太空誘變玉米雄性不育材料株高差異及SCAR標(biāo)記擴(kuò)增片段分析.pdf

1、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所于1996年利用返回式實(shí)驗(yàn)衛(wèi)星搭載玉米品種川單9號(hào)種子，在太空誘變處理后代獲得一份雄性不育突變材料。本課題組在對(duì)太空誘變玉米雄性不育突變體的長期研究中發(fā)現(xiàn)：該不育材料育性表現(xiàn)穩(wěn)定、花粉敗育徹底，是由一對(duì)隱性基因控制的雄性核不育突變體。前人通過對(duì)不育株和可育株進(jìn)行DNA-AFLP分析，得到了一些差異片段，對(duì)這些差異片段進(jìn)行回收克隆和測(cè)序，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一條差異片段可能與雄配子發(fā)育有更大的相關(guān)性。基于該片段序列設(shè)計(jì)特

2、異引物轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不育株與可育株之間不存在擴(kuò)增片段的長度多態(tài)性，但對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收測(cè)序，則發(fā)現(xiàn)不育株與可育株之間存在多個(gè)單堿基差異。同時(shí)，在對(duì)該不育材料的長期觀察中發(fā)現(xiàn)，不育株往往伴隨有植株高度的明顯降低。因此本實(shí)驗(yàn)擬從以下兩方面開展工作：
　　 首先，利用DNA-AFLP差異片段轉(zhuǎn)化而來的SCAR引物，以不育株姊妹交后代的育性分離群體為材料，隨機(jī)選取不育株和可育株各5株，分別提取其基因組DNA，

3、然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收，通過直接測(cè)序法和克隆測(cè)序法分別獲得目標(biāo)片段序列信息，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，為深入了解太空誘變玉米細(xì)胞核雄性不育的分子機(jī)理打基礎(chǔ)。其次，以太空誘變玉米核不育姊妹交后代育性分離群體為材料，對(duì)不育株和可育株的株高、雄穗穗莖長度、節(jié)間數(shù)等性狀進(jìn)行調(diào)查分析，尋找引起不育株與可育株株高差異的原因。
　　 實(shí)驗(yàn)所得主要結(jié)果如下：
　　 1.隨機(jī)選取育性分離群體不育單株和可育單株各5株提取葉片DNA

4、，使用SCAR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果為不同育性材料間擴(kuò)增結(jié)果未顯示出擴(kuò)增片段的長度多態(tài)性。將擴(kuò)增片段回收測(cè)序。為排除誤差、保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別利用克隆測(cè)序和直接測(cè)序兩種方法進(jìn)行序列測(cè)定?？寺y(cè)序送出不育株和可育株各5個(gè)單株分別3個(gè)克隆，不育株和可育株分別獲得有效序列13條和14條；直接測(cè)序送出不育株和可育株各5個(gè)單株分別2個(gè)PCR產(chǎn)物，不育株和可育株各獲得有效序列10條。
　　 2.對(duì)獲得的序列信息進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，克隆

5、測(cè)序獲得的同一單株的3個(gè)克隆的序列之間、同育性的14（或13）條序列之間均存在單堿基差異。直接測(cè)序獲得的同一單株的2個(gè)PCR產(chǎn)物的序列之間、同育性的10條序列之間均存在單堿基差異。在直接測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)的單堿基差異數(shù)量較在克隆測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)的少。按照在相同育性間，堿基出現(xiàn)頻率高者為更真實(shí)的堿基的原則，分別將獲得的序列進(jìn)行整理，獲得整理后的克隆測(cè)序可育序列1條，不育序列1條，直接測(cè)序可育序列1條，不育序列1條。將整理后的序列進(jìn)行不同育性間的

6、比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)不育與可育序列之間仍然存在單堿基的差異，經(jīng)克隆測(cè)序獲得的不育與可育序列的單堿基差異為11個(gè)，經(jīng)直接測(cè)序獲得的不育與可育序列的單堿基差異為3個(gè)。其中有2個(gè)單堿基的差異在兩種測(cè)序方式中是一致的。利用能有效地去除掉DNA序列中包含的內(nèi)含子的FGENESH程序，對(duì)整理得到的4條DNA序列進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測(cè)，獲得了4條氨基酸序列。
　　 3.將整理后的DNA序列分別在NCBI上進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)均與克隆AF466646.1

7、有較高同源性。目標(biāo)序列在該克隆AF466646.1的一個(gè)編碼區(qū)內(nèi)，這一個(gè)編碼區(qū)編碼為Z195D10.19基因。Z195D10.19基因被推測(cè)為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。將氨基酸序列分別在NCBI中進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)片段與位于玉米品種B73第五染色體上的蛋白prpol（GB:AAL76007.1）同源性最高。蛋白質(zhì)prpol是由克隆AF466646.1翻譯的。由此推測(cè)目標(biāo)片段可能與反轉(zhuǎn)錄功能有關(guān)。
　　 4.查找整理后的DNA序列內(nèi)的限

8、制性酶切位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在克隆測(cè)序的可育序列與不育序列之間有2處單堿基差異引起了3個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的改變，直接測(cè)序的可育序列與不育序列間有1處單堿基差異引起了1個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的改變。引物與酶組合起來，有可能成為檢測(cè)不育DNA與可育DNA多態(tài)性的CAPS標(biāo)記。
　　 5.經(jīng)過在四川、云南兩地對(duì)該突變體姊妹交后代育性分離群體的性狀調(diào)查、差異顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：該突變體后代育性分離材料中，不育株的株高顯著矮于可育株；不育株的雄穗長