大量骨骼，尤其以牛骨骼為多，但開(kāi)發(fā)利用率較低，主要制成骨粉，用作飼料添加劑，成年牛骨的含量比較恒定，占總體重的15 %—20%。牛骨骼主要是由蛋白質(zhì)和鈣質(zhì)組成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成管狀，管內(nèi)充滿骨髓，富含人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，新鮮骨骼中含蛋白質(zhì)含量11%—15%，水份含量占50%—56%，同時(shí)含含有粘多糖，鈣，磷，維生素等多種營(yíng)養(yǎng)，蛋白質(zhì)中以膠原蛋白為主，約占總蛋白質(zhì)量的70%—8

3、0%。含有人體所需的多種氨基酸，因此用高新技術(shù)開(kāi)發(fā)和利用骨骼中的蛋白質(zhì)，提取水解動(dòng)物蛋白質(zhì)是目前國(guó)內(nèi)外十分關(guān)注的項(xiàng)目，然而其中的膠原蛋白是尤為重要的一種蛋白質(zhì)。</p><p>　　膠原蛋白是一大類生物物質(zhì)，其生物合成過(guò)程已經(jīng)基本清楚，膠原蛋白是很多脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占體內(nèi)蛋白質(zhì)重量的25%—30%。相當(dāng)于體重的6%。自然界從低等無(wú)脊椎動(dòng)物到高等的哺乳動(dòng)物，總共大約有500億t以上的膠

4、原蛋白。目前研究表明，利用畜骨蛋白質(zhì)酶水解誒得到的水解產(chǎn)物膠原多肽具有很多活性功能，例如抗高血壓，預(yù)防與治療骨關(guān)節(jié)炎和骨骼疏松，治療胃潰瘍等疾病，抗衰老和抗氧化等。</p><p>　　所以膠原蛋白的提取的條件的優(yōu)化有利于提高其生產(chǎn)效率，可以更多的用到臨床，治療疾病等等情況。對(duì)我國(guó)的生物，醫(yī)學(xué)，制藥等多方面具有非常大的作用。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問(wèn)題：<

5、;/p><p><b>　　(一)．主要內(nèi)容：</b></p><p>　　1. 比較不同酶對(duì)牛骨膠原蛋白提取率的影響，選擇提取率較好的酶作為酶解用酶。</p><p>　　2. 通過(guò)單因素試驗(yàn)，選擇酶解條件：溫度，底物，PH值，酶解時(shí)間。</p><p>　　3. 通過(guò)正交試驗(yàn)，選出酶的最適水解膠原蛋白的最適條件。<

6、/p><p>　　4. 提取膠原蛋白。</p><p>　　(二)．?dāng)M要解決的問(wèn)題：</p><p>　　1.提高膠原蛋白的提取率。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p>　　1.酶的活力測(cè)定（福林-酚法）</p><p>　　2.酶的優(yōu)選（單因素實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)）：<

7、/p><p>　　酶的水解溫度，時(shí)間，底物比，ph值的測(cè)定</p><p>　　3. 對(duì)牛骨進(jìn)行前處理（高壓蒸煮法）</p><p>　　4. 選出最適合的酶水解牛骨，分別進(jìn)行溫度，酶底比，PH值，溫度優(yōu)化試驗(yàn)。</p><p>　　5. 提取膠原蛋白 </p><p><b>　　6.具體步驟：</b&

8、gt;</p><p><b>　　酶的活力測(cè)定</b></p><p><b>　　↓加酶</b></p><p>　　牛骨→預(yù)處理→酶解→膠原蛋白提取率測(cè)定</p><p><b>　　↑</b></p><p>　　對(duì)水解溫度，時(shí)間，底物比，PH值

9、的測(cè)定做單因素實(shí)驗(yàn)</p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010.10.1—2011.12.31：</p><p>　　論文資料的查閱，開(kāi)題報(bào)告的撰寫。</p><p>　　2011.01.2—2011.02.1：</p><p>　　開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行酶的優(yōu)選</p><

10、;p>　　2011.02.2—2011.03.1：</p><p>　　1.對(duì)酶的PH，溫度，時(shí)間，酶底比進(jìn)行單因素和正交實(shí)驗(yàn)</p><p>　　2.提取牛骨膠原蛋白。</p><p>　　2011.03. 2—2011.05.15</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)題，撰寫畢業(yè)論文。</p><p><b>

11、;　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 蔣挺大,張春萍.膠原蛋白[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2001.1—19</p><p>　　[2] 關(guān)云山,酶法水解明膠的試劑[J].青海大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2001,19(1)：32-34 [3] </p><p>　　[3] 張義軍，康白，任維棟等．膠原蛋白酶解物的降壓作用及生物學(xué)特征[

12、J]．2001，23(4)：275～276</p><p>　　[4] 戴紅,張新昆,李珍義,膠原水解產(chǎn)物的分離研究[J],皮革科學(xué)與工程,2002,12(2)：46—50</p><p>　　[5] Mskowitz R W.Seminars in Arthritis and Rheumatism，Seminr A trhitis Rheum，2000，30(2)：87—99</p

13、><p>　　[6] 王信蘇,汪之和草魚(yú)鱗膠原帶白的提取[J]現(xiàn)代食品科技,2006,22(4)：148-149</p><p>　　[7] 唐傳核,彭志英,膠原的開(kāi)發(fā)及利用[M],南京:南京出版社，2000(3):41—43</p><p>　　[8] Adier-Nissen.Limited enzymatic degradation of proteins:a n

14、ew approach in the industrial</p><p>　　Application of hydrolases[J].chem.Tech.Biotechnol,1982,32:138-156</p><p>　　[9] 班玉鳳,朱海峰,Alicalse,水解豬皮膠原蛋白的研究[J],現(xiàn)代食品科技,2004,21(2)：59—61</p><p>

15、　　[10] 張義軍,康白,任維棟等,膠原蛋白酶的降壓作用及生物學(xué)特征[J],2001,23(4)：275—277</p><p>　　[11] 李志強(qiáng),生皮蛋白質(zhì)化學(xué)基礎(chǔ)[M].成都;成都科技大學(xué)出版社,1988，74-81</p><p>　　[12] 趙蒼碧,黃玉東,李艷輝,從牛骨中提取膠原蛋白的研究[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)報(bào),2004,36(4)：</p><p&

16、gt;<b>　　515-519</b></p><p>　　[13] 安廣杰,王璋,許時(shí)嬰,利用Alcalase蛋白酶生產(chǎn)牛骨水解明膠[J],食品發(fā)酵工業(yè),2004.3：52-55</p><p>　　[14]趙勝年,酶解鮮豬皮提取水解膠原蛋白的研究[J],食品工業(yè)科技,2007,36(7):43-49</p><p>　　[15]李巖，朱海

