多孔雙相鈣磷陶瓷在脊柱后路融合中成骨作用和降解特性的組織學(xué)觀察

1、<p>　　多孔雙相鈣磷陶瓷在脊柱后路融合中成骨作用和降解特性的組織學(xué)觀察</p><p>　　作者：謝幼專，朱振安，張蒲，湯亭亭，盧建熙，戴尅戎</p><p>　　【摘要】 ［目的］了解多孔雙相鈣磷陶瓷在人體脊柱后路融合中的成骨變化及降解過(guò)程。［方法］對(duì)20例脊柱后路融合的雙相鈣磷陶瓷活檢標(biāo)本行不脫鈣硬組織切片檢查。觀察陶瓷周圍和內(nèi)部的新生組織、陶瓷的形態(tài)改變、降解顆粒及伴

2、隨的細(xì)胞吞噬反應(yīng)。其中14例標(biāo)本行組織形態(tài)計(jì)量，根據(jù)患者的年齡、植入時(shí)間及臨床結(jié)果分組比較成骨及材料降解的速度。［結(jié)果］所有的雙相鈣磷陶瓷標(biāo)本均可見新生骨組織，與自體骨接觸越多，陶瓷內(nèi)的新生骨組織越多。絕大部分陶瓷內(nèi)可見降解顆粒，部分顆粒位于巨噬細(xì)胞內(nèi)。不同標(biāo)本的新生骨和材料降解速度差異較大。陶瓷內(nèi)的新生骨隨植入時(shí)間的增加而增多，但隨患者年齡的增大而減少。陶瓷的降解率隨患者年齡的增大而減少，但不受植入時(shí)間的影響。后路融合成功組的活檢標(biāo)本

3、的新生骨量高于融合失敗組，但材料降解率則反之。［結(jié)論］多孔雙相鈣磷陶瓷是一種骨傳導(dǎo)材料，但植入體內(nèi)降解緩慢，不能被新生骨組織完全替代。植入時(shí)必須將陶瓷與自體骨充分混合以獲得良好的骨長(zhǎng)入。陶瓷產(chǎn)生的降解顆粒及誘發(fā)的細(xì)胞吞噬反應(yīng)必須引起注意。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 脊柱后路融合； 雙相鈣磷陶瓷； 骨形成； 生物降解</p><p>　　Abstract：［Objective］To

4、 reveal the osteogenesis, the biodegradation and tissue reactions of the porous biphasic calcium phosphate ceramic (PBC) in human spine.［Method］The histological study was carried out on 20 PBC samples retrieved from post

5、erior spinal fusion. All the PBC samples were treated by undecalcified histological preparation. The tissue in or around the material, the change of ceramic shape,the particles and the presence of macrophages were observ

6、ed. The quantitative study was perform</p><p>　　Key words：posterial spinal fusion; calcium phosphate ceramic; osteogenesis; biodegradation</p><p>　　退行性椎間盤病變、脊柱不穩(wěn)和脊柱側(cè)彎等疾病的手術(shù)治療常需進(jìn)行脊柱后路融合。自體骨移植是

7、促進(jìn)融合的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但自體骨供區(qū)并發(fā)癥的發(fā)生率可高達(dá)24%。此外，自體骨的取骨量有限，不能滿足日益增加的翻修手術(shù)需求。盡管融合時(shí)也可采用同種異體骨，但免疫排斥反應(yīng)及潛在傳播傳染性疾病的可能又使其應(yīng)用受到一定的限制。近年來(lái)，人工合成的多孔雙相鈣磷陶瓷日益受到重視并應(yīng)用于臨床,且在動(dòng)物［1］和人體［2］的脊柱后路融合中取得了良好的效果。然而，大多數(shù)臨床研究主要以影像學(xué)改變和臨床癥狀、體征的改善為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，組織學(xué)活檢觀察甚少。大多數(shù)組織學(xué)觀

