鮸魚消化道微生物群落結構和多樣性【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文(設計)</p><p>　題 目：鮸魚消化道微生物群落結構和多樣性</p><p>　學 院：</p><p>　學生姓名：</p><p>　專 業(yè)：生物技術</p><p>　班 級：</p><p>　指導教師：</p>

2、;<p>　起止日期：</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　目錄..I</b></p><p>　　摘要…………………………………………………………………………………….I</p><p>　　AbstractII</p><p

3、>　　引言………………………………….1</p><p><b>　　1 材料與方法3</b></p><p>　　1.1 實驗材料………………………………………………………………….….3</p><p>　　1.1.1 實驗樣品3</p><p>　　1.1.2 主要生化試劑（盒）3</p>

4、<p>　　1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基配制3</p><p>　　1.1.4 實驗儀器4</p><p>　　1.2 實驗方法……………………………………………………………………..5</p><p>　　1.2.1 樣品處理5</p><p>　　1.2.2 平板劃線分離和純化5</p><p&g

5、t;　　1.2.3 細菌DNA提取6</p><p>　　1.2.4 電泳檢測7</p><p>　　1.2.5 16SrDNA的擴增7</p><p>　　1.2.6 PCR反應條件8</p><p><b>　　2 結果與討論9</b></p><p>　　2.1 生物量統(tǒng)計…………

6、…………………………………….………………….9</p><p>　　2.2 形態(tài)學觀察…………………………………………………………………10</p><p>　　2.3 細菌16S rDNA多樣性分析……………………………….………..……..12</p><p>　　2.3.1 DNA的提取、純化和PCR擴增12</p><p>　　2

7、.3.2 系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析13</p><p>　　3 討論和小結18</p><p><b>　　參考文獻19</b></p><p>　　致謝…………………………………………………………………………………..錯誤!未定義書簽。</p><p>　　鮸魚腸道微生物群落結構多樣性 </p><

8、;p>　　[摘要]鮸魚（Miichthys miiuy）是廣泛分布我國東海、南海海域名貴的海水養(yǎng)殖品種，對鮸魚腸道微生物多樣性的研究有助于人們更深入了解鮸魚人工養(yǎng)殖技術。本文利用基于16SrDNA的分子生物學技術對鮸魚腸道微生物可培養(yǎng)部分進行了研究，結果表明：此次試驗檢測到的鮸魚消化道微生物主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、漫游球菌屬(Vagococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus）、代爾夫特菌屬(Delft

9、ia)、 伯克氏菌屬(Burkholderia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、 不動桿菌屬(Acinetobacter) 、泛菌屬(Pantoea) 、希萬氏菌屬(Shewanella)。  初步結論是γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria）的菌株在鮸魚消化道微生物中是優(yōu)勢的類群，在所有可培養(yǎng)菌株中占優(yōu)勢地位。</p><p>　　[關鍵詞]消化道微生物；鮸魚；16SrDNA;；

10、群落多樣性</p><p>　　The diversity and microbial community structure of Miichthys miiuy</p><p>　　[Abstract]：Miichthys miiuy， a kind of valuable sea-water aquiculture species, which is widely distribut

11、ed in the East China Sea, South China Sea area. The study on Miichthys miiuy 's intestinal microbial diversity gives people a better understanding of its artificial breeding technology. Using the 16SrDNA-based molecu

12、lar biology techniques, this paper will study the intestinal microflora of Miichthys miiuy. The result:the intestinal microorganisms detected in croaker ish are mainly (Bacillus)、 (</p><p>　　[Key words]：gast

13、rointestinal microflora;Miichthys miiuy; 16SrDNA; community diversity</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　魚類腸道菌群是腸道的正常組成部分，是腸道微生物與宿主以及所處的水生環(huán)境形成的相互依賴、相互制約的微生態(tài)系，對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、免疫反應以及器官的發(fā)育等方面具有其他因素

