香魚apo ai原核表達及鑒定【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　香魚Apo AI原核表達及鑒定</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><p&g

2、t;　　香魚屬胡瓜魚目香魚科。地方又名香油魚、瓜魚、細鱗魚、海胎魚、秋生子，日本人稱為鲇魚。是一種中小型名貴魚類，曾被列入“雁蕩五珍”，在亞洲被譽為“魚中珍品”。因其脊背上有一條滿是香脂的腔道能散發(fā)出濃郁的芳香味而得名。香魚肉質細嫩多脂，清香可口，無魚腥味，比一般魚類口感好，尤其是鳧溪香魚干，早在清代已遠近聞名。香魚營養(yǎng)豐富，其肌肉粗蛋白中含人體必需氨基酸含量高達68．85％，要比其他淡水魚高出許多。香魚為濾食性魚類，在自然條件下，魚苗

3、主要攝食浮游動物和貝類幼體；長大后以石礫上附生的硅藻、藍藻及綠藻類為食。人工養(yǎng)殖香魚，蠶蛹、螺肉、剁碎的鮮雜魚蝦及小麥粉、馬鈴薯、黃豆、米糠、青菜等均可作為餌料，也可使用香魚專用餌料或鰻餌料。香魚的分布范圍很廣，除我國外，日本、朝鮮也有分布。香魚的人工養(yǎng)殖始于日本，中國的浙江省已有試驗，河北省已養(yǎng)殖成功，臺灣省則較為盛行。</p><p>　　Apo AI是高密度脂蛋白(HDL)的主要組成蛋白，它能與磷脂、多種血

4、漿因子及細胞受體結合，可以激活卵磷脂膽固醇酰基轉移酶，起著促進細胞內膽固醇的移出、酯化、轉移以及調節(jié)HDL代謝的作用。載脂蛋白在脂蛋白代謝中具有重要的生理功能。一般認為載脂蛋白至少有下列五方面功能：與脂質的親和作用，使脂質溶于水性介質中；運輸膽固醇和甘油三酯；作為脂蛋白外殼的結構成分，它能將各種脂質成分（膽固醇、甘油三酯和磷脂）結合在一起形成一個整體，與脂蛋白外生物信息相聯(lián)系；以配體的形式作為脂蛋白與特異性受體的連接物；激活某些與血漿脂

5、蛋白代謝有關的酶類。Apo AI的臨床意義在于它的測定可以直接反映高密度脂蛋白膽固醇的水平，從而了解冠心病、糖尿病等疾病的嚴重程度。</p><p>　　二、研究的基本內容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究的基本內容：</b></p><p>　　本課題通過構建香魚Apo A-I原核表達載體，并轉入大腸桿菌BL21 pLys

6、 E進行誘導表達目的蛋白，為進一步基因功能研究奠定基礎。</p><p><b>　　擬解決的問題：</b></p><p>　　香魚Apo AI原核表達及鑒定。</p><p>　　三、研究的方法與技術路線：</p><p><b>　?。ㄒ唬┭芯糠椒?lt;/b></p><p&g

7、t;<b>　　1引物設計</b></p><p>　　根據(jù)已獲得香魚Apo A-I基因序列設計原核表達引物：pApo A-I-1（+）：5'-CCATATGCGTACCTTGCAGGCTGATGA-3'；pApo A-I-1（-）：5'-GGAATTCTTATGCCTTAATGGACTCGCT-3'（下劃線為添加的限制性內切酶NdeⅠ和BamHⅠ的識別序列）

8、。</p><p><b>　　2原核表達載體構建</b></p><p>　　2.1 PCR產物切膠純化</p><p>　　以1.2.1中原核表達引物配對進行PCR擴增，PCR產物與10×Laoding Buffer混合，并在1%（w/v）瓊脂糖凝膠中電泳（120V），EB染色后漂洗，紫外燈下觀察，切下預期大小的目的片段，用E.Z

9、.N.A.TM Gel Extraction Kit（OMEGA）純化，具體方法如下：</p><p>　　1)手術刀切下含有目的片段的凝膠并置于Eppendorf管中，加300μl Binding Buffer后置55~60℃水浴10min，每隔2~3min顛倒混勻一次，至凝膠完全溶解；</p><p>　　2)將混合液混勻后轉入藍管，10000g離心1min；</p>&

