西瓜核雄性不育兩用系育性基因的AFLP分子標記研究.pdf

1、西瓜(Citrullus lanatus Mansfeld；Watermelon)雜種優(yōu)勢明顯，目前我國西瓜生產(chǎn)均使用雜交種。利用雄性不育系進行西瓜雜交種生產(chǎn)，可以大大節(jié)省人力物力，有效降低成本。研究西瓜核雄性不育的分子機理，獲得相關分子標記和基因片段，能夠為不育株早期鑒別和培育優(yōu)良不育系提供理論和實踐基礎。AFLP（擴增片段長度多態(tài)性）是一種高效、快捷、穩(wěn)定、可靠的DNA分子標記技術(shù)，在分子標記輔助育種上得到廣泛應用。本試驗旨在構(gòu)建適

2、合于西瓜的AFLP分子標記反應體系，并利用AFLP分子標記對G17AB雄性不育兩用系進行研究以期獲得與育性基因緊密連鎖的分子標記，為不育株早期鑒別提供快速簡便的方法，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.確定了適于AFLP分析的西瓜基因組DNA的提取方法（改良CTAB法），其提取液成分為：100mmol/L Tris-HCl（pH8.0）,20mmol/L EDTA（pH8.0），1.4mol/L NaCl,2％ CTAB，1％ PVP

3、40和0.2％ β-巰基乙醇(用前加)。粗提后的DNA用Rnase酶去除RNA，氯仿/異戊醇抽提兩次，無水乙醇沉淀，得到了RNA去除徹底、純度高、分子量大、質(zhì)量好的西瓜基因組DNA。
　　 2.建立了適于西瓜分析的AFLP銀染技術(shù)體系：在20μl酶切體系中，包括基因組DNA 500ng，EcoR I和Mse I的用量各為3U，Tango Buffer 2μl，酶切時間以37℃下酶切4小時、65℃15分鐘為最佳；加入接頭后,37℃

4、連接l0h以上(或過夜)；連接產(chǎn)物稀釋5倍后進行預擴增，預擴體系總體積為20μl，其中連接產(chǎn)物5.0μl、含Mg2+的10×Buffer 2.0μl、dNTP（2.5mM）1.6μl、Moo(50ng/μl)和 Eoo(50ng/μl)各0.6μl、Taq聚合酶(5U/μl)0.2μl；預擴增產(chǎn)物稀釋5倍后再進行選擇性擴增，選擇性擴增體系亦為20μl，其中預擴產(chǎn)物5.0μl、含Mg2+的10×Buffer 2.0μl、dNTP（2.5m

5、M）1.8μl、Moo(50ng/μl)和 Eoo(50ng/μl)各0.8μl、Taq聚合酶(5U/μl)0.2μl；選擴完成后,在20μl體系中加10μl Loading buffer，95℃變性10min，立即冰上冷卻；在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析,強堿銀染法檢測PCR產(chǎn)物。
　　 3.在對16個EcoR I引物和16個Mse I引物共256對選擇引物組合的篩選中，有238對引物可以擴增出穩(wěn)定清晰條帶，表現(xiàn)出很高