msap技術(shù)及其在動(dòng)植物遺傳育種中的研究進(jìn)展【文獻(xiàn)綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　MSAP技術(shù)及其在動(dòng)植物遺傳育種中的研究進(jìn)展</p><p>　　摘要：DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一，它參與了基因表達(dá)、生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答等過(guò)程，在基因表達(dá)的調(diào)控中具有重要作用。隨著對(duì)

2、DNA 甲基化研究的深入，在AFLP 技術(shù)基礎(chǔ)上衍生的DNA 甲基化敏擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（MSAP），以其高通量、高多態(tài)性、低成本、易操作等優(yōu)點(diǎn)，在各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本文綜述了該技術(shù)的基本原理與操作，及其研究現(xiàn)狀。</p><p>　　關(guān)鍵詞：文蛤，DNA甲基化，MSAP技術(shù)</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　文蛤（

3、Meretrix meretrix Linneus）又名花蛤，屬于軟體動(dòng)物門(mén)、雙殼綱、真瓣鰓目、簾蛤科、文蛤?qū)?。其貝殼略呈三角形，腹緣呈圓形，殼質(zhì)堅(jiān)厚，兩殼大小相等，喜生活在有淡水注入的內(nèi)灣及河口附近的細(xì)沙質(zhì)海灘上。文蛤肉嫩味鮮，是貝類海鮮中的上品，其中含有蛋白質(zhì)10%，脂肪1.2%，碳水化合物2.5%，而且還含有人體易吸收的各種氨基酸和維生素及鈣、鉀、鎂、磷、鐵等多種人體必需的礦物質(zhì)。文蛤是埋棲型貝類，大多分布在較平坦的河口附近沿岸內(nèi)

4、灣的潮間帶，以及淺海區(qū)域的細(xì)沙，如遼寧遼河口、山東黃河口、江蘇長(zhǎng)江口、廣西北海灣等地自然資源豐富。目前，我國(guó)文蛤主產(chǎn)區(qū)如東縣沿海地區(qū)大約有35萬(wàn)畝海灘的養(yǎng)殖規(guī)模，年產(chǎn)有3萬(wàn)噸左右。</p><p>　　文蛤的全人工育苗技術(shù)在我國(guó)已有新的突破，但至今工廠化育苗尚未形成生產(chǎn)能力?？抗S化育苗提供大量商品文蛤苗種，目前尚有困難。苗種來(lái)源主要依靠采捕自然苗或半人工采苗。以攔網(wǎng)與耙灘相結(jié)合的文蛤半人工采苗既簡(jiǎn)便，又易操作，

5、成本又低，這一采苗方法是可行的，值得推廣。</p><p>　　1.DNA的甲基化及其分析方法</p><p>　　DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一，它參與了基因表達(dá)、生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答等過(guò)程，在基因表達(dá)的調(diào)控中具有重要作用。甲基化通常發(fā)生在胞嘧啶的C5位，形成5-甲基胞嘧啶(SmC)，甲基化的胞嘧啶多位于CpG島上。CpG島是CpG二聯(lián)核苷富集區(qū)域，CG含量大于50％，長(zhǎng)約

6、200—500 bp。哺乳動(dòng)物DNA甲基化的模式只有5mC這一形式，真核生物中大約2％一7％的胞嘧啶被甲基化修飾。</p><p>　　早期的基因組DNA甲基化分析技術(shù)，如SssI甲基轉(zhuǎn)移酶分析法、氯乙醛反應(yīng)法、免疫學(xué)抗體技術(shù)等，已不能滿足現(xiàn)代表觀遺傳學(xué)研究的需求。近年來(lái)常用的基因組甲基化分析方法有兩種：甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorp

7、hism，MSAP)技術(shù)和高效液相層析(high performance liquid chromatography，HPLC)。</p><p>　　位點(diǎn)特異性DNA片段甲基化檢測(cè)方法有：限制酶PCR、甲基化特異性PCR（MSP）、甲基化敏感的單核苷酸引物延伸(MS-SNuPE)、結(jié)合亞硫酸鹽限制性分析法(COBRA)、DHPLC、Methylight、微陣列法。</p><p>　　本

8、次實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用MSAP技術(shù)對(duì)文蛤四種殼色的DNA甲基化分析，檢測(cè)它們的甲基化多態(tài)性，分析它們的甲基化模式，了解文蛤的甲基化水平，從而為建立文蛤不同殼色鑒別的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。</p><p>　　2.MSAP 技術(shù)的原理及其方法</p><p>　　MSAP是在AFLP技術(shù)的基礎(chǔ)上，用識(shí)別5-CCGG序列的限制性內(nèi)切酶HpaII和MspI代替AnP技術(shù)中識(shí)別4堿基的內(nèi)切酶MseI建立起來(lái)的新

9、技術(shù)。該技術(shù)由Reyna-Lopez 等于1997 年首次報(bào)道，并被用于檢測(cè)二形真菌的DNA 甲基化，之后被用于檢測(cè)水稻基因組胞嘧啶甲基化，目前該技術(shù)已在油棕、柑橘、高粱、棉花、擬南芥、香蕉、玉米等植物上得到成功應(yīng)用。</p><p>　　2.1 MSAP技術(shù)的原理</p><p>　　采用HpaII和MspI，分別與識(shí)別6堿基的EcoRI配對(duì)組合對(duì)基因組進(jìn)行酶切，然后再加上相應(yīng)的限制性內(nèi)

10、切酶的接頭，利用接頭序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)5-CGG位點(diǎn)甲基化進(jìn)行特異性擴(kuò)增。盡管HpaII和Msp I都能識(shí)別相同的位點(diǎn)，但兩者對(duì)DNA甲基化敏感程度存在很大的不同。根據(jù)Hpa II和Msp I對(duì)基因組DNA甲基化敏感性不同，相同序列可以擴(kuò)增出不同的譜帶，可以檢測(cè)出其總甲基化水平以及有效區(qū)分出基因組DNA的全甲基化(雙鏈甲基化)和半甲基化(單鏈甲基化)等甲基化狀態(tài)。</p><p>　　2.2 MSAP 分析的技術(shù)流

11、程</p><p>　　MSAP 技術(shù)與AFL P 技術(shù)類似，其主要包括DNA 的提取、純化、雙酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測(cè)、記帶和數(shù)據(jù)整理等步驟。</p><p>　　2.2.1高質(zhì)量DNA 制備</p><p>　　DNA 提取可以采用CTAB 法或SDS 法大量制備，再采用苯酚-氯仿抽提法純化，然后檢測(cè)DNA 質(zhì)量與濃度，取部分

12、原液稀釋備用。</p><p>　　2.2.2酶切與接頭連接</p><p>　　分別用酶組合EcoRI/HpaII 和EcoRI/MspI 消化DNA 稀釋液，酶切反應(yīng)在37℃水浴中進(jìn)行，一般為了保證消化徹底，需酶切6 小時(shí)或過(guò)夜。然后90℃水浴10 分鐘讓限制酶失活，再加入接頭和連接酶反應(yīng)3 小時(shí)。由于HpaII 和MspI 對(duì)CCGG 位點(diǎn)的不同甲基化模式敏感性不同，所以經(jīng)雙酶切后將

13、得到不同的酶切片段。</p><p>　　2.2.3PCR 擴(kuò)增</p><p>　　PCR擴(kuò)增分兩步進(jìn)行，首先以DNA酶切片段為模板，以選擇性單鏈寡核苷酸作為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增的目的在于減少選擇性堿基的錯(cuò)配，為選擇性擴(kuò)增提供更多的模板，同時(shí)起著純化模板的作用。預(yù)擴(kuò)增完成后，將預(yù)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物稀釋后，以此為模板進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增與預(yù)擴(kuò)增的主要區(qū)別在于PCR程序中選擇復(fù)性溫