14、不可替代的作用，并且影響到魚類的生長、發(fā)育、生理和病理。而且目前，國內(nèi)對腸道微生物的研究主要集中在人類及畜禽動物[5]，對魚類腸道菌群組成的分析的研究卻較為為少見[6]。微生態(tài)學研究表明，環(huán)境條件的輕微改變可導致機體微生態(tài)系統(tǒng)的變化，造成菌群失調(diào)。腸道微生態(tài)系統(tǒng)的破壞還可引起內(nèi)外源性感染，干擾機體營養(yǎng)代謝和免疫功能甚至嚴重影響機體健康狀態(tài)，導致一系列疾病的發(fā)生。因此對腸道菌群組成多樣性進行研究具有至關重要的意義[1]。 </p

15、><p>　　國內(nèi)對魚類腸道菌群的研究起步相對較晚，主要集中在條件致病菌與腸道菌群關系的研究[2]、外界因素對腸道菌群影響的研究和腸道菌群對宿主的消化和生長的影響研究[4]。而且，魚類養(yǎng)殖在我國具有悠久的歷史，當今在我國沿海多種經(jīng)營工程中占居越來越重要的地位。但在魚類流行病防治的方法和提高魚苗成活率方面仍然存在著不少問題，比如說在動物養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展過程中，人們忽視了生態(tài)養(yǎng)殖，在動物疾病發(fā)生時濫用藥物，致使其產(chǎn)品中的

16、藥物殘留對人體健康危害極大。如何進行健康養(yǎng)殖也成為大家關心的問題。魚類胃腸道正常微生物區(qū)系在魚類營養(yǎng)、健康、防病、免疫等方面發(fā)揮著重要作用。從19世紀法國微生物學家巴斯德提出正常菌群對宿主是有益的學說以來，人們對畜禽胃腸道正常微生物群的組成、定制規(guī)律及其與宿主關系有了越來越多的了解口。魚類胃腸道微生物在正常情況下，各種菌群處于穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，保證其胃腸道正常的消化和吸收。同時，有益菌群定殖于胃腸道內(nèi)壁黏膜，形成的非特異性生物保護屏障，能

17、夠抑制病原菌在消化道壁的定殖，維持胃腸道正常的微生態(tài)平衡。當外界環(huán)境發(fā)生變化或飼料變更等應激狀態(tài)時，這種理想的微生物區(qū)系平衡會受到?jīng)_擊，消化道內(nèi)的有害菌群</p><p>　　在研究方法上，由于傳統(tǒng)的基于微生物純化、培養(yǎng)的微生物分類方法研究腸道微生物群落只能研究可培養(yǎng)微生物，不可避免地會遺漏腸道中不可培養(yǎng)的微生物，而且在菌體形態(tài)、菌落形態(tài)、顏色變化等方面的判斷帶有很強的主觀性，因而有著不可逾越的缺陷和不足。198

18、3年問世的PCR技術是分子生物學的一個革命性突破，也是現(xiàn)代分子生物學的基本技術。1986年，Pace等將Woese研究系統(tǒng)發(fā)育的rRNA測序技術用于分析自然微生物群落生態(tài)，從此微生物生態(tài)學研究就進入了一個新的階段[7]。雖然此次課題做的事可培養(yǎng)部分微生物的分離純化，但是主要還是運動了16SrDNA序列檢測的分子生物學技術。現(xiàn)代分子生物學彌補了傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術的不足，為現(xiàn)代微生物資源的研究與開發(fā)開辟了新天地。分子生物學技術已越來越廣泛

19、地用于微生物多樣性研究。經(jīng)過近二十年的研究，腸道微生物的分子生物學研究技術已經(jīng)發(fā)展到了一個新的階段，涌現(xiàn)了許多有效的研究方法，為此次研究提供了了技術支持[8]。</p><p>　　此次研究主要運用了16SrDNA序列檢測的分子生物學技術。對鮸魚幾個部位的消化道菌群進行了分離鑒定，做了相關的形態(tài)特征，革蘭氏染色，電泳檢測，PCR擴增等相關實驗，建立了鮸魚消化道微生物系統(tǒng)發(fā)育進化樹，確定了這鮸魚腸道內(nèi)可培養(yǎng)部分細菌

20、的多樣性和分布以及建立了它們的16SrDNA指紋圖譜，并分析了它們之間的相似性，從而為本地區(qū)魚類疾病的防治、微生物類添加劑以及微生態(tài)育種提供理論依據(jù)</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　實驗材料</b></p><p><b>　　實驗樣品</b></p&