17、峰,PH值漸變條件下雙酶協(xié)同水解豬皮制備膠原蛋白寡肽的研究[J],食品科學(xué),2003,32(5):6-8</p><p>　　[16]胡勝,李志強(qiáng).豬皮膠原蛋白的研究[J],現(xiàn)代食品科技，2004,21(2):59-61</p><p>　　[17]班玉鳳，朱海峰，水解豬皮膠原蛋白的研究[J],中國(guó)皮革，2003，24(8):563-565</p><p>　　[1

18、8]張根生，岳曉霞，火雞骨骼膠原多肽口服液的研究[J]，食品科學(xué)，2005，26(8):32-33</p><p>　　[19]曾名勇，李八方，紅非鯽魚(yú)皮膠原蛋白酶解條件的研究[J]中國(guó)海洋藥物雜志，2005，24(5)：24-29</p><p>　　[20]王碧,王坤余等,水解膠原蛋白的溶解性和乳化性研究[J],皮革化工,2003,20(1)：5-6</p><p&

19、gt;　　[21]趙勝年,酶解鮮豬肉皮提取水解膠原蛋白的研究[J],食品工業(yè)科技,1998,(5)：16-17</p><p>　　[22]馬福廣,李芳,彭燕豪,醫(yī)用膠原和膠原膜研制及臨床應(yīng)用[J].中華創(chuàng)傷雜志,1995，11(3)：149-150</p><p>　　[23]楊玉,牛骨膠原蛋白的的應(yīng)用前景[M],寧夏:生物科技出版社,2002,50-52</p><

20、p>　　[24]黃左余,李曉光,張建峰等,膠原蛋白食品代替魚(yú)飼料研究[J],中原工學(xué)院報(bào)，2007，18(2):9</p><p>　　[25]劉言寧,朱紫,膠原蛋白的研究前景[M],湖南,教育科技出版社,2003,18-19</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　食品加工</b

21、></p><p>　　酶解法提取膠原蛋白的研究現(xiàn)狀</p><p>　　摘要:膠原蛋白是一類有前途的生物物質(zhì)，分析了酶解法提取膠原蛋白的優(yōu)點(diǎn)，描述了國(guó)內(nèi)外許多相關(guān)的酶解工藝的研究來(lái)促進(jìn)膠原蛋白的提取的進(jìn)展，膠原產(chǎn)品也有很大的應(yīng)用前景。</p><p>　　關(guān)鍵詞:膠原蛋白；酶水解法；酶解蛋白</p><p>　　Enzymatic i

22、solation method to extract collagen research status </p><p>　　Abstract: Collagen is a promising biological materials, analyzes the enzymatic isolation method to extract collagen advantages of both at home an

23、d abroad, and there are many related enzymatic hydrolysis research to promote collagen extraction, collagen products also have very big application prospect.</p><p>　　Keywords:collagen; Enzyme hydrolysis met

24、hod; Zymolysing protein </p><p><b>　　0前言 </b></p><p>　　膠原蛋白是一大類生物物質(zhì)，其生物合成過(guò)程已經(jīng)基本清楚，膠原蛋白是很多脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占體內(nèi)蛋白質(zhì)重量的25%—30%。相當(dāng)于體重的6%。自然界從低等無(wú)脊椎動(dòng)物到高等的哺乳動(dòng)物，總共大約有500億t以上的膠原蛋白[1]。目前

25、研究表明，利用畜骨蛋白質(zhì)酶水解得到的水解產(chǎn)物膠原多肽具有很多活性功能，例如抗高血壓，預(yù)防與治療骨關(guān)節(jié)炎和骨骼疏松，治療胃潰瘍等疾病，抗衰老和抗氧化等[2]。</p><p>　　所以膠原蛋白的提取的條件的優(yōu)化有利于提高其生產(chǎn)效率，可以更多的用到臨床，治療疾病等等情況。對(duì)我國(guó)的生物，醫(yī)學(xué)，制藥等多方面具有非常大的作用。</p><p>　　因此膠原蛋白的提取這一課題已經(jīng)被擺上臺(tái)面，提取膠原蛋

26、白的方法有很多，比如中性鹽水解，堿提取法，酸提取法，酶提取法等等。為了更好的保證其提取物的生物特性，現(xiàn)在一般都采用酶解提取法。</p><p><b>　　1 酶解的優(yōu)點(diǎn)</b></p><p>　　蛋白質(zhì)水解的方式分為化學(xué)降解法和酶降解法[3]?；瘜W(xué)法如上文提到的是使用酸和堿等化學(xué)試劑在一定溫度下促使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂形成小分子物質(zhì)。酸法多采用鹽酸，硫酸等強(qiáng)酸

27、在高溫下反應(yīng)，反應(yīng)強(qiáng)烈，設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，水解徹底，多生成氨基酸混合物，同時(shí)在高溫下完全被破壞，目前已經(jīng)被淘汰。堿法水解氨基酸大多消旋[4]，如使L—氨基酸形成D—氨基酸，還能形成有毒物質(zhì)，無(wú)生物利用價(jià)值，因此不宜采用。到了80年代，隨著酶制劑工業(yè)和食品工業(yè)的迅猛發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)酶法水解反應(yīng)溫度低，反應(yīng)時(shí)間短，無(wú)環(huán)境污染。產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，以多肽和L型游離氨基酸為主，速溶性好，易于人體消化吸收，因而人們的注意力集中在利用酶水解產(chǎn)物蛋白上[5-6

28、]。</p><p><b>　　酶解工藝的研究</b></p><p>　　二十世紀(jì)七十年代標(biāo)志著食用蛋白質(zhì)的酶解研究作為一門相對(duì)獨(dú)立的研究領(lǐng)域的建立，酶法水解膠原蛋白已經(jīng)成為其中研究的一個(gè)分支[7]。國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的研究者對(duì)此方面進(jìn)行了逐步深入研究和探索。</p><p>　　國(guó)外酶解蛋白的報(bào)道很多，例如，AdlerNissen (1982

29、) [8]對(duì)蛋白質(zhì)酶解工藝和水解物的應(yīng)用進(jìn)行了研究。還有人做了酶解魚(yú)蛋白等方面的研究，它們都可以為酶解膠原蛋白提供方法和參考。具體到酶解膠原蛋白方面的研究也有很多：如Chambers和Rasmussen(1988)[9]對(duì)骨骼中提取的的膠原蛋白進(jìn)行了酶解研究；Surowka和Fic(1992)[10]采用中性蛋白酶進(jìn)行了酶解雞頭骨膠原蛋白的研究，確定了最佳酶解條件，并測(cè)定了酶解物氨基酸成分含量；Benjakul(1997)[11]研究了