8、察來(lái)源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，但由于物種的差異，低等脊椎動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能完全代表人體的生物學(xué)改變。由于組織學(xué)觀察能最直觀地了解這些材料在人體內(nèi)的生物學(xué)變化，因此，本研究對(duì)20例脊柱后路融合手術(shù)的多孔雙相鈣磷陶瓷活檢標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)觀察，以較真實(shí)地了解其在人體的生物學(xué)改變。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 病

9、例資料</b></p><p>　　1993～2002年法國(guó)Calot醫(yī)院共收集20例多孔雙相鈣磷陶瓷活檢標(biāo)本，均取自脊柱后路融合的患者。其中男2例，女18例；年齡11～70歲（平均45.2歲）。原發(fā)性診斷包括先天性脊柱側(cè)凸畸形（1例），特發(fā)性脊柱側(cè)凸畸形（11例），退變性脊柱側(cè)凸畸形（7例），腰椎不穩(wěn)（1例）。最大融合范圍從T1至骶骨。每例融合手術(shù)均使用內(nèi)固定器械固定，雙相鈣磷陶瓷和自體骨混合植骨。

10、活檢時(shí)間為術(shù)后2～56個(gè)月（平均24個(gè)月）。所有活檢均在患者行第２次脊柱后路手術(shù)時(shí)進(jìn)行?；颊呓邮埽泊问中g(shù)的原因包括內(nèi)固定器械拆除（6例）、融合失敗（8例）、融合區(qū)臨近節(jié)段椎間盤突出（3例）、腰椎不穩(wěn)（2例）、重置內(nèi)固定（1例）。活檢標(biāo)本來(lái)源于腰段（15例）、胸腰段（1例）、胸段（1例），有3例標(biāo)本取自的節(jié)段未詳細(xì)記載。</p><p><b>　　1.2 植入材料</b></p>

11、;<p>　　本組患者中，17例應(yīng)用條狀雙相鈣磷陶瓷（5 mm×5 mm×20 mm），3例應(yīng)用顆粒狀陶瓷（直徑1～3 mm）。該陶瓷由磷酸三鈣（40%）和羥基磷灰石（60%）組成，孔徑為300～600 μm，孔隙率約為50%±10%。脊柱后路融合采用混合植骨，即雙相鈣磷陶瓷與局部去皮質(zhì)骨粒（16例）或自體髂骨（2例）混合移植。2例自體骨來(lái)源記載不明。</p><p>

12、　　1.3 組織形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)量</p><p>　　所有標(biāo)本在取材后立即用10%中性福爾馬林濃液固定，14 d后用梯度乙醇濃液脫水，甲苯透明后用甲基丙烯酸甲酯包埋。應(yīng)用Leica鋸式切片機(jī)切片，切片初始厚度約為200 μm，研磨至約50 μm厚，拋光后用苦味酸-品紅溶液染色。</p><p>　　每個(gè)標(biāo)本觀察2張連續(xù)切片。觀察指標(biāo)有：雙相鈣磷陶瓷周圍和內(nèi)部的新生組織；陶瓷形態(tài)的改變；顆

13、粒及伴隨的細(xì)胞反應(yīng)。本組標(biāo)本中，6例因體積過(guò)小，無(wú)法進(jìn)行定量研究，僅進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；其余14例標(biāo)本較大，且均為條狀陶瓷，進(jìn)行組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量。測(cè)量的指標(biāo)主要有：</p><p>　　(1)新骨形成率（VPB）=陶瓷內(nèi)部形成的新骨面積/陶瓷孔的總面積；</p><p>　　(2)材料殘余率（VRM）=殘存的陶瓷面積/植入陶瓷的總面積；</p><p>　　(3)新骨