21、gt;<p>　　選擇體重7.5kg的無外傷健壯活潑鮸魚用于試驗，所用試驗用魚自浙江省溫州市外海水域深水養(yǎng)殖網(wǎng)箱。</p><p>　　1,1,2 主要生化試劑（盒）</p><p>　　TaKaRa Taq 寶生物工程（大連）有限公司</p><p>

22、;　　DL2000 DNA marker寶生物工程（大連）有限公司</p><p>　　引物(27f 1492r) 上海生工科技公司</p><p>　　細菌基因組DNA提取試劑盒</p><p>　　1.1.3主要試劑及培養(yǎng)基配制</p><p&g

23、t;　　* 50×TAE的配制（1L）</p><p>　　Tris 242g</p><p>　　冰醋酸 57.1ml</p><p>　　EDTA（0.5mol/L,pH=

24、8.0） 100ml</p><p>　　使用前50倍稀釋為1×TAE，即可用于瓊脂糖凝膠的配制和電泳。</p><p>　　* 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制（1L）</p><p>　　牛肉膏 3g</p><p>　　蛋白胨 10g</p><p>

25、;　　Nacl 5g</p><p>　　瓊脂 15～20g</p><p>　　水 1000ml</p><p>　　使用前調(diào)至合適pH，即可倒平板。</p><p>　　* 6×甘油上樣緩沖液的配制（100ml）</p

26、><p>　　甘油 50ml</p><p>　　1%溴酚藍 5ml</p><p>　　EDTA 30mmol</p><p>　　使用前取1ml該溶液，按1:2000的比例加

27、入0.5μl SYBR Green I（invitrogen）核酸染料。</p><p>　　* LB培養(yǎng)基（1L，pH=7.5）</p><p>　　Trypetone 10g</p><p>　　Yeast Extract 5g</p><p>

28、　　NaCl 10g</p><p>　　向液體培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂粉即為固體培養(yǎng)基；向培養(yǎng)基中加入300μl 20%（200mg/ml）氨芐青霉素即為Amp抗性培養(yǎng)基。</p><p><b>　　* X-gal貯液</b></p><p>　　將X-gal粉末溶解于二甲

29、基亞砜（DMSO）中，配成20mg/mL的貯液，分裝后避光保存于-20℃以備使用，無須過濾或滅菌。</p><p><b>　　* IPTG溶液</b></p><p>　　將IPTG粉末溶于無菌水中，配成200mg/mL的溶液，分裝后保存于-20℃以備使用，無須過濾或滅菌。</p><p><b>　　1.1.4實驗儀器</b

30、></p><p>　　表1實驗所用儀器及生產(chǎn)廠家</p><p>　　Table 1 equipments and manufactures in the experiment</p><p><b>　　實驗方法</b></p><p><b>　　樣品處理</b></p>

31、<p>　　將取到的鮸魚在保證其存活的條件下運到實驗室，然后在魚體表面用75酒精消毒，用在無菌條件下按照無菌操作程序剪肛、系線、掀腸壁，在每條魚腸道的不同位置取樣進，取其前腸、中腸、后腸、幽門、前胃、后胃、口咽7個部位樣品。按順序?qū)⑷〉降臉悠窐俗鱉.for, M.mid,M.hin ,M.pyl, M.pro,M.hs，M.op、放到超低溫冰箱-70度保存。</p><p>　　1.2.2平板劃線分離和

32、純化</p><p>　　1）將取到的7個部位的樣品剪碎，放到滅菌鍋的EP管中，加入無菌水進行搖勻。</p><p>　　2）取lmL混合液以10倍遞增稀釋方法（一份混合液，九份無菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份無菌水，依次類推），將其稀釋至10-1，10-2，10-3倍。分別記為A，B，C。</p><p>　　3）右手持盛培養(yǎng)基的三角燒瓶置火焰旁邊，用左手瓶

33、塞輕輕地拔出，瓶口對著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無名指夾住瓶塞（也可將瓶塞放在左手邊緣或小指與無名指之間夾住。如果三角燒瓶內(nèi)的培養(yǎng)基一次用完，瓶塞則不必夾在手中）左手持培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰旁打開一縫，迅速導入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置桌面上，待凝后即為平板。</p><p>　　4）將之前存放的樣品拿出，放到無菌操作間中，將左手斜持平板底，右手持接種環(huán)。接