30、牙鱈皮膠原的酶解利用，分別用中性和堿性蛋白酶水解，選擇了最優(yōu)酶和最佳水解條件； 日本協(xié)和發(fā)酵公司利用含有菠蘿蛋白酶的菠蘿汁經(jīng)過(guò)發(fā)酵得到的膠原多肽不僅風(fēng)味得到提高，而且其生理功能也增強(qiáng)了，得到的多肽分子量主要集中于4000～5 000左右[12]；M．M．Taylar (2005)[13]等對(duì)制革過(guò)程中產(chǎn)生的含鉻的膠原蛋白廢棄物經(jīng)過(guò)除鉻后用多種酶處理水解得到膠原多肽，大大提高了制革廠的利潤(rùn)。</p><p>　　近

31、幾年國(guó)內(nèi)也開(kāi)始了關(guān)于酶解膠原工藝的研究。例如，趙勝年(1998)[14]研究了以新鮮豬皮為原料，用國(guó)產(chǎn)胰酶進(jìn)行酶水解反應(yīng)，提取水解膠原蛋白的工藝技術(shù)。李巖等(2003)[15]研究了在沒(méi)有外加堿的PH漸變條件下，用枯草桿菌堿性蛋白酶和黑曲霉酸性蛋白酶雙酶協(xié)同水解從豬皮膠原蛋白制備寡肽水解物的可行性?？疾炝藛蚊竼我蛩厮鈼l件、雙酶加入方式對(duì)豬皮降解率和蛋白質(zhì)水解度的影響，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化出雙酶一次性投料方案F水解豬皮的最

32、佳條件。胡勝等(2003)[16]以工業(yè)化的蛋白酶為原料，采用一步酶解法、不抑活兩步法酶解、抑活兩步法酶解3種不同的工藝，對(duì)生物酶提取豬皮膠原進(jìn)行了研究。班玉鳳等(2004)[17]研究了Alcalase酶水解豬皮制備膠原蛋白寡肽時(shí)影響水解效果的各種因素。確定了Alcalase水解豬皮的最佳水解條件，并在最佳水解條件下，豬皮的降解率可達(dá)到9 7.3％,水解度可達(dá)到13.1％。張根牛等(2005)[18]以提取的火雞骨膠原蛋白液為原料，探

33、討了影響火雞骨膠原蛋白水解度的主要影響因素，優(yōu)化了酶解工藝條件。曾名勇等(2005)[19]研究草酶和復(fù)合酶水解紅非鯽</p><p><b>　　3 其他</b></p><p>　　影響酶解的效果的因素主要有：酶的種類，加酶量，酶解時(shí)間，PH值及料水比。研究者大多都從這幾個(gè)方面來(lái)研究膠原的酶解工藝。前文已經(jīng)提到了最重要一步了，即酶的種類的選取，自然在酶已經(jīng)確定

34、的情況下選取合適的加酶量，酶底物比，控制好時(shí)間是對(duì)原蛋白提取條件的優(yōu)化起到了十分重要作用。</p><p>　　選出了酶后自然是對(duì)比做各種對(duì)照試驗(yàn)來(lái)確定合適的時(shí)間，PH和溫度等等問(wèn)題。根據(jù)單酶作用的特點(diǎn)選用兩種酶組合作用，能在一定程度上提高酶解液的風(fēng)味和水解度，通過(guò)酶的優(yōu)化，取得較高的酶水解度[20]。</p><p>　　4 膠原分解產(chǎn)物的應(yīng)用前景</p><p&

35、gt;　　由于膠原蛋白具有保護(hù)，支持人體組織及骨骼張力強(qiáng)度及粘稠性等特征，所以作為醫(yī)療材料的用途極為廣泛[21]。目前，國(guó)內(nèi)正嘗試將原膠蛋白覆蓋在燒，燙傷病患者的傷口上，促進(jìn)其表皮細(xì)胞的移入與生長(zhǎng)能力，由此可大大縮短傷者傷口的愈合的時(shí)間，除此之外膠原蛋白還能有效改善關(guān)節(jié)病及骨質(zhì)酥松癥，具有抑制血壓上升，通過(guò)胃粘膜抗?jié)冏饔茫鹈庖吖δ苷{(diào)節(jié)等作用[22]。</p><p>　　在另一方面有由于膠原蛋白又具有親和性，

36、營(yíng)養(yǎng)性和保濕性，所以在化妝品方面又可以有大的應(yīng)用[23]。</p><p>　　膠原蛋白還可以用作高效的動(dòng)物性蛋白營(yíng)養(yǎng)添加劑。研究也表明，用其替代或部分替代進(jìn)口魚(yú)粉用于混，配合飼料生產(chǎn)，其飼料效果和經(jīng)濟(jì)效益均超過(guò)進(jìn)口魚(yú)粉[24]。</p><p>　　膠原蛋白產(chǎn)品在其他諸如食材，黏結(jié)劑，食品包裝等等方面也有大的應(yīng)用，應(yīng)用前途十分廣泛[25]。</p><p>　　膠

37、原產(chǎn)品的前景十分廣闊，應(yīng)用合理的新技術(shù)就能達(dá)到最大的提取成果，將使膠原蛋白的產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)量大大提高。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 蔣挺大,張春萍.膠原蛋白[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2001.1—19</p><p>　　[2] 關(guān)云山,酶法水解明膠的試劑[J].青海大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2001

38、,19(1)：32-34 [3] </p><p>　　[3] 張義軍，康白，任維棟等．膠原蛋白酶解物的降壓作用及生物學(xué)特征[J]．2001，23(4)：275～276</p><p>　　[4] 戴紅,張新昆,李珍義,膠原水解產(chǎn)物的分離研究[J],皮革科學(xué)與工程,2002,12(2)：46—50</p><p>　　[5] Mskowitz R W.Seminar

39、s in Arthritis and Rheumatism，Seminr A trhitis Rheum，2000，30(2)：87—99</p><p>　　[6] 王信蘇,汪之和草魚(yú)鱗膠原帶白的提取[J]現(xiàn)代食品科技,2006,22(4)：148-149</p><p>　　[7] 唐傳核,彭志英,膠原的開(kāi)發(fā)及利用[M],南京:南京出版社，2000(3):41—43</p>