14、度的不同，一般選擇PCR起始復(fù)性溫度在65 ℃。比預(yù)擴(kuò)增程序復(fù)性溫度高10℃左右。以后復(fù)性溫度每個(gè)循環(huán)下降0．7℃，一直下降至復(fù)性效果最佳溫度，完成其余的PCR循環(huán)。</p><p>　　2.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳及統(tǒng)計(jì)分析</p><p>　　選擇性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物需要經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染后進(jìn)行譜帶的觀察與統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)EcoRI∕HpaII和EcoRI∕Msp I泳道的帶紋進(jìn)

15、行統(tǒng)計(jì)分析，每一條帶代表一個(gè)酶切識(shí)別位點(diǎn)，根據(jù)條帶的有無(wú)記作1∕0。EcoR I∕Hpa II和EcoRI∕MspI擴(kuò)增產(chǎn)物中共有條帶，說(shuō)明該位點(diǎn)未發(fā)生甲基化。如果在EcoRI∕Hpa II酶切擴(kuò)增產(chǎn)物中有帶，而在EcoRI∕Msp I酶切擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有出現(xiàn)帶，則說(shuō)明該位點(diǎn)發(fā)生了單鏈外側(cè)的胞嘧啶甲基化，即半甲基化。如果EcoRI∕HpaI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物中無(wú)帶，而在EcoRI∕Msp I酶切擴(kuò)增產(chǎn)物中有帶，則說(shuō)明該位點(diǎn)發(fā)生了雙鏈位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)胞

16、嘧啶甲基化，即全甲基化，從而有效區(qū)分基因組DNA甲基化狀態(tài)。</p><p>　　3.MSAP 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與不足</p><p>　　MSAP 是一種改良的AFLP 方法，是一種AFLP與DNA 甲基化相結(jié)合的標(biāo)記，是甲基化敏感限制酶印跡法和AFLP 的集成，它既克服了SouthernBlot 雜交技術(shù)復(fù)雜的缺點(diǎn)，同時(shí)又兼有AFLP 的優(yōu)點(diǎn)。</p><p>　?。?/p>

17、一）它能夠有效檢測(cè)出樣品DNA 中大量的甲基化位點(diǎn)，具有多態(tài)性高、敏感性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。</p><p>　　（二）引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，無(wú)需事先知道所分析DNA 的序列信息，沒(méi)有種屬特異性，可用于DNA 序列背景知識(shí)未知的生物。</p><p>　　（三）可在全基因組范圍對(duì)胞嘧啶甲基化程度進(jìn)行分析又能檢測(cè)DNA 片段特異性位點(diǎn)甲基化狀態(tài)。</p><p>　　MSAP

18、法優(yōu)點(diǎn)突出，技術(shù)簡(jiǎn)單、成本低、效率高，而且結(jié)果與基因序列直接聯(lián)系起來(lái)，為研究基因表達(dá)與DNA 甲基化的關(guān)系提供了一個(gè)十分有效的方法。但也存在不足。</p><p>　?。ㄒ唬?，經(jīng)酶切連接頭后可以出現(xiàn)3 類條帶，一類是兩端都是接頭M/H；另一類是一端是接頭M/H，一端是接頭E；第3 類是兩端都是接頭E。前兩類片段的產(chǎn)生都與CCGG 位點(diǎn)有關(guān)，是檢測(cè)的目標(biāo)片段，而第三類則與CCGG 位點(diǎn)無(wú)關(guān)，屬冗余條帶。但由于Eco