10、lt;p>　　3)加300μl Binding Buffer，10000g離心1min；</p><p>　　4)棄濾液，加700μl Wash Buffer于藍管中，10000g離心1min；</p><p>　　5)棄濾液，另加700μl Wash Buffer于藍管中，10000g離心1min；</p><p>　　6)棄濾液，13000g離心2min，

11、徹底去除藍管中的Wash Buffer殘留；</p><p>　　7)加入30μl Elution Buffer于藍管，室溫靜置1min，13000g離心1min，收集產物-30℃保存。</p><p><b>　　2.2感受態(tài)制備</b></p><p>　　采用CaCl2法制備感受態(tài)細胞，具體方法如下：</p><p&g

12、t;　　1)接種-80℃長期保存的大腸桿菌菌株到5ml LB（每升含10g Tryptone，5g Yeast Extract，10g NaCl，pH 7.0）液體培養(yǎng)基中，37℃搖床，200rpm，培養(yǎng)過夜（12h左右）；</p><p>　　2)按1:100比例取50μl母液稀釋到新鮮的5ml LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃搖床培養(yǎng)，200rpm，培養(yǎng)2 h；</p><p>　　3)取

13、出菌液置冰上冷卻10min，將冰冷的菌液1ml每管分裝到1.5mL的Eppendorf管，8000g離心1min，棄上清；</p><p>　　4)沉淀用200μl預冷的0.1mol/L CaCl2懸浮，冰浴30min后，8000g離心1min，棄上清；</p><p>　　5)沉淀再用100μl 0.1mol/L CaCl2重懸浮，冰浴放置5~24h備用。</p><

14、p>　　2.3轉化和篩選克隆</p><p>　　1)將10μlPCR產物加到100μl感受態(tài)細胞中，移液槍輕輕吹打混勻冰浴放置30min；</p><p>　　2)在42℃水浴條件下熱激90s，立即轉移到冰上冷卻2min；</p><p>　　3)加入冰預冷的LB培養(yǎng)液總體積至1ml，37℃搖床低速（170~180rpm）培養(yǎng)1h；</p>&

15、lt;p>　　4)在預先均勻涂布X-gal和IPTG的LB平板上（液體LB培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂粉），取100μl轉化后的培養(yǎng)菌液，涂布于含氨卞青霉素（50μg/mL），37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜（10~14h）；</p><p>　　5)篩選白色菌落置5ml含氨卞青霉素（50μg/mL）的LB培養(yǎng)液，在37℃搖床，200rpm，培養(yǎng)8~12 h。</p><p><b>　　

16、2.4質粒提取</b></p><p>　　根據(jù)質粒在下游實驗中用途不同，我們用不同的方法抽提質粒，其中用于檢測和篩選陽性克隆采用采用堿裂法小量抽提質粒。用于雙酶切的質粒采用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I試劑盒（OMEGA）精抽純化。</p><p>　　裂解法（粗提質粒）：</p><p>　　1)取1ml菌液于1.5ml的Epp

17、endorf管中，8000g離心1min，棄去上清；</p><p>　　2)加入溶液I（50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl pH 8.0）100μl，劇烈震蕩使細胞懸?。?lt;/p><p>　　3)加新配制的新鮮溶液II（0.2mol/L NaOH，1%SDS）200μl，輕柔顛倒數(shù)次，待菌懸浮液澄清；</p><p&g

18、t;　　4)加入150μl溶液III（3mol/L Kac，2mol/L HAc），混勻后13000g離心10min；</p><p>　　5)將380μl上清轉移至新的Eppendorf管中，加入異丙醇720μl，顛倒數(shù)次13000g離心10 min；</p><p>　　6)棄上清，沉淀經(jīng)自然干燥后加50μl無菌水溶解。</p><p>　　2.5重組質粒的鑒定

19、</p><p>　　將堿裂法抽提的質粒與10×上樣緩沖液混勻后，1%瓊脂糖凝膠電泳，選擇大小合適的重組質粒進行PCR檢測，PCR檢測體系如前。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離。鑒定為目的重組質粒后，將目的菌株的菌液加10%甘油混勻后置于-80℃保存。</p><p>　　2.6原核表達載體的克隆</p><p>　　1)按（1.2）步驟獲得含有目的基因