40、<p>　　[8] Adier-Nissen.Limited enzymatic degradation of proteins:a new approach in the industrial</p><p>　　Application of hydrolases[J].chem.Tech.Biotechnol,1982,32:138-156</p><p>　　[9] 班

41、玉鳳,朱海峰,Alicalse,水解豬皮膠原蛋白的研究[J],現(xiàn)代食品科技,2004,21(2)：59—61</p><p>　　[10] 張義軍,康白,任維棟等,膠原蛋白酶的降壓作用及生物學(xué)特征[J],2001,23(4)：275—277</p><p>　　[11] 李志強(qiáng),生皮蛋白質(zhì)化學(xué)基礎(chǔ)[M].成都;成都科技大學(xué)出版社,1988，74-81</p><p>

42、;　　[12] 趙蒼碧,黃玉東,李艷輝,從牛骨中提取膠原蛋白的研究[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)報(bào),2004,36(4)：</p><p><b>　　515-519</b></p><p>　　[13] 安廣杰,王璋,許時(shí)嬰,利用Alcalase蛋白酶生產(chǎn)牛骨水解明膠[J],食品發(fā)酵工業(yè),2004.3：52-55</p><p>　　[14]趙勝年,

43、酶解鮮豬皮提取水解膠原蛋白的研究[J],食品工業(yè)科技,2007,36(7):43-49</p><p>　　[15]李巖，朱海峰,PH值漸變條件下雙酶協(xié)同水解豬皮制備膠原蛋白寡肽的研究[J],食品科學(xué),2003,32(5):6-8</p><p>　　[16]胡勝,李志強(qiáng).豬皮膠原蛋白的研究[J],現(xiàn)代食品科技，2004,21(2):59-61</p><p>　　

44、[17]班玉鳳，朱海峰，水解豬皮膠原蛋白的研究[J],中國(guó)皮革，2003，24(8):563-565</p><p>　　[18]張根生，岳曉霞，火雞骨骼膠原多肽口服液的研究[J]，食品科學(xué)，2005，26(8):32-33</p><p>　　[19]曾名勇，李八方，紅非鯽魚(yú)皮膠原蛋白酶解條件的研究[J]中國(guó)海洋藥物雜志，2005，24(5)：24-29</p><p

45、>　　[20]王碧,王坤余等,水解膠原蛋白的溶解性和乳化性研究[J],皮革化工,2003,20(1)：5-6</p><p>　　[21]趙勝年,酶解鮮豬肉皮提取水解膠原蛋白的研究[J],食品工業(yè)科技,1998,(5)：16-17</p><p>　　[22]馬福廣,李芳,彭燕豪,醫(yī)用膠原和膠原膜研制及臨床應(yīng)用[J].中華創(chuàng)傷雜志,1995，11(3)：149-150</p&g

46、t;<p>　　[23]楊玉,牛骨膠原蛋白的的應(yīng)用前景[M],寧夏:生物科技出版社,2002,50-52</p><p>　　[24]黃左余,李曉光,張建峰等,膠原蛋白食品代替魚(yú)飼料研究[J],中原工學(xué)院報(bào)，2007，18(2):9</p><p>　　[25]劉言寧,朱紫,膠原蛋白的研究前景[M],湖南,教育科技出版社,2003,18-19</p><p

47、><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　牛骨膠原蛋白提取條件的優(yōu)化</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　1引言2</b></p>

48、<p><b>　　2材料與方法3</b></p><p>　　2.1 材料與試劑3</p><p>　　2.2 儀器及設(shè)備4</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)方法4</p><p>　　2.3.1 測(cè)定方法4</p><p>　　2.3.2 實(shí)驗(yàn)流程6</p>

49、<p>　　2.3.3 牛骨液酶法提取膠原蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)6</p><p>　　2.3.4 酶提取的最佳工藝條件正交實(shí)驗(yàn)7</p><p><b>　　3結(jié)果與分析7</b></p><p>　　3.1 牛骨中膠原蛋白含量7</p><p>　　3.2 酶的活力8</p><p

50、>　　3.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果8</p><p>　　3.3.1 加酶量對(duì)水解度的影響8</p><p>　　3.3.2 pH值對(duì)提取率的影響9</p><p>　　3.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)提取率的影響9</p><p>　　3.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)提取率的影響10</p><p>　　3.3.5 胃蛋白酶酶

51、解工藝條件的優(yōu)化11</p><p><b>　　4 結(jié)論11</b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)12</b></p><p>　　附錄錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要：牛骨是肉牛加工的副產(chǎn)品，近年來(lái)

52、隨著肉牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，相關(guān)企業(yè)迫切需要解決牛骨的開(kāi)發(fā)利用問(wèn)題。本文采用酶解法提取牛骨中的膠原蛋白。首先測(cè)得了牛骨中的羥脯氨酸和膠原蛋白的含量分別為0.75％和7.5％。同時(shí)采用胃蛋白酶對(duì)牛骨液進(jìn)行酶解。以膠原蛋白的提取率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了牛骨膠原蛋白提取的優(yōu)化條件。試驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)預(yù)處理后得到的牛骨液在溫度37℃，pH2.0，酶用量10860u/g的條件下酶解5h，其膠原蛋白的提取率達(dá)到64.10％。</p&g

53、t;<p>　　關(guān)鍵詞：牛骨；酶解；膠原蛋白 </p><p>　　Abstract :Bovine bone is a byproduct of beef processing, in recent years with the development of cattle breeding industry ,urgent need to address development and utili

54、zation of bone problems.In this paper, enzymatic extraction of collagen in bone. First of all, bone hydroxyproline and the collagen which had been tested were 0.75% and 7.5% .At the same time,we hydrolysis bovine liquid

55、by pepsin. In the standard of extraction rate of collagen, we can check out the best optimum conditions by single</p><p>　　Keywords: bovine bone; enzyme; collagen</p><p><b>　　1引言</b&g

56、t;</p><p>　　我國(guó)每年在畜禽屠宰中產(chǎn)生大量骨骼,如豬骨、牛骨。其中牛骨開(kāi)發(fā)利用率較低,主要制成骨粉,用做飼料添加劑。成年牛骨的含量比較恒定,按照不同的牛的種類一般占總體重的5％～20％不等。牛骨骼主要由蛋白質(zhì)和鈣質(zhì)組成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),形成管狀,管內(nèi)充滿骨髓,富含人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。新鮮骨骼中蛋白質(zhì)含量占11％～l5％,脂肪含量占10％～15％,水份含量占50％～56％,同時(shí)還含有粘多糖、鈣、磷、維生素等多種