14、占孔率（NbB）=形成新骨的孔數(shù)/總的孔數(shù)；</p><p>　　(4)材料周邊的骨接觸率（PIB）=與骨接觸的材料周長(zhǎng)/材料的總周長(zhǎng)。</p><p>　　1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理</p><p>　　所有結(jié)果用均數(shù)表示。植入時(shí)間與新骨形成率（VPB）、新骨占孔率（NbB）之間的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)分析，同法分析材料周邊的骨接觸率（PIB）和新骨形成率（VP

15、B）、新骨占孔率（NbB）之間的關(guān)系。</p><p><b>　　2 結(jié) 果</b></p><p>　　所有的雙相陶瓷標(biāo)本均可見新骨形成，但不同病例的新骨形成率差異較大。11例陶瓷標(biāo)本內(nèi)可見大量的新骨形成(圖1a)，9例標(biāo)本僅在陶瓷周圍的孔內(nèi)形成新骨(圖1b)。與自體骨緊密接觸的陶瓷中形成的新骨較多。僅形成少量或未形成新骨的陶瓷孔內(nèi)可見纖維組織形成。從整體上看

16、，雙相鈣磷陶瓷的骨架結(jié)構(gòu)變化不大，孔連接徑大小很不均一。陶瓷周圍和內(nèi)部可見降解顆粒，其中19例標(biāo)本觀察到數(shù)量不等的材料降解顆粒，顆粒周圍可伴隨活躍的多核巨細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)可見吞噬的降解顆粒(圖2a，2b)。一些降解顆粒和吞噬細(xì)胞位于材料的表面，但在形成新骨的陶瓷表面，未見降解顆粒。</p><p>　　14個(gè)標(biāo)本行組織形態(tài)學(xué)計(jì)量測(cè)量，植入時(shí)間為2～43個(gè)月，新生骨組織為33%（VPB）或38%（NbB）。陶瓷周邊的骨

17、接觸率為19%。材料殘余率為52%，與植入前變化不大。</p><p>　　根據(jù)患者年齡將14例陶瓷標(biāo)本分為3組：少年組（&lt;20歲）3例；青中年組（20～50歲）6例；老年組（&gt;50歲）5例。結(jié)果表明材料的殘余率隨年齡增大而增多，新生骨隨年齡組增大而減少。新骨形成率最大的病例出現(xiàn)在少年組內(nèi)，達(dá)81.8%(圖3)；新骨形成率最小的病例出現(xiàn)在青中年組內(nèi)，僅0.6%。</p>

18、<p>　　根據(jù)陶瓷植入體內(nèi)的時(shí)間分3組：1年內(nèi)3例，1～2年5例，2年以上6例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)材料內(nèi)新生的骨組織隨植入時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，材料殘余率隨植入時(shí)間變化不大。</p><p>　　根據(jù)最終是否融合成功分為2組：融合成功組9例，融合失敗組5例。結(jié)果顯示融合成功組新骨形成率（VPM，37%；NbM, 41%）明顯大于融合失敗組（VPM，24%；NbM, 33%）。材料的殘余率則融合成功組（51%）低于融

19、合失敗組（53%），即融合成功組的材料降解較快。</p><p>　　相關(guān)分析研究發(fā)現(xiàn)植入時(shí)間與新骨形成率VPB（r=0.05, P=0.86）、新骨占孔率NbB(r=0.14, P=0.62)無(wú)顯著相關(guān)，但材料周邊的骨接觸率PIB與新骨形成率VPB（r=0.84, P&lt;0.01）、新骨占孔率NbB(r=0.81, P&lt;0.01)呈顯著相關(guān)。</p><p>&

20、lt;b>　　3 討 論</b></p><p>　　應(yīng)用多孔雙相鈣磷陶瓷促進(jìn)脊柱后路融合已取得較好的臨床效果。雙相鈣磷陶瓷由磷酸三鈣和羥基磷灰石組成，具有與骨基質(zhì)相同的化學(xué)成份，多孔結(jié)構(gòu)有助于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移行、貼附、增殖和分化為成骨細(xì)胞，可作為骨傳導(dǎo)性支架促進(jìn)骨長(zhǎng)入，因此本研究中的所有陶瓷均形成不同數(shù)量的新骨。但不同病例的新生骨量的差異較大，這是由于脊柱的融合過(guò)程還受到如患者年齡、植入材