20、的克隆。</p><p>　　2)采用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I試劑盒（OMEGA）分別純化質粒pET-22b（+）和PCR產物。</p><p>　　3)對純化的質粒進行雙酶切，反應體系如下：</p><p>　　4)切膠純化：酶切后產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的條帶，用切膠純化試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extracti

21、on Kit（OMEGA）純化，步驟如前所述。</p><p>　　5)連接采用TaKaRa公司的DNA Ligation Kit ver.2，pET-22b（+）載體反應體系如下：</p><p>　　6)將連接產物轉化至TG1菌株，涂于含氨芐青霉素（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基上，篩選所需的克隆，經(jīng)PCR進一步確定。</p><p>　　2.7Apo A-I-1

22、基因的原核表達和檢測</p><p>　　1)采用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I試劑盒（OMEGA）純化目的質粒。</p><p>　　2)轉化至BL21 pLys E菌株，涂于含氨芐青霉素（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)（10~14h）。</p><p>　　3)誘導：挑選單個菌落接種于5ml LB培養(yǎng)液（含50 μg/mL氨芐青霉

23、素），37℃搖床培養(yǎng)過夜。取50μl按1:100比例稀釋接種LB培養(yǎng)液（含50μg/mL氨芐青霉素）5ml中，2h后，取1ml作為對照，其余培養(yǎng)液中加入IPTG（終濃度為0.4mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)2h。</p><p>　　4)檢測：取1ml菌液于1.5ml的Eppendorf管，8000g離心1min，菌體加100μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液（50mmol/L Tris-HCl pH 6.

24、8，100mmol/L DTT，2%SDS，0.01%溴酚藍，20%甘油），煮沸5min，10000g離10min后，取上清20μl進行SDS-PAGE電泳，用未誘導的菌體和BL21 pLys E菌體蛋白作對照，進行電泳。樣品在進入分離膠前用80V，進入分離膠后加至95V。</p><p>　　5)染色與脫色：電泳完成后，取出聚丙烯酰胺凝膠，切去濃縮膠，同時切一角作為方向標記，蒸餾水沖洗。用考馬斯亮藍R-250（

25、0.25% Coomassie’s bright blue R-250）染色，室溫下，染色30min后轉至脫色液，漂洗至凝膠背景無顏色，蛋白條帶清晰，觀察是否表達。</p><p><b>　?。ǘ┘夹g路線</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進度</p><p>　　2010.9-2010.10 畢業(yè)論文選題</p>

26、;<p>　　2010.10-2010.12 進行文獻查閱和資料收集，.完成開題報告及任務書，制定具體研究計劃和試驗方案。</p><p>　　2010.12-2010.12 試驗相關試劑的準備。</p><p>　　2010.12-2011.1 構建香魚Apo AI原核表達載體和香魚Apo AI的原核表達及鑒定。</p><p>　　2011.1

27、-2011.2 數(shù)據(jù)和材料整理、分析。</p><p>　　2011.2-2011.3 完成2篇外文翻譯，論文撰寫、提交并答辯。</p><p>　　2011.4-2011.4 開題答辯與綜述。</p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1] Maciejko JJ, Holme

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48、t;<p>　　Apo AI基因的研究進展</p><p>　　摘要 Apo AI是細胞膽固醇逆向轉運的特殊重要因素，它能與磷脂、細胞受體及多種血漿因子結合，可以激活卵磷脂膽固醇?；D移酶，對細胞內膽固醇的移出、酯化、轉移以及調節(jié)HDL代謝有促進作用。因此，本文對Apo AI基因的結構和功能的研究進展進行概述。 </p><p>　　關鍵詞 載脂蛋白 載脂蛋白基因 冠心病

49、糖尿病 膽固醇</p><p>　　Apo AI是高密度脂蛋白(HDL)的主要組成蛋白，Apo AI主要由肝臟合成，小腸也可合成，占高密度脂蛋白膽固醇（HDL-CHOL）總蛋白的60%～70%，Apo AI的測定可直接反映HDL-CHOL的水平。大量的研究已證明，Apo AI在血清中的濃度與冠心病及動脈粥樣硬化等疾病都存在某種關系(Maciejko JJ，Holmes DR，Kottke BA，等，1983；Ko