57、營(yíng)養(yǎng)素。蛋白質(zhì)中以膠原蛋白為主,約占總蛋白質(zhì)量的70％～80％。膠原蛋白中含有人體所需的多種氨基酸,因此用高新技術(shù)開(kāi)發(fā)和利用骨骼中的蛋白質(zhì),提取水解動(dòng)物蛋白是目前國(guó)內(nèi)外十分關(guān)注的項(xiàng)目。</p><p>　　膠原蛋白是一大類生物物質(zhì),其生物合成過(guò)程已經(jīng)基本清楚。膠原蛋白是很多脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì),約占體內(nèi)蛋白質(zhì)重量的25％～30％,相當(dāng)于體重的6％。自然界從低等無(wú)脊椎動(dòng)物到高等的哺乳動(dòng)物,總共

58、大約有5OO億t以上的膠原蛋[1]。目前的研究表明：利用畜骨蛋白質(zhì)酶水解得到的水解產(chǎn)物膠原多肽具有很多活性功能,例如抗高血壓、預(yù)防與治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松、治療胃潰瘍等疾病、抗衰老和抗氧化等[2]。</p><p>　　二十世紀(jì)七十年代標(biāo)志著食用蛋白質(zhì)的酶解研究作為一門相對(duì)獨(dú)立的研究領(lǐng)域的建立,酶法水解膠原蛋白已經(jīng)成為其中研究的一個(gè)分支[3]。國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的研究者對(duì)此方面進(jìn)行了逐步深入研究和探索。</p&

59、gt;<p>　　國(guó)外酶解蛋白的報(bào)道很多,例如,AdlerNissen (1982) [4]對(duì)蛋白質(zhì)酶解工藝和水解物的應(yīng)用進(jìn)行了研究。還有人做了酶解魚(yú)蛋白等方面的研究,它們都可以為酶解膠原蛋白提供方法和參考。具體到酶解膠原蛋白方面的研究也有很多：如Chambers和Rasmussen(1988)[5]對(duì)骨骼中提取的的膠原蛋白進(jìn)行了酶解研究；Surowka和Fic(1992)[6]采用中性蛋白酶進(jìn)行了酶解雞頭骨膠原蛋白的研究

60、,確定了最佳酶解條件,并測(cè)定了酶解物氨基酸成分含量；Benjakul(1997)[7]研究了牙鱈皮膠原的酶解利用,分別用中性和堿性蛋白酶水解,選擇了最優(yōu)酶和最佳水解條件； 日本協(xié)和發(fā)酵公司利用含有菠蘿蛋白酶的菠蘿汁經(jīng)過(guò)發(fā)酵得到的膠原多肽不僅風(fēng)味得到提高,而且其生理功能也增強(qiáng)了,得到的多肽分子量主要集中于4000～5000左右[8]；M．M．Taylar(2005)[9]等對(duì)制革過(guò)程中產(chǎn)生的含鉻的膠原蛋白廢棄物經(jīng)過(guò)除鉻后用多種酶處理水解得

61、到膠原多肽,大大提高了制革廠的利潤(rùn)。</p><p>　　近幾年國(guó)內(nèi)也開(kāi)始了關(guān)于酶解膠原工藝的研究。例如,趙勝年(1998)[10]研究了以新鮮豬皮為原料,用國(guó)產(chǎn)胰酶進(jìn)行酶水解反應(yīng),提取水解膠原蛋白的工藝技術(shù)。李巖等(2003)[11]研究了在沒(méi)有外加堿的PH漸變條件下,用枯草桿菌堿性蛋白酶和黑曲霉酸性蛋白酶雙酶協(xié)同水解從豬皮膠原蛋白制備寡肽水解物的可行性?？疾炝藛蚊竼我蛩厮鈼l件、雙酶加入方式對(duì)豬皮降解率和蛋白

62、質(zhì)水解度的影響,并在此基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化出雙酶一次性投料方案水解豬皮的最佳條件。胡勝等(2003)[12]以工業(yè)化的蛋白酶為原料,采用一步酶解法、不抑活兩步法酶解、抑活兩步法酶解3種不同的工藝,對(duì)生物酶提取豬皮膠原進(jìn)行了研究。班玉鳳等(2004)[13]研究了Alcalase酶水解豬皮制備膠原蛋白寡肽時(shí)影響水解效果的各種因素。確定了Alcalase水解豬皮的最佳水解條件,并在最佳水解條件下,豬皮的降解率可達(dá)到97.3％,水解度

63、可達(dá)到13.1％。張根牛等(2005)[14]以提取的火雞骨膠原蛋白液為原料,探討了影響火雞骨膠原蛋白水解度的主要影響因素,優(yōu)化了酶解工藝條件。曾名勇等(2005)[15]研究草酶和復(fù)合酶水解紅非鯽魚(yú)皮</p><p>　　由于膠原蛋白具有保護(hù),支持人體組織及骨骼張力強(qiáng)度及粘稠性等特征,所以作為醫(yī)療材料的用途極為廣泛。目前,國(guó)內(nèi)正嘗試將原膠蛋白覆蓋在燒,燙傷病患者的傷口上,促進(jìn)其表皮細(xì)胞的移入與生長(zhǎng)能力,由此可大

64、大縮短傷者傷口的愈合的時(shí)間。由于膠原蛋白的靜電紡納米纖維可以再現(xiàn)自然骨形態(tài),因此被認(rèn)為是很有發(fā)展前景的組織工程運(yùn)用的原料[16]。除此之外膠原蛋白還能有效改善關(guān)節(jié)病及骨質(zhì)酥松癥,具有抑制血壓上升,通過(guò)胃粘膜抗?jié)冏饔?起免疫功能調(diào)節(jié)等作用[17]。</p><p>　　在另一方面有由于膠原蛋白又具有親和性,營(yíng)養(yǎng)性和保濕性,所以在化妝品方面又可以有大的應(yīng)用[18]。</p><p>　　膠原

65、蛋白還可以用作高效的動(dòng)物性蛋白營(yíng)養(yǎng)添加劑。研究也表明,用其替代或部分替代進(jìn)口魚(yú)粉用于混,配合飼料生產(chǎn),其飼料效果和經(jīng)濟(jì)效益均超過(guò)進(jìn)口魚(yú)粉[19]。</p><p>　　膠原蛋白產(chǎn)品在其他諸如食材,黏結(jié)劑,食品包裝等等方面也有大的應(yīng)用,應(yīng)用前途十分廣泛[20]。</p><p>　　膠原蛋白產(chǎn)品的前景十分廣闊,應(yīng)用合理的新技術(shù)就能達(dá)到最大的提取成果,將使膠原蛋白的產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)量大大提高。&