34、種環(huán)在火焰上滅菌，冷卻后，沾取一接種環(huán)標本，先在平板的一端涂開，并從此處開始向下劃密集的平行線，約占平板面積的一半。</p><p>　　5）將平板轉(zhuǎn)180°角，從平板另一端開始也劃密集的平行線，直到劃滿平板的剩余部分。</p><p>　　將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)火焰滅菌后放下，將平板倒置，37℃培養(yǎng)。</p><p>　　6)從分離的平板上單個菌落挑取

35、少量菌苔，涂在載玻片上，在顯微鏡下觀察細胞的個體形態(tài)，結合菌落形態(tài)特征，綜合分析。如不純，仍需平板分離法進行純化，直至確認為純培養(yǎng)為止。</p><p>　　7）記錄形態(tài)特征，進行革蘭氏染色，記錄結果。</p><p>　　1.2.3細菌DNA提取</p><p>　　1ml、0.05g為例。采用TIANampBacteriaDNAkit來進行細菌DNA提取，在使用

36、試劑來提取DNA之前，先要注意以下步驟：</p><p>　　1）第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在緩沖液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇。</p><p>　　2）樣品應該避免反復凍融，否者會導致提取的DNA片段較小、提取量下降。</p><p>　　3）若緩沖液GA或GB當中有沉淀，可在56℃水浴中重新溶解，并搖勻后使用。</p><p&g

37、t;　　4）所有離心步驟均為使用臺式離心機，室溫下離心。</p><p><b>　　提取步驟：</b></p><p>　　1）取細菌培養(yǎng)液1ml，10000rpm（11500xg）離心一分鐘，盡量洗凈上清。</p><p>　　2）向菌體沉淀中加入200ul緩沖液GA，震蕩至菌體徹底懸浮。注意：對于較難破壁的革蘭氏陽性菌，可略過第二步驟，加

38、入溶菌酶進行破壁處理，具體方法為：加入180ul緩沖液20mM Tris，pH8.0；2 mM Na2-EDTA;1.2%Triton)終濃度為20mg/ml的溶菌酶（溶菌酶必須用溶菌酶干粉溶解在緩沖液中進行配制，否則會導致溶菌酶無活性），37度處理30分鐘以上。如果需要去除RNA，可加入4 ul RNaseA（100mg/ml）溶液</p><p>　　3）向管中加入20ul蛋白酶K溶液，混勻。</p&

39、gt;<p>　　4）加入220ul緩沖液GB，震蕩15秒，70℃放置10分鐘，溶液變得清亮，簡短離心以去除管壁內(nèi)壁水珠。注意：加入緩沖液GB時可能產(chǎn)生白色沉淀。一般70℃放置時會消失，不會影響后續(xù)試驗。如溶液未變的清亮，說明細胞裂解的不徹底，可能導致提取DNA量少喝提取出的DNA不純。</p><p>　　5）加220ul無水乙醇，充分震蕩混勻15秒，此時可能出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管壁內(nèi)壁的

40、水珠。</p><p>　　6）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（13400xg）離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。</p><p>　　7）向吸附柱CB3中加入500ul緩沖液GD（檢查是否加入無水乙醇），12000rpm（13400xg）離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。</p>&

41、lt;p>　　8）向吸附柱CB3中加入600ul緩沖液PW（檢查是否加入無水乙醇），12000rpm（13400xg））離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。</p><p>　　9）重復操作步驟8。</p><p>　　10）將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（13400xg）離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干媳婦材料中殘余的漂

42、洗液。注意：這一步目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應（酶切PCR等）實驗。</p><p>　　11）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，將吸附膜的中間部位懸空滴加50-200ul洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm（13400xg）離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。注意：洗脫緩沖液體積不應少于50ul，體積過小影響回收率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響

43、，若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)（可以用NaOH將水的pH調(diào)至此范圍，pH值低于7會降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應保存在-20℃，以防DNA降解。為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2分鐘，12000rpm（13400xg）離心2分鐘。</p><p><b>　　1.2.3電泳檢測</b></p><p>　　