50、ttke BA，Zinsmeister AR，Holmes DR Jr，等，1986)。因此關于Apo AI的研究巳逐漸成為冠心病等醫(yī)學研究領域的重要課題。</p><p>　　1、Apo AI的結構</p><p>　　1．1 Apo AI的一級結構</p><p>　　Apo AI是一條由243個氨基酸殘基構成的多肽鏈。Brewer等人（Brewer HB，19

51、78）早在1978年就測定了Apo AI的一級結構。Apo AI分子中含有較多的極性氨基酸，不含有半胱氨酸和異亮氨酸，并且在Apo AI分子中有許多由22個氨基酸殘基形成的重復序列，這些序列都多以脯氨酸作為第一個氨基酸（徐勇霞，付明德，2002）。每一個重復均可形成雙性α-螺旋（amphipathic helix， AH）結構。被稱為脂質結合區(qū)。</p><p>　　1．2 Apo AI的空間結構</p&g

52、t;<p>　　Apo A1分子中的重復序列可以形成雙性螺旋的結構。由于一級結構中極性氨基酸殘基多以相反離子對的形式排列，非極性氨基酸殘基分布在極性氨基酸殘基的周圍。Apo AI在水溶液中呈扁長的橢球形。肽鏈的N端由4個a螺旋形成一個螺旋束。螺旋束是未與脂質結合的Apo AI結構穩(wěn)定性及水溶性的主要因素。肽鏈的C端只有少量的螺旋，主要是無序的結構（Davidson WS，William WM，Haziett T，等，199

53、6）。Apo AI與磷脂結合后，C端的α螺旋含量顯著增加，并成為穩(wěn)定Apo AI分子的主要區(qū)域，N端的α螺旋也相應發(fā)生重排，但總的含量不會改變(Davidson WS，1999)。Marcel及其同事（Brewer HB，Bronzert TJ，Houser A，1995）利用抗原決定簇圖譜發(fā)現(xiàn)，Apo AI分子的N端和中心區(qū)域存在許多不連續(xù)的抗原決定簇，說明肽鏈的中心區(qū)域和N端在二級結構上非常接近。Apo AI三級結構的研究主要是是兩

54、分子Apo AI與脂質結合后形成的新生盤狀HDL，目前認為主要有兩種模型:（1）柵欄模型，Apo AI環(huán)繞盤狀脂質分子，其分子內8個α螺旋反向平行排列</p><p>　　2、Apo AI的生物學功能</p><p>　　2．1 Apo AI與細胞膽固醇的移出</p><p>　　細胞膽固醇的移出可以通過擴散、特異性位點結合、非特異性位點結合3種方式。擴散途徑是以膽

55、固醇濃度差作為動力、膽固醇從細胞膜上脫離，通過擴散作用與球形HDL結合。特異性結合是指在前β-HDL中，Apo AI分子中的雙性a螺旋并未完全與磷脂結合，而可以與細胞膜上特殊的脂表面或者特異性的蛋白受體作用，從而使細胞膜上膽固醇和磷脂同時溶解移出(Gillotte KL，Phillips MC，Davidson WS，等，1998)。Davidson WS等(Davidson WS，Johnson WJ，Anantharamaiah G

56、M，等，1994)利用人工合成Apo AI肽段研究發(fā)現(xiàn)，Apo AI能與細胞膜上雙層磷脂發(fā)生短暫作用，破壞細胞膜上磷脂與膽固醇的結合，使膽固醇從細胞膜上解離的更容易。這種結合不需要特異性位點的參與，稱之為非特異性的結合。</p><p>　　2.2 Apo AI與LCAT的激活</p><p>　　LCAT介導盤狀HDL即preβ-HDL中膽固醇的酯化形成球狀HDL。研究表明preβ-HD

57、L是膽固醇良好的接受體（von Eckardstein et al，2000）。LCAT可催化新生HDL表層的膽固醇酯化，而Apo AI是LCAT的激活劑，新生HDL在LCAT、Apo AI及其它轉運蛋白的參與下變?yōu)槌墒斓腍DL。</p><p>　　2.3 Apo AI與其它血漿園子的結合</p><p>　　與CETP相互作用將CE呈遞給VLDL或LDL。成熟的球狀HDL膽固醇的酯化能