66、lt;/p><p>　　從這些研究結(jié)果看出,酶解牛骨提取膠原蛋白的得率等相差較大,影響提取得率高低因素主要有原料種類、提取工藝技術(shù)(包括溫度、時(shí)間、酶及其用量、pH)等。研究者大多都從這幾個(gè)方面來(lái)研究蛋白的酶解工藝。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)以牛骨為原料,采用單因素法和正交試驗(yàn)法。以牛骨膠原蛋白提取率為指標(biāo)選擇胃蛋白酶,從加酶量、pH、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時(shí)間幾個(gè)因素上找到最佳組合,得到牛骨中蛋

67、白質(zhì)酶解最適條件,為提高牛骨的膠原蛋白的提取率提供相關(guān)的工藝數(shù)據(jù)。</p><p><b>　　2材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 材料與試劑</b></p><p>　　牛骨：寧波萊盛農(nóng)業(yè)科技實(shí)業(yè)有限公司提供</p><p>　　胃蛋白酶：上海源聚生物科技有限公司 生化試劑

68、1:3000</p><p>　　無(wú)水Na2CO3：浙江省蘭溪市凱旋路83號(hào) AR</p><p>　　氯胺—T：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 AR</p><p>　　NaOH：浙江中星化工試劑有限公司 AR</p><p>　　乙酸：國(guó)藥化學(xué)集團(tuán)試劑有限公司 AR</p>&l

69、t;p>　　L_酪氨酸：中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑有限公司 AR</p><p>　　前脯氨酸：Sigma公司 AR</p><p>　　4—（二甲氨基）苯甲醛：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 AR</p><p>　　異丙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 AR</p><p>　　正丙醇：國(guó)藥集

70、團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 AR</p><p>　　三氯乙酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 AR</p><p>　　濃硫酸：浙江省蘭溪六洞山化學(xué)試劑廠 AR</p><p>　　濃鹽酸：浙江省蘭溪六洞山化學(xué)試劑廠 AR</p><p>　　乳酸：宜州市化學(xué)試劑工廠 AR<

71、/p><p>　　乳酸鈉：中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司 AR </p><p><b>　　2.2 儀器及設(shè)備</b></p><p>　　可見(jiàn)分光光度計(jì)：T6-新悅型,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；</p><p>　　數(shù)顯PH計(jì)：PHS—25型,上海機(jī)密科學(xué)有限公司；</p><p>　

72、　TCE純水機(jī)：TCEP—O015型,杭州天創(chuàng)凈水設(shè)備有限公司；</p><p>　　電熱恒溫水浴鍋：DK—S22型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；</p><p>　　低速大容量離心機(jī)：TDL—5型,江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；</p><p>　　新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；DHG—914AD型,寧波市江南儀器廠；</p><p>　　自動(dòng)電熱壓力蒸汽

73、滅菌器：LDZX—40BI型,上海申安醫(yī)療器械廠；</p><p>　　電子天平：BP-211D型,德國(guó)sartorius公司；</p><p><b>　　2.3 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.3.1 測(cè)定方法</p><p>　　2.3.1.1 牛骨中羥脯氨酸含量的測(cè)定

74、 </p><p>　　A. 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[21]：按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量的測(cè)</p><p><b>　　定》</b></p><p><b>　　a. 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液</b></p><p>　　稱取50mg 羥脯氨酸于100ml容量瓶中,用

75、水溶解,加一滴3mol/L的硫酸,用水定容。保存該</p><p>　　溶液與4℃的冰箱里。</p><p><b>　　b. 標(biāo)準(zhǔn)工作液</b></p><p>　　移取5.00mL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至500mL容量瓶中,用水定容。分別吸取該溶液10.00mL,</p><p>　　20.00mL,30.00mL,40.0

76、0mL于100mL容量瓶中,用水定容,所得標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為0.5μg／ｍ</p><p>　?。?1.0μg／ｍＬ,1.5μg／ｍＬ,2.0μg／ｍＬ。</p><p>　　c. 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：</p><p>　　取上述標(biāo)準(zhǔn)工作液各1mL,各加入0.4mol/L的碳酸鈉5mL,再加入已稀釋的福林試劑1mL。</p><p>　　搖

77、勻至于水浴鍋中,外加一組空白組加蒸餾水實(shí)驗(yàn)。40℃保溫發(fā)色20min后在分光光度計(jì)下測(cè)定</p><p>　　OD,平行測(cè)定三次,取平均值。將實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)減去空白對(duì)照組的數(shù)據(jù),即為凈OD數(shù)。</p><p>　　B. 牛骨中羥脯氨酸含量的測(cè)定[21]：按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測(cè)</p><p><b>　　定》

78、</b></p><p>　　a. 進(jìn)行三組平行試驗(yàn),分別取４g牛骨,加入9％的碳酸鈉溶液100ml,進(jìn)行5小時(shí)的脫脂,脫脂</p><p>　　后然后每組分別加入30ml的硫酸溶液（3mol/L),然后放置于105℃的烘箱內(nèi)進(jìn)行強(qiáng)酸水解16h。</p><p>　　b. 水解完畢后,趁熱過(guò)濾,用10ml硫酸（3mol/L)進(jìn)行潤(rùn)洗三次,過(guò)濾至250ml

79、容量瓶里純水定容, </p><p>　　然后用移液管在每組中的容量瓶中提取8ml于另外空置的250ml容量瓶中用純水定容。靜置 </p><p><b>　　20min。</b></p><p>　　c. 每組中提取出4ml溶液與顯色管中,加入事先配置好的氯胺—T溶液2ml,靜置20min,然后加&

80、lt;/p><p>　　入顯色劑2ml,置于60℃水溫中進(jìn)行水浴發(fā)色20min,時(shí)間到后在流動(dòng)的水中冷卻3min后,然</p><p>　　后在水中冷卻30min。</p><p>　　d. 進(jìn)行一組空白實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn),溶液用純水代替。</p><p>　　e. 測(cè)定三組實(shí)驗(yàn)組的凈OD值,然后代入公式：</p><p>　?。?

81、6.25c/mV</p><p>　　式中：Ｘ—試樣中羥脯氨酸的含量,％</p><p>　?。恪蓸?biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中羥脯氨酸的濃度,單位為μg/ｍＬ</p><p>　?。怼獮樵嚇淤|(zhì)量,單位為ｇ</p><p>　?。帧谝淮螐?50ｍＬ容量瓶中移取的體積,單位為ｍＬ　　　 </p><p>　　2.3.1.

