基于BIPES分析三種沉積物的微生物群落多樣性.pdf

1、自然環(huán)境中的微生物大都以群落形式存在，它們通過驅(qū)動生命基本元素進(jìn)行生物地球化學(xué)循環(huán)，分解各種污染物。沉積物是一個特殊的水生環(huán)境領(lǐng)域，其中的微生物多樣性比其對應(yīng)的水體環(huán)境更加豐富。為了更好的理解微生物對生物地球化學(xué)循環(huán)的潛在影響，尋找微生物資源，科學(xué)家們對沉積物特別是海洋沉積物展開了廣泛的研究。另外，研究者在潮間帶根際和沉積物中發(fā)現(xiàn)了大量與初級生產(chǎn)力有關(guān)的微生物，并且發(fā)現(xiàn)了大量外源污染物降解菌，也引起了研究者在潮間帶沉積物中尋找微生物資源

2、的興趣。而相對上述兩種類型的沉積物人們對淡水沉積物的研究較少。據(jù)報道，Meta分析顯示淡水沉積物的細(xì)菌和古細(xì)菌α多樣性比海洋沉積物要豐富。但是許多研究實驗因素如PCR條件，測序方法，16srRNA可變區(qū)和引物的選擇會影響微生物的α多樣性分析。本研究采用統(tǒng)一的實驗方案，通過Illumina高通量測序技術(shù)，詳細(xì)比較了中國南部沿珠江分布的淡水，潮間帶和海洋三種沉積物中的微生物群落結(jié)構(gòu)，分析比較不同類型沉積物中的微生物α和β多樣性的異同。

3、>　　 目的:
　　 比較中國南部沿珠江分布的淡水、潮間帶和海洋三種不同類型沉積物微生物多樣性及每種沉積物中主要富集的微生物物種;通過分析潮間帶濕地沉積物細(xì)菌和古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特點，為潮間帶是一個獨特的海陸邊緣生態(tài)系統(tǒng)理論提供一些理論依據(jù)。
　　 材料和方法:
　　 我們于2009年8月在流溪河水庫(LXR freshwater)、潮間帶濕地（香港米埔紅樹林濕地-MP）和近海港口(YOW)共采集35個土壤樣品。其

4、中淡水沉積物13個樣品，潮間帶濕地沉積物14個，海洋沉積物8個;所有的沉積物樣品用Mobio土壤DNA提取試劑盒提取沉積物中基因組總DNA;用帶有barcode的16s rRNA V6細(xì)菌引物967F(CNACGCGAAGAACCTTANC)和1046R(CGACAGCCATGCANCACCT)擴增35個沉積物樣品，另外，用同樣帶有barcode的16s rRNA V6古細(xì)菌引物958F(AATTGGANTCAACGCCGG)和1048

5、AR(CGRCGGCCATGCACCWC)擴增13個潮間帶沉積物樣品。擴增后的PCR產(chǎn)物混合后送去華大基因公司用Solexa GA(Ⅱ)測序儀進(jìn)行PE75測序;測序數(shù)據(jù)我們采用BIPES分析流程提取粗序列，用UCHIME去除嵌合體，最終得到的干凈序列再用TSC聚類算法聚成相似度為97％OTUs，最后用包含這些OTUs分類信息的群落結(jié)構(gòu)分析沉積物的微生物多樣性。
　　 結(jié)果:
　　 1、三種沉積物測序數(shù)據(jù)經(jīng)過BIPES流程

6、分析共得到2，318，609條序列，UCHIME去除嵌合體后剩余2，311，761條序列，然后經(jīng)TSC聚成96，937個OTUs。樣品的測序深度大都在（4萬-10萬）條序列，其中一個樣品W12達(dá)到174，678條序列。
　　 通過做三種沉積物歸一化和非歸一化的稀釋曲線分析比較沉積物群落結(jié)構(gòu)的α多樣性，結(jié)果顯示上游淡水湖沉積物的細(xì)菌群落α多樣性最高，海洋沉積物最低，潮間帶沉積物細(xì)菌群落α多樣性處于中間位置。
　　 三種沉積