58、力降低，CETP通過其C-端的α-螺旋將HDL中的CE呈遞給CM殘粒、VLDL及LDL，CM及VLDL表面的PL則向HDL轉移。Pussien等(Pussinen PJ，Jauhiainen M，Metso J，等，1998)發(fā)現(xiàn)，Apo AI的N一端能與PLTP結合，結合的區(qū)域限定在Apo AI分子的殘基27—141之間。另外，Apo AI能與肝細胞膜表面的清道夫受體BI(SR—B</p><p>　　I)，介

59、導HDL中的膽固酵酯的轉移。Williams等（Williams DL，Thuahnai ST，Connelly MA，等，2000）研究發(fā)現(xiàn)Apo AI分子C端及N端的A類α螺旋是SR—BI識別的位點。最近提出，當HDL與SR—BI結合后，HDL中的膽固醇酯通過非水相的通道轉移到肝細胞膜上。另一方面，Apo AI可與VLDL結合，從而減少HL與VLDL的結合，Apo AI又可抑制HI對極低密度脂蛋白(VLDL)的水解作用。</p

60、><p>　　3、Apo AI的醫(yī)學功能</p><p>　　3.1 Apo AI與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病疾病的關系</p><p>　　Apo AI在脂蛋白代謝中具有重要的生理功能，能激活某些與血漿脂蛋白代謝有關的酶類，構成并穩(wěn)定脂蛋白的結構。載脂蛋白A1是高密度脂蛋白(HDL)與細胞膜上的HDL受體結合的載體，同時具有維持HDL的結構，并參與膽固醇逆轉的抗動脈粥樣

61、硬化因子。許多研究表明，HDL對動脈血管壁有直接的保護作用（E Navab M，Van Lenten BJ，Reddy S T，等，2000），并能使動脈粥樣硬化病變消退（Rong JX，Li J，Reis ED，等，2001）。目前認為HDL抗動脈粥樣硬化作用的一個重要機制就是它介導了膽固醇的逆轉運（Lin G，2002）。HDL還能夠調節(jié)內皮NO的生成和活性，改善血管內皮功能（Shaul PW，2003）。因此，HDL膽固醇下降時動

62、脈粥樣硬化的危險性增加。載脂蛋白AI為HDL的主要蛋白質，載脂蛋白AI的含量反映了HDL的水平，后者有轉運周圍組織的膽固醇及肝臟進行代謝處理的抗動脈粥樣硬化的功能。HDL膽固醇濃度增高可使血管壁減少與有致粥樣硬化潛力顆粒的接觸（Patsch JR，1994），與冠心病的發(fā)病率呈逆相關。</p><p>　　3.2 Apo AI與糖尿病的關系</p><p>　　糖尿病是21世紀的常見病、多

63、發(fā)病，嚴重威脅人類健康我國糖尿病的患病率迅速增長，其中90%以上屬II型糖尿病。糖尿病除糖代謝紊亂外，還有明顯脂類代謝異常，大量國內外研究已證實，血脂代謝異常是糖尿病患者出現(xiàn)血管并發(fā)癥的重要危險因素（莫蔚林，2004；趙水平，2002）。袁美玲，倪紅兵（袁美玲，倪紅兵，2009)將II型糖尿病組和正常對照組利用氧化酶法、直接一步法與比濁法，證明Apo AI/Apo B100比值的降低與合并血管并發(fā)癥的發(fā)生呈負相關。他還認為定期對糖尿病患

64、者檢查血脂尤其是Apo B100和Apo AI/Apo B100，作為糖尿病患者是否有心血管并發(fā)癥的發(fā)生以及并發(fā)癥嚴重程度的預測。</p><p>　　3.3 Apo AI與丙型肝炎的關系</p><p>　　丙型肝炎病毒(HCV)的感染，不僅能夠引起急慢性病毒性肝炎，而且能夠引起肝纖維化和肝細胞癌，嚴重危害人民的生命健康。HCV感染具有較高的慢性化比例，有時高達80％以上。我國目前一般人