44、將上一步中所提取的沉積物總DNA用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DL2000DNA Marker作為標準分子量DNA，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。DNA片段大小正確，條帶均一的直接用于后續(xù)PCR擴增。</p><p>　　1.2.416SrDNA的擴增</p><p>　　使用細菌16S rDNA通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-

45、TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），使用實驗方法2中提取得到的DNA作為模板。PCR反應體系如下：</p><p>　　10x PCR緩沖液：2.5μL</p><p>　　25mM MgCl2:2.5μL</p><p>　　（2mM）dNTP：2.5μL</p><p>　　Taq酶：0.5uL（0.2μL，10u/μL

46、）</p><p>　　5μM的引物（27F）：1.0μL</p><p>　　5μM的引物（1492r）：1.0μL</p><p>　　模板DNA：1.0μL</p><p>　　加dd H2O補至25μL</p><p>　　1.2.5 PCR反應條件</p><p>　　使用T-Grad

47、ient PCR儀，反應條件如下：</p><p>　　95℃預變性5min，</p><p>　　94℃ 1min；</p><p>　　56.5℃ 30S； 循環(huán)35次</p><p>　　72℃ 2min；</p><p>　　72℃ 10min</p>

48、;<p>　　采用1.2%瓊脂糖膠，DL2000做為marker進行電泳檢測16SrDNA擴增情況，檢測結果較好的于4℃冰箱保存。16S rDNA擴增片段在1500bp左右的克隆產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。</p><p><b>　　結果與討論</b></p><p><b>　　生物量統(tǒng)計</b></p&g

49、t;<p>　　從表2.1可以很明顯地看出鮸魚消化道細菌數(shù)量大部分分布在腸道，總體趨勢是前腸63%＞后腸11%＞中腸5%，周文豪，楊雨輝等發(fā)現(xiàn)鯉魚，草魚等淡水微生物腸道菌群的數(shù)量具有從前腸到后腸逐漸增多的現(xiàn)象，于是猜測可能是由于腸道內(nèi)容物由前向后推進的緣故，也可能是腸道內(nèi)容物及其環(huán)境更有利于微生物生長繁殖[12]。顯然和此次試驗結果不同。而目前為止海水魚腸道菌群數(shù)量分布還有待驗證，但從此次實驗結果來看，海水魚腸道微生物分布

50、和淡水魚腸道菌群分布不一樣。具體原因還有待研究。</p><p>　　此次在前胃后胃并沒有找到多少菌群，可能跟分離時培養(yǎng)基pH和胃里pH不同，因此分離不到細菌，不過幽門處菌群含量18%遠遠大于前胃1%和后胃1%。幽門是胃部和小腸的接口處，pH相對較高，因此分離到了細菌。馮曉燕等學者研究結果指出：海水魚主要消化工作集中在胃部。因此胃部分離到的菌落應該遠遠不止如此，因為鮸魚前胃后胃的pH在1.14左右，而幽門的pH在

51、6.40左右，因此猜測胃此次胃部分離到的菌株只是胃里面的部分菌群，大部分菌群由于培養(yǎng)基pH問題無法培養(yǎng)。而口咽分離得到的細菌只占全部菌群的1%，證明口咽咽在鮸魚進行消化活動時起的作用微乎其微。</p><p>　　總而言之，此次分離得到的菌群大部分集中在腸道，占所有菌群的79%，其次是胃部占20%，口咽只占1%，由此可見鮸魚消化道可培養(yǎng)部分菌群的數(shù)量關系是腸道＞胃＞口咽。幾乎所有的研究都是以腸道菌群內(nèi)容物為研究對

52、象，對腸壁菌群的研究極少，而腸壁菌群才是真正意義上的定植菌株。因此，魚類腸壁菌群分布和作用尚須今后深入研究。</p><p>　　表1 各組織中細菌數(shù)量分布</p><p>　　Table 1 The number of bacteria distribution in Different organizations</p><p>　　注：“+++”表示數(shù)量太多，

53、無法統(tǒng)計?！?”表示平板中沒有長出菌落,“/”代表不符合要求，無法計數(shù)</p><p><b>　　形態(tài)學觀察 </b></p><p>　　從表3經(jīng)過統(tǒng)計可以得到，純化后共135個菌株，形態(tài)特征幾乎全部呈桿狀或只有少量球狀或者弧狀，由于此次試驗分離的是可培養(yǎng)部分菌株。因此，可得出結論鮸魚消化微生物可培養(yǎng)部分細菌形態(tài)主要以桿狀為主。共43個菌株在革蘭氏染色中呈陽性，