19、RI 屬于稀切酶，所以這類帶出現(xiàn)頻率較低。</p><p>　　（二）MSAP 法只能檢測(cè)全基因組范圍內(nèi)的CCGG 位點(diǎn)的甲基化變化，對(duì)其他位點(diǎn)的甲基化不能檢出，如其他的CG 對(duì)稱位點(diǎn)，以及CNG 位點(diǎn)等。</p><p>　　針對(duì)以上不足，可以對(duì)MSAP 技術(shù)加以改進(jìn)，如多選擇幾組對(duì)甲基化敏感性有差異的同裂酶，可以增加檢測(cè)位點(diǎn)的多樣性，進(jìn)一步提高M(jìn)SAP 檢測(cè)信息量，盡量全面反映全基因組

20、范圍內(nèi)胞嘧啶C-5 位甲基化狀態(tài)。</p><p>　　4.MSAP技術(shù)的相關(guān)研究</p><p>　　MSAP是在AFLP基礎(chǔ)上建立的，因此不僅具有AFLP的特點(diǎn)，還能檢測(cè)DNA甲基化差異，可以作為一種分子標(biāo)記，進(jìn)行資源鑒定。</p><p>　　洪柳等對(duì)24 個(gè)臍橙品種之間進(jìn)行MSAP 分析，發(fā)現(xiàn)在臍橙品種中DNA 甲基化的發(fā)生頻率很高。臍橙品種芽變頻率高，可能

21、與DNA 甲基化的頻繁發(fā)生密切相關(guān)。在所用的18 對(duì)MSAP 引物中，有10 對(duì)引物可鑒別出12 個(gè)臍橙品種，說(shuō)明MSAP 是檢測(cè)臍橙品種之間多態(tài)性的有效方法。Noyer J L等應(yīng)用SSR、AFLP、MSAP 等技術(shù)對(duì)30 個(gè)香蕉品種的遺傳分析研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用MSAP 分析可以檢測(cè)出極高的多態(tài)性片段，并根據(jù)品種之間的DNA 甲基化模式的不同有效區(qū)分出30 個(gè)品種之間的差異，表明MSAP 技術(shù)可以比SSR、ISSR、AFLP 等技術(shù)更多

22、檢測(cè)出基因組中的多態(tài)性位點(diǎn)，在種質(zhì)資源鑒定方面顯示出更高的優(yōu)越性。張勇等利用MSAP 技術(shù)分析了外源種質(zhì)導(dǎo)入引發(fā)了小麥表觀遺傳變異，通過(guò)染色體工程將外源種質(zhì)向小麥基因組轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，可以誘發(fā)受體物種基因組結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)的廣泛遺傳變異。MSAP 技術(shù)分析結(jié)果表明，易位系材料發(fā)生全甲基化修飾的比例比小麥親本明顯上升，而半甲基化比例則明顯下降。</p><p>　　蔣曹德等，應(yīng)用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)技術(shù)(MSAP)，對(duì)豬

23、個(gè)體DNA甲基化百分差異與胴體性狀的關(guān)系進(jìn)行了研究。從個(gè)體全部甲基化百分差異、個(gè)體中性甲基化百分差異和個(gè)體特殊甲基化百分差異3個(gè)層次分析了其對(duì)胴體性狀的影響。</p><p>　　于濤等運(yùn)用MSAP技術(shù)對(duì)櫛孔扇貝、蝦夷扇貝及其雜交子一代、子二代基因組DNA胞嘧啶甲基化水平進(jìn)行了研究，并分析了DNA甲基化與各性狀的相關(guān)性及其與雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系。慶磊等利用MSAP技術(shù)研究了二倍體、異源三倍體扇貝甲基化率的變化。<

24、/p><p>　　目前發(fā)現(xiàn)海洋貝類的種類很多，但目前僅在極少部分海洋貝類中有MSAP標(biāo)記的報(bào)道，而在文蛤這種重要的灘涂貝類中還未見(jiàn)有任何報(bào)道。</p><p><b>　　小結(jié)</b></p><p>　　甲基化作為植物DNA 修飾的重要途徑，參與了許多生命過(guò)程，在調(diào)控基因表達(dá)、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育、防御微生物入侵、耐受逆境脅迫等方面起著重要作用，通過(guò)研究