65、群的感染率達3．2％，因而具有更大的危害性（成車，朱傳琳，2000）。不同的研究證明，感染HCV后患者發(fā)生脂肪變的幾率在60—80％（鄧子德，庚惠鴻，何達秋，1996），肝臟脂肪變的主要原因是脂肪代謝障礙。張健，成軍等（張健，成軍，李莉，2002）對HCV陽性患者和健康者進行免疫比濁法、雙試劑，得出HCV與Apo AI 及Apo AII存在著密切聯(lián)系，且影響其在血清中的代謝。Giorgioetal曾報道，應用僅一干擾素(IFN一僅)治療

66、丙型肝炎Soardo G，Pirisi M，F(xiàn)onda M，等，1995；Naeem M，Bacon BR，Mistry B，等，2001)，發(fā)現(xiàn)HCV受體可結合Apo AI及Apo AII，從而影響其功能。</p><p>　　4、Apo AI基因多態(tài)性的研究</p><p>　　多態(tài)性是指在一個生物群體中，同時和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因，亦稱遺傳多態(tài)性或基因多

67、態(tài)性。Apo AI基因突變可導致異常的Apo AI蛋白質的合成。有些異常的Apo AI影響HDL的代謝。已報道的阻礙Apo AI合成的基因突變有重排、缺失、無義突變等方式。目前已發(fā)現(xiàn)至少有20種不同的Apo AI結構基因的點突變導致氨基酸轉換。鄒陽春，胡大一等（鄒陽春，胡大一，楊新春，等，2003）認為載脂蛋白A1基因M1及M2位點MspI酶切長度多態(tài)性改變通過影響高密度脂蛋白膽固醇及載脂蛋白A1血漿水平而與冠心病的發(fā)生發(fā)展存在著某種意

68、義上的內在聯(lián)系。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]Maciejko JJ, Holmes DR, Kottke BA, et al.Apolipoprotein A-I as a marker of angiographically assessed coronary-artery disease [J]. N Engl J M

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87、epatitis C[J]. Am J Gastroenterol, 2001, 96(8): 2468-2472</p><p>　　[26]鄒陽春, 胡大一, 楊新春, 等. 國人載脂蛋白A1基因多態(tài)性與血脂水平及冠心病的關系[J]. 中國動脈硬化雜志, 2003, 11(4):345-348</p><p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p>

88、<p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　香魚Apo AI原核表達及鑒定</p><p><b>　　目錄</b></p><p>　　摘要（Abstract）

89、 </p><p>　　1.引言..........................................................................................................................................................................1</p>

90、<p>　　2.實驗材料與方法......................................................................................................................................................2</p><p>　　2.1原料、儀器和試劑.............

91、..................................................................................................................................2</p><p>　　2.1.1 原料與試劑.......................................................

92、................................................................................................2</p><p>　　2.1.2 主要儀器..........................................................................................

93、.................................................................4</p><p>　　2.1.3主要試劑及其配制......................................................................................................................

94、......................4</p><p>　　2.2 實驗方法..............................................................................................................................................................4</p&

95、gt;<p>　　2.2.1引物設計............................................................................................................................................................4</p><p>　　2.2.2 PCR產物切膠純化

96、............................................................................................................................................4</p><p>　　2.2.3原核表達載體的克隆..........................................

97、..............................................................................................4</p><p>　　2.2.4感受態(tài)的制備...........................................................................................

98、.........................................................5</p><p>　　2.2.5轉化與篩選克隆...............................................................................................................................

99、.................5</p><p>　　2.2.6質粒提取............................................................................................................................................................5</p>&

100、lt;p>　　2.2.7重組質粒的鑒定................................................................................................................................................6</p><p>　　2.2.8 Apo AI基因的原核表達和檢測........

101、................................................................................................................6</p><p>　　3.結果................................................................................

102、..........................................................................................6</p><p>　　3.1 Apo AI的PCR擴增..........................................................................................

103、...................................................6</p><p>　　3.2目的片段的酶切結果.....................................................................................................................................

104、......7</p><p>　　3.3 pET-22b（+）質粒的雙酶切...............................................................................................................................7</p><p>　　3.4重組質粒的檢測.........