82、2 膠原蛋白提取率的計(jì)算</p><p>　　根據(jù)公式：提取率（％）＝溶液中羥脯氨酸的濃度×體積×稀釋倍數(shù)/牛骨中羥脯氨酸的含量×100％</p><p>　　2.3.1.3 酶活的測(cè)定</p><p>　　A. 酶活力的測(cè)定[22]：按行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》測(cè)定</p><p>

83、;　　B. 配置各種不同濃度的酪氨酸溶液分別：0μg／ｍＬ,20μg／ｍＬ,40μg／ｍＬ,60μg／ｍＬ, </p><p>　　80／ｍＬ,100μg／ｍＬ。</p><p>　　C. 取6支事先編號(hào),去1中不同濃度中的酪氨酸各1ml,加入0.4mol/L的碳酸鈉5ml,再各加入</p><p>　　已稀釋的福林試劑1ml。搖勻置于水浴鍋中。40℃保溫發(fā)色20m

84、in然后用分光光度計(jì)在660nm下</p><p>　　進(jìn)行測(cè)定三次,去平均值。將1-6號(hào)管所測(cè)得的光明密度減去1號(hào)管得出凈OD值。</p><p>　　D. 以凈OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　E. 制備5000倍的胃蛋白酶稀釋液。</p><p>　　F. 樣品測(cè)定：取試管三支,編號(hào)1,2,3,每管內(nèi)加入樣品稀釋液1ml,置于4

85、0℃水域中預(yù)熱2min,</p><p>　　再各加入同樣預(yù)熱的酪蛋白1ml,精確保溫10min,時(shí)間到后,立即加入0.4mol三氯乙酸2ml,</p><p>　　以終止反終止反應(yīng),繼續(xù)置于水浴中保溫20min,使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過(guò)濾,然后另取試</p><p>　　管三支,編號(hào)1.,2,3,每管內(nèi)加入濾液1ml,再加入0.4mol碳酸鈉5ml,已稀釋的福林

86、試劑1ml, </p><p>　　搖勻,40℃保溫發(fā)色20min后進(jìn)行光密度測(cè)定。</p><p>　　G. 空白試驗(yàn)也去試管3支,編號(hào)（1）,（2）,（3）,測(cè)定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol</p><p>　　三氯乙酸2ml,使酶失活,再加入酪蛋白。</p><p><b>　　H. 計(jì)算：</b>&

87、lt;/p><p>　　樣品平均光密度（OD）—空白的平均光密度（OD)=凈OD值根據(jù)公式：</p><p>　　蛋白酶活力單位：樣品蛋白酶活力單位=4×N×（A/10）×1/（1-w）</p><p>　　A----由樣品 測(cè)得的OD值,查標(biāo)準(zhǔn)曲線的相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)。</p><p>　　4-----4毫升反應(yīng)液

88、去除1ml,測(cè)定</p><p>　　N-----酶液稀釋的倍數(shù)</p><p>　　10-----反應(yīng)10min</p><p>　　W------樣品水分百分含量。 </p><p>　　2.3.2 實(shí)驗(yàn)流程</p><p>　　胃蛋白酶→酶活力的測(cè)定</p><p><b>

89、　　↓</b></p><p>　　牛骨→預(yù)處理→酶解→膠原蛋白提取率的測(cè)定</p><p><b>　　↑</b></p><p>　　對(duì)水解溫度,時(shí)間,酶底比,PH值的測(cè)定做單因素,正交實(shí)驗(yàn)</p><p>　　牛骨：寧波萊盛農(nóng)業(yè)科技實(shí)業(yè)有限公司提供的牛骨</p><p>　　預(yù)處

90、理：將新鮮牛骨打碎成3～5cm塊狀、去掉骨髓,清水沖洗干凈,冷凍用。取冷凍備用的骨１kg放入高壓鍋中,加水２kg,在1.5kg／cm2 壓力下蒸煮2h后,蒸煮液用雙層紗布過(guò)濾,濾出骨渣,濾液冷卻、除去脂肪,待用。</p><p>　　2.3.3 牛骨液酶法提取膠原蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)</p><p>　　2.3.3.1 加酶量的確定</p><p>　　在pH2.0、反

91、應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間5h,6.65g牛骨濾液（約為4g牛骨）的條件下,分別采用7600u/g,8444u/g,9500u/g,10860u/g,12667u/g的酶用量進(jìn)行單因素平行實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2.3.3.2 pH值的確定</p><p>　　在酶用量為9500u/g、反應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間5h,6.65g牛骨濾液（約為4g牛骨）的條件下,分別采用pH1.7、pH2.0

92、、pH2.3、pH2.6、pH2.9的條件進(jìn)行單因素平行實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2.3.3.3 反應(yīng)溫度的確定</p><p>　　在酶用量為9500u/g、pH2.0、反應(yīng)時(shí)間5h,6.65g牛骨濾液（約為4g牛骨）的條件下,分別采用pH1.7、pH2.0、pH2.3、pH2.6、pH2.9的條件進(jìn)行單因素平行實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2.3.3.4 反應(yīng)時(shí)

93、間的確定</p><p>　　在酶用量為9500u/g、pH2.0、pH2.0,6.65g牛骨濾液（約為4g牛骨）的條件下,分別采用2h,3h,</p><p>　　4h,5h,6h,7h的條件進(jìn)行單因素平行實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2.3.4 酶提取的最佳工藝條件正交實(shí)驗(yàn)</p><p>　　在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以膠原蛋白的提取率為指標(biāo)

94、采用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,其因素與水平見(jiàn)表1。</p><p>　　表1 正交試驗(yàn)因素水平表</p><p>　　Table 1 The factor and levels of orthogonal test</p><p><b>　　3結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 牛骨中膠原蛋白含量<

95、/p><p>　　羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 </p><p>　　圖1..羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Fig．1. Hydroxyproline standard curve</p><p>　　以羥脯氨酸濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)在波長(zhǎng)為550nm下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.2014x+0.001（R

96、2=0.9999）,由圖可知OD值和羥脯氨酸的的濃度相關(guān)性相當(dāng)好。</p><p>　　牛骨中羥脯氨酸含量：0.75％</p><p>　　牛骨膠原蛋白含量：本實(shí)驗(yàn)?zāi)z原蛋白和羥脯氨酸的比例系數(shù)為10,可得膠原蛋白含量為7.5％,符合正常的含量范圍?！　?lt;/p><p><b>　　3.2 酶的活力</b></p><p>

97、;　　酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2：</p><p>　　圖2.酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Fig．2.Tyrosine standard curve</p><p>　　酪氨酸濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)在波長(zhǎng)為660nm下繪制圖表,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：</p><p>　?。剑?0560x－0.036,R2=0.9983</p>