54、占總菌落數(shù)的31.8%。其中前腸10個，中腸16個，后腸13個，幽門3個，口咽1個，前胃后胃均為0。剩余92個革蘭氏染色呈陰性，占總分離菌落數(shù)的68.2%。其中前腸24個，中腸21個，后腸18個，幽門18個，前胃后胃共8個，口咽3個。由此可以初步討論出，在鮸魚消化道中，革蘭氏陰性菌株是優(yōu)勢菌株，且大部分分布在腸道，占38.3%，在其他消化道所占比例很小，在胃中只占10.3%。進一步驗證了眾多學者研究的出來的結論：海水魚腸道菌群中的優(yōu)勢菌

55、為革蘭氏陰性菌，同時也存在革蘭氏陽性菌。具體統(tǒng)計結果如圖2。 </p><p>　　表2 細菌形態(tài)及革蘭氏染色觀察</p><p>　　Table 2 bacterial morphology and Gram staining results</p><p>　　圖1鮸魚消化道分離的各菌群革蘭氏染色結果</p><p>　　Fig1 The

56、 Bacterial and and the Gram staining results</p><p>　　細菌16S rDNA多樣性分析</p><p>　　2.3.1DNA的提取、純化和PCR擴增</p><p>　　細菌總DNA提取之后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖：</p><p>　　圖2 PCR產(chǎn)物純化后電泳圖</p>

57、;<p>　　Fig2 the purification of PCR production in the agarose gel</p><p>　　使用細菌16S rDNA通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），使用純化后的細菌DNA作為模板。進行PCR擴增從純化，將純化后的DNA使用1.2

58、%瓊脂糖膠，DL2000做為marker進行電泳檢測。從圖中可以發(fā)現(xiàn)pr.03、f.03等10個擴增序列，條帶亮度高，證明DNA含量高，擴增效果好。但是m.09、hs.05等16個PCR產(chǎn)物無明顯條帶，可能與溫度有關，采用53-60℃的溫度梯度PCR進行擴增，電泳檢測有明顯條帶出現(xiàn)，說明擴增效果較好，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。</p><p>　　2.3.2系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析</p>&l

59、t;p>　　2.3.2.1稀釋曲線</p><p>　　公司測回的序列通過Seqman軟件進行序列拼接，一共得到有效序列26個，然后采用DOTUR軟件對有效序列進行OUT分類，在進化距離D為0.02時，共計得到24個OUT，同樣進化距離D為0.02時繪制多樣性稀釋曲線如圖2.3.2.1，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，該曲線與45度角平分線接近，并且曲線上端上升變緩，說明物種的多樣性水平較高。</p><

60、;p><b>　　圖3 稀釋曲線</b></p><p>　　Fig 3 Dilution curve</p><p>　　2.3.2.2生境分析</p><p>　　進化樹中19個樣品序列在NCBI中找到的最相近克隆子及其生境如表4所示。</p><p>　　表3相近克隆子及其生境</p><

61、p>　　Table 3 Similar to the clones and their habitats</p><p>　　據(jù)表4所示，登錄號為NR_025689.1漫游球菌屬是從碎牛肉中分離得到的，部分漫游球菌屬的細菌能引起人類感染。國外已經(jīng)有許多報告。登錄號為JF784032.1的葡萄球菌屬是在印度東海岸中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)為非致病菌，但少數(shù)也能治病。 登錄號為HQ236088.1的泛菌屬是在中國南京的龍山鉀

62、礦首次發(fā)現(xiàn)，是代謝和發(fā)酵類型的化能異養(yǎng)菌。不動桿菌屬則是在飛機機艙空氣中發(fā)現(xiàn)。對其進行統(tǒng)計討論，表中共10屬菌發(fā)現(xiàn)的生境各不相同。</p><p>　　2.3.2.2系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析</p><p>　　經(jīng)過OUT分類后的24個序列與genebank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比較，然后將數(shù)據(jù)庫中相似性大于95%的序列導出，利用MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2.3.2.2。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，