7、物群落結(jié)構(gòu)門水平的分布模式顯示，潮間帶沉積物主要細(xì)菌門的群落分布模型同樣介于淡水湖和海洋沉積物之間，和前面的細(xì)菌群落α多樣性分析結(jié)果類似。門水平級別所有樣品的OTUs做主成分分析，PCA結(jié)果顯示三種微生物群落在門水平級別可以非常明顯的分開，說明三種沉積物中的細(xì)菌門有較大的差別。例如，變形桿菌組（γ-、ε-、δ-和NA）主要富集在海洋和潮間帶沉積物中;而酸桿菌和硝化螺菌主要富集在淡水沉積物中。
　　 三種類型沉積物群落結(jié)構(gòu)屬水平分

8、析。文中列出10種多度最高種屬，發(fā)現(xiàn)潮間帶沉積物可能是淡水與海洋沉積物的一個過渡。PCA主成分分析屬水平與門水平結(jié)果相比，三種沉積物群落分開的更好，說明三種沉積物細(xì)菌屬的差異更加明顯。另外，潮間帶沉積物中富集大量與硫還原有關(guān)的種屬脫硫洋蔥菌屬(Desulfobulbus)，硫還原菌屬（Desulfobacterium），脫硫單胞菌(Desulfuromonas)，Desulforhopalus和脫硫桿菌屬(Desulfofustis)。

9、此外，我們還發(fā)現(xiàn)潮間帶濕地中細(xì)菌群落與五種已知環(huán)境因子中的三種營養(yǎng)相關(guān)環(huán)境因子(TOM，TKN和TP)緊密相關(guān)。
　　 三種類型沉積物群落結(jié)構(gòu)屬水平分析OTUs水平分析。用全部OTUs數(shù)據(jù)聚類分析，primer6.0聚類結(jié)果顯示三種沉積物共聚成兩類:淡水沉積物聚成一類，海洋沉積物與潮間帶沉積物聚成一類。PCA主成分分析同樣展現(xiàn)類似的結(jié)果。
　　 在OTUs不同多度水平（≥0.1％到只包含兩條序列）上做PCA主成分分析，結(jié)

10、果顯示在OTUs不同多度水平上三種沉積物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)都可以明顯的區(qū)分開，說明不論是高多度還是稀有的細(xì)菌群落都會特異的富集在各自的棲息地。另外，隨著OTUs多度水平的增加，主成分分析PC1+PC2的所占比例也逐步增大，說明高多度的物種相對低多度物種受到的環(huán)境壓力選擇更大。
　　 LEfSe統(tǒng)計結(jié)果顯示，淡水沉積物主要富集酸桿菌，硝化螺菌屬，疣微菌門和α-和β-變形桿菌。潮間帶沉積物生物富集一些初級生產(chǎn)者和腐生菌，如Chlorof

11、lexi（綠灣菌門），Bacillariophyta（硅藻門），γ-、ε-Proteobacteria（γ-、ε-變形桿菌），Bacteroidetes（擬桿菌門），F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門），和Actinomycetales（放線菌門）。而海洋沉積物則主要富集γ-和δ-變形桿菌中的一些厭氧條件下與硫還原有關(guān)的細(xì)菌目。
　　 2、潮間帶13個沉積物樣品（除去W12）經(jīng)過BIPES分析共獲得了839，616條16S rRNA

12、 V6序列。去除嵌合體后，共獲得837，041條干凈的序列，每個樣品大概平均64，388條序列（從47，583條到80，427條）。所有樣品歸一化成40000條序列。α多樣性分析結(jié)果顯示有植被覆蓋的沉積物微生物多樣性要比無植被覆蓋的光灘高。微生物群落相似性分析結(jié)果顯示所有樣品共聚成兩類。第一大類包括泥灘沉積物,米草沉積物和紅樹林邊緣沉積物三種采樣點樣品。第二類包括紅樹林內(nèi)部和根際沉積物，這兩類沉積物進(jìn)一步聚成五個亞組。并且在OTUs不同

13、多度水平(≥1000，100-999，10-99，2-9)上的聚類模式與用全部OTUs得到的結(jié)果類似。
　　 潮間帶沉積物細(xì)菌門水平分析，顯示平均多度水平≥1％的門或變形菌綱共有16個。γ-、δ-變形桿菌和浮霉菌門這三種門在五種采樣點的沉積物中所占比例都達(dá)到50％。比較第一組和第二組微生物群落，16種多度較高的門中有6種具有統(tǒng)計學(xué)意義(t-test，P＜0.05)，這些門是Planctomycetes（浮霉菌屬），F(xiàn)irmicu