98、<p>　　根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定可以代入樣品測(cè)得的凈OD值可得到對(duì)應(yīng)的酪氨酸質(zhì)量；代入公式：</p><p>　　樣品蛋白酶活力單位=4×N×（A/10）×1/（1-w）,可測(cè)得胃蛋白酶的活力為3800u/mg。</p><p>　　3.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　3.3.1 加酶量對(duì)水解度的影響</

99、p><p>　　在pH2.0、反應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間5h,6.65g牛骨濾液（約為4g牛骨）的條件下,研究不同加酶量對(duì)牛骨膠原蛋白量提取率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。</p><p>　　圖3 加酶量對(duì)水解度的影響</p><p>　　Fig．3 The influence of enzyme amount on DH</p><p>　　由圖3可知

100、,在胃蛋白酶水解牛骨蛋白時(shí),酶的用量對(duì)其水解程度有顯著的影響。當(dāng)酶用量小于9500u/g時(shí),隨著酶量的增加,水解出來(lái)的膠原蛋白不斷升高。當(dāng)酶用量大于9500u/g后,膠原蛋白的水解出來(lái)的產(chǎn)量開(kāi)始減少。由圖可得出當(dāng)酶用量在9500u/g時(shí),就可達(dá)到較好的水解效果。</p><p>　　3.3.2 pH值對(duì)提取率的影響</p><p>　　在加酶量9500u/g、反應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間5h,

101、6.65g牛骨濾液（約為4g牛骨）的條件下,研究不同pH對(duì)牛骨膠原蛋白提取率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。</p><p>　　圖4 pH值對(duì)提取率的影響</p><p>　　Fig．4 The influence of pH value on DH</p><p>　　由圖4可見(jiàn),pH值對(duì)膠原蛋白的提取率有顯著的影響。當(dāng)pH從1.7上升到2.3時(shí),膠原蛋白提取率呈上升趨勢(shì)

102、,但隨pH在2.3到2.9范圍時(shí),膠原蛋白的產(chǎn)量又迅速下降。表明胃蛋白酶在pH2.3的酸性條件下對(duì)牛骨蛋白的水解達(dá)到了一個(gè)較好的效果,在中性或偏堿的環(huán)境下,胃蛋白酶的活性會(huì)受到不同程度的抑制,此外,不適宜的pH環(huán)境還會(huì)影響酶與其底物的結(jié)合,也會(huì)影響水解效果。</p><p>　　3.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)提取率的影響</p><p>　　在加酶量9500u/g、pH2.0、反應(yīng)時(shí)間5h,6.6

103、5g牛骨濾液（約為4g牛骨）的條件下,研究不同反應(yīng)溫度對(duì)牛骨膠原蛋白提取率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。</p><p>　　圖5 溫度對(duì)提取率的影響</p><p>　　Fig．5 The influence of temperature on DH</p><p>　　由圖5可見(jiàn),反應(yīng)溫度對(duì)牛骨蛋白水解度有重要影響。溫度會(huì)影響酶的活性、反應(yīng)速率,進(jìn)而影響水解度。當(dāng)反應(yīng)溫

104、度從31℃上升到3℃時(shí),水解度快速上升,但隨著溫度繼續(xù)升高,從37℃上升到43℃時(shí),水解度又迅速降低,因此,確定較適合的溫度37℃。</p><p>　　3.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)提取率的影響</p><p>　　在加酶量9500u/g、pH2.0、反應(yīng)溫度37℃,6.65g牛骨濾液（約為4g牛骨條件下）,研究不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)牛骨膠原蛋白提取率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。</p><

105、p>　　圖6 時(shí)間對(duì)提取率的影響</p><p>　　Fig．6 The influence of time on DH</p><p>　　一般地,隨著作用時(shí)間的增加,水解度不斷增加；但當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后,隨底物濃度的下降、水解產(chǎn)物的積累,水解度增加的程度會(huì)趨于平緩,竟而抑制酶的反應(yīng)或者反應(yīng)掉膠原蛋白。為提高經(jīng)濟(jì)效益,此時(shí)為酶解最少的作用時(shí)間。由圖6表明,當(dāng)酶作用時(shí)間在5h以下時(shí),

106、隨時(shí)間的延長(zhǎng),水解度增高；當(dāng)5h以后,水解度基本保持平緩趨勢(shì)直到不變?yōu)橹?。因?在用胃蛋白酶水解牛骨蛋白時(shí),可選用5h為酶解的作用時(shí)間。</p><p>　　3.3.5 胃蛋白酶酶解工藝條件的優(yōu)化</p><p>　　在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)對(duì)胃蛋白酶酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化,其因素與水平見(jiàn)表1,按L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。其正交試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2。</p><p&

107、gt;　　表2 酶水解正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　Table 2 The orthogonal test result of enzyme hydrolyzing </p><p>　　經(jīng)分析,牛骨蛋白的酶促水解影響因素中,溫度值的影響最大,其次為時(shí)間的影響,pH為第3位,而加酶量的影響最小。由此得出的最佳胃蛋白酶水解條件為：加酶量10860（u/g）,pH2.0,溫度37℃,時(shí)間

108、5h。</p><p>　　在此實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),最后得到牛骨膠原蛋白的提取率為64.10％。</p><p>　　同樣條件下,取100ml酶解液先在4000r/min的環(huán)境下離心20min,然后取上清液,再在其中加入足量的NaCl使溶液飽和,然后放入４℃條件下鹽析10h,鹽析完成后把溶液裝在透析袋中放入純水中進(jìn)行透析,透析過(guò)程中一直用AgNO3溶液滴定,并且不斷的更換純水,直到滴定

109、不再出現(xiàn)沉淀為止,取出透析液再經(jīng)冷凍干燥后實(shí)際測(cè)得膠原蛋白提取率為48.13％。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,牛骨中羥脯氨酸的含量為 0.75％,膠原蛋白的含量為 7.5 ％。</p><p>　　2.在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行正交試驗(yàn)得到牛骨膠原蛋白的最佳酶解工藝條件為：加酶量10860

110、u/g,</p><p>　　pH2.0,溫度37℃,時(shí)間5h。</p><p>　　3.對(duì)優(yōu)化的酶解條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),最后得到牛骨膠原蛋白的提取率為64.10％。</p><p>　　4.對(duì)牛骨酶解液進(jìn)行鹽析、透析,再經(jīng)冷凍干燥后實(shí)際測(cè)得膠原蛋白提取率為48.13％。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b><

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