25、基因組DNA 甲基化模式變化，可以深入研究以上過(guò)程的調(diào)節(jié)機(jī)制。MSAP 技術(shù)自建立以來(lái)，在以上各方面均得到了不同程度應(yīng)用，若與其它分子生物學(xué)方法如DNA 分子遺傳標(biāo)記、DNA 重組技術(shù)、DNA 微陣列等方法結(jié)合起來(lái)進(jìn)行綜合研究，將為在分子水平上揭示調(diào)控基因時(shí)空特異表達(dá)機(jī)理建立起有力的技術(shù)平臺(tái)，在雜種優(yōu)勢(shì)原理、研究功能基因、改良植物性狀、提高植物適應(yīng)性等方面發(fā)揮重要作用。</p><p>　　MSAP分子標(biāo)記技術(shù)在

26、植物雜種優(yōu)勢(shì)、轉(zhuǎn)基因沉默、植物組織培養(yǎng)及體細(xì)胞無(wú)性系變異等方面取得可喜的進(jìn)展。</p><p>　　這種新技術(shù)目前還沒(méi)有用于文蛤的報(bào)道，由它的優(yōu)越性可以預(yù)見(jiàn)，這種技術(shù)在文蛤資源種質(zhì)資源鑒定、基因表達(dá)調(diào)控、雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)與利用、轉(zhuǎn)基因沉默、種群DNA甲基化和環(huán)境適應(yīng)等方面將具有廣闊的應(yīng)用前景。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p

27、>　　[1] 張燕，陳波. DNA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)及其在作物遺傳研究中的應(yīng)用[J]. 西昌學(xué)院學(xué)報(bào),2009,23(4):7-10.</p><p>　　[2] 肖正中，鄔蘇曉. DNA甲基化分析方法[J]. 生命的化學(xué)，2008，28（4），489-491.</p><p>　　[3] 吳春太，李維國(guó)，高新生，張曉飛. MSAP技術(shù)及其在橡膠樹(shù)遺傳育種研究中的應(yīng)用前景[J

28、].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)2009，37(11)：9-14.</p><p>　　[4] 張敏，權(quán)力，張?chǎng)? DNA甲基化水平定量分析方法研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際遺傳學(xué)雜志,2010，33（1），28-31</p><p>　　[5] 肖正中，鄔蘇曉, DNA甲基化分析方法[ J ]. 生命的化學(xué)，2008，28(4)，489-491.</p><p>　　[6] 洪柳，鄧秀新

29、.應(yīng)用MSAP技術(shù)對(duì)臍橙品種進(jìn)行DNA 甲基化分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005,38(11):2301-2307.</p><p>　　[7] Noyer J L，Causs S，Tomekpe K，et a1．A new image of plantain diversity assessed by SSR,AFLP and MSAP markers[J].Genetica,2005,124(1)；61-6

30、9.</p><p>　　[8] 張勇，劉朝輝，劉成，等. 外源種質(zhì)導(dǎo)入引發(fā)小麥表觀遺傳變異的MSAP 分析[J]. 科學(xué)通報(bào)，2007，52( 24) : 2857-2865.</p><p>　　[9] 孟慶磊. 扇貝異源多倍體與四倍體培育技術(shù)研究[D].中國(guó)海洋大學(xué)，2009</p><p>　　[10] 于濤，楊愛(ài)國(guó)，吳彪，周麗青. 櫛孔扇貝%蝦夷扇貝及其雜

31、交子代的MSAP分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2010，34（9）:1335-1341.</p><p>　　[11] 蔣曹德，鄧昌彥，熊遠(yuǎn)著. 豬個(gè)體DNA甲基化百分差異與胴體性狀的關(guān)系[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13（2）：179-185</p><p>　　[12] 王子成，李忠愛(ài)，李鎖平. MSAP技術(shù)及其在植物上的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2006,195-196.<