14、tes（厚壁菌門），Chlorobi（綠菌門），ε-Proteobacteria（ε-變形桿菌），Nitrospira（硝化螺菌屬），Lentisphaerae（黏膠球形菌門）。
　　 潮間帶沉積物中高多度OTUs。潮間帶濕地沉積物10種多度最高的OTUs9種是來自變形桿菌，特別是γ-和δ-變形桿菌。統(tǒng)計分析顯示五種沉積物中10種多度最高的OTUs有8種是具有統(tǒng)計學(xué)意義的(one-way ANOVA test，P＜0.05)。<

15、br>　　 五種不同棲息地中OTUs的統(tǒng)計學(xué)差異。將OTUs分成4種不同多度水平，將13個沉積物樣品中OTUs多度數(shù)據(jù)每行都采用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差公式(Value=[(Value)-Mean(Row x)]/[Standard deviation(Row x)])進(jìn)行歸一化后用one-way ANOVA test統(tǒng)計分析方法做差異OTUs熱圖揭示了五種不同沉積物中OTUs存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。在每種多度水平上，我們都能看到OTUs

16、在五種不同沉積物中的相對多度差異，說明細(xì)菌群落之間的差異可能是由于棲息地環(huán)境選擇的結(jié)果。
　　 對兩大聚類組的OTUs采用t-test進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩大聚類組中有統(tǒng)計學(xué)差異的OTUs存在于同一細(xì)菌門的現(xiàn)象揭示了不同的棲息地有不同的選擇優(yōu)勢。
　　 另外，還揭示了泥灘和根際沉積物特殊的OTUs。泥灘中大部分的菌群主要是硫酸鹽還原菌，脫硫單胞菌，酸桿菌門，梭菌目，和外硫紅螺菌科;而根際中特殊的OTUs主要來自浮霉?fàn)罹?，生絲

17、微菌屬，假單胞細(xì)菌目，硝化螺菌屬和暖繩菌科。
　　 3、潮間帶12個沉積物樣品經(jīng)過BIPES分析共獲得129，830條序列。去除嵌合體后共獲得129，480條干凈的序列，每個樣品大概平均10，790條序列（從2，088條到30，084條）。所有的干凈序列經(jīng)TSC聚類后得到3404個OTUs。
　　 通過做潮間帶濕地沉積物歸一化和非歸一化的稀釋曲線分析比較濕地內(nèi)部不同采樣地點的古菌α多樣性，結(jié)果顯示紅樹林邊緣沉積物古細(xì)菌多

18、樣性最高，泥灘次之，根際再次之，而紅樹林內(nèi)部的古細(xì)菌多樣性最低。這與我們前面分析的潮間帶濕地的細(xì)菌α多樣性相反。
　　 潮間帶濕地古細(xì)菌群落門分布模式顯示四個采樣點古細(xì)菌群落分布大致一致，主要由廣古菌門和泉古菌門組成，另外，在mangrove組和mudflat組還有很少一部分納米古菌門存在。
　　 潮間帶濕地古細(xì)菌群落綱分布模式顯示泉古菌門共有4個分類群，主要是熱變形菌綱，其次MBGB，而MGI和MBGA這兩個類群相對較

19、少。廣古菌門有8個分類群，以甲烷微菌綱為主，后面的幾種分類群依次是甲烷桿菌、熱原體綱、嗜鹽桿菌、TMEG、甲烷球菌綱、熱球菌綱和MGⅡ。
　　 潮間帶濕地全部的OTUs PCA主成分分析顯示除了mudflat組樣品聚類緊密外，其余三組樣品聚類較分散，這可能是由于我們的測序深度不夠或是樣品之間差異不大所造成的。
　　 結(jié)論:
　　 1、細(xì)菌多樣性以淡水沉積物最高，潮間帶次之，海洋最低。
　　 2、潮間帶內(nèi)部

20、有植被覆蓋的沉積物細(xì)菌α多樣性高于無植被覆蓋的光灘沉積物。
　　 3、古細(xì)菌與細(xì)菌相反，其α多樣性光灘沉積物高于紅樹林沉積物。
　　 4、淡水沉積物中主要富集酸桿菌，硝化螺菌屬，α-和β-變形桿菌和疣微菌門;海洋沉積物富集一些γ-和δ-變形桿菌中在厭氧條件下與硫還原有關(guān)的細(xì)菌目;而潮間帶沉積物則主要富集一些初級生產(chǎn)者和腐生菌，如綠灣菌門，硅藻門，γ-和ε-變形桿菌，擬桿菌門，厚壁菌門和放線菌門。另外，古細(xì)菌群落主要由泉古