63、實驗得到的克隆序列與數(shù)據(jù)庫中的序列能夠較好的融合的在一起，并且彼此之間具有較近的親緣關系。</p><p>　　圖4鮸魚消化道微生物系統(tǒng)發(fā)育樹</p><p>　　Fig 4 The Microbial phylogenetic tree of Miichthys miiuy</p><p>　　從表4和圖4可以看到，有7株菌屬于厚壁菌門(Firmicutes)其中

64、一株屬于漫游球菌屬(Vagococcus)2株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)2株屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus）。除去O01相似度為72%外，其余相似度都為100%。通常菌株相似度達98%以上，則可認為是同一個總?cè)骸Ａ硗鈨芍晡粗N屬，不過根據(jù)其相似度，估計其屬于厚壁菌門(Firmicutes)芽孢桿菌目(Bacillales)。剩下所有菌株均屬于變形菌門(Proteobacteria)。歸為β-變形菌綱(Betapro

65、teobacteria) 和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria）兩個大綱。其中2株屬于β-變形菌綱(Betaproteobacteria)，剩余10株屬于 γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria）具體種屬可見表2.3.2.2。屬于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria）有10個樣品菌株，并且包括4個亞目(伯克氏菌目，假單胞菌目、腸桿菌目和交替單胞菌目)。很明顯γ-變形桿菌綱的菌株是鮸魚消化道

66、中是優(yōu)勢菌株，由于實驗室最近幾年對東海大陸架沉積物</p><p>　　同時，在鮸魚消化道內(nèi)檢測出的不動桿菌屬和假單胞菌，周宗澄、倪純治等在鯔魚(Mugil cephalus)、黃鰭綢魚(Sparus latus)等于上都檢測到了這兩個菌屬，進一步驗證了這兩種菌是海水魚消化道中最常見的細菌[14-15]。</p><p>　　綜上所述，鮸魚消化道微生物區(qū)系的形成和其生存環(huán)境、食性和總類都有

67、著聯(lián)系。</p><p><b>　　討論和小結</b></p><p>　　腸道微生物是一個復雜多樣的群體，同時也是動物體的重要組成部分。魚類腸道中每克內(nèi)含物中大約存在108個異養(yǎng)性微生物和105個厭氧細菌，它們與宿主相互依存并相互影響。腸道菌群在魚類的生長發(fā)育過程中擔當非常重要的作用，它既要參與營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，同時也要擔當機體的防御功能，維護機體健康[16-

68、17]。</p><p>　　本實驗通過分析技術鮸魚消化道菌群的多樣性進行分析，分析它的腸道菌群和其他同一食性魚類或者不同食性魚類在同一條件下的差異，得出結論食性差異大的魚類之間腸道菌群差異也更為明顯。本研究證明，16SrDNA技術是一種能夠快速有效地研究魚類腸道菌群的技術，是較其它方法更簡單、靈敏度更高、可重復性和可靠性較好，且能較為全面反映菌群結構多樣性的方法。</p><p>　　不

69、過本次研究依然存在不足之處，比如提取樣品過少，純化后的單菌落沒有進行數(shù)量統(tǒng)計，對后來的結果分析造成很大不便。如果能結合不可培養(yǎng)部分對鮸魚消化道微生物進行定量分析，那么此次研究的意義將遠遠不止于此，但是總體上，此次實驗的結果還是比較令人滿意。雖然沒有確定了這鮸魚腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群的種類和數(shù)量，但是對菌群的的種屬和分布都有大體上的了解。從而為本地區(qū)魚類疾病的防治、微生物類添加劑以及生態(tài)育種提供理論依據(jù)。</p><p>

70、　　鮸魚作為我國東海著名的經(jīng)濟魚種，通過這次對鮸魚消化道微生物的研究，未來幾年可以在此研究基礎上研究鮸魚腸道菌群的功能及微生態(tài)制劑對鮸魚腸道菌群功能的影響。希望可以通過對鮸魚腸道菌群的研究，更好的了解消化道菌群在鮸魚生長發(fā)育所發(fā)揮的作用，從而更好的通過鮸魚人工養(yǎng)殖項目為社會產(chǎn)生良好的經(jīng)濟和生態(tài)效益。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[

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