21、料、植入部位的機(jī)械環(huán)境及植骨床的準(zhǔn)備情況等因素的影響。</p><p>　　圖1a 雙相陶瓷的周圍孔及中心孔均可見新骨形成，陶瓷周圍與自體骨(星號(hào))緊密接觸。（苦味酸－品紅染色，×3.125） 圖1b 雙相陶瓷的周圍孔形成少量類骨質(zhì)（箭頭）和礦化骨（星號(hào)），中心孔見纖維組織形成，無(wú)新骨。注意陶瓷周圍無(wú)自體骨。（苦味酸－品紅染色，×3.125） 圖2a 雙相陶瓷的孔內(nèi)可見新骨形成，周圍

22、有大量的降解顆粒。（苦味酸－品紅染色，×50） 圖2b 高倍視野下可見陶瓷降解顆粒位于多核巨細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外。（苦味酸－品紅染色，×100） 圖3 來(lái)源于19歲患者的雙相鈣磷陶瓷標(biāo)本，可見大量新骨（類骨質(zhì)：黃綠色；礦化骨：紅色）形成，陶瓷表面覆蓋新生骨，未見降解顆粒。（苦味酸－品紅染色,×25）</p><p>　　從材料結(jié)構(gòu)上分析，雙相鈣磷陶瓷的孔與孔連接的不均一可引起本研究

23、中不同病例間新生骨量的差異。研究表明孔徑為300 ～600 μm的陶瓷適于骨組織長(zhǎng)入［3］，孔連接徑為30 μm的陶瓷比60 μm的陶瓷形成的纖維組織多，孔連接徑大于50 μm能確保礦化骨的形成［3］。本組材料具有良好的孔徑（300～600 μm），但孔連接徑大小很不不均一，而導(dǎo)致新生骨量的差異。此外，羥基磷灰石在體內(nèi)難以降解，而磷酸三鈣植入體內(nèi)４周后就開始降解，因此，當(dāng)雙相鈣磷陶瓷的磷酸三鈣成分開始降解后，羥基磷灰石仍未降解，材料的大

24、體骨架仍然存在，材料的孔與孔連接也不會(huì)發(fā)生顯著改變。本組鈣磷陶瓷植入后殘余材料的孔隙率與植入前變化不大，表明材料本身的結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯的改變或材料未降解。有些陶瓷植入體內(nèi)長(zhǎng)達(dá)4年余，但仍未能降解消失或轉(zhuǎn)化成骨組織，因此，雙相鈣磷陶瓷僅是一種骨傳導(dǎo)性支架，而非骨替代物，雙相鈣磷陶瓷不會(huì)被新骨完全替代［4］。近年研究表明引入干細(xì)胞或誘導(dǎo)因子能促進(jìn)其成骨［5］。</p><p>　　本研究發(fā)現(xiàn)陶瓷內(nèi)新生骨量隨年齡增加而減

25、少，隨植入時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；一少年患者植入雙相鈣磷陶瓷38個(gè)月后，陶瓷活檢標(biāo)本顯示其新生骨量最大，達(dá)81.8%。這一結(jié)果表明雙相陶瓷的成骨量受患者的年齡和植入時(shí)間的影響：青少年的成骨活動(dòng)較活躍，新生骨量也較大。此外，陶瓷內(nèi)成骨量還與融合技術(shù)有關(guān)。近年研究表明雙相陶瓷必須與自體骨（如局部去皮質(zhì)骨粒）混合植入，與自體骨緊密接觸的陶瓷的新生骨明顯增多［1］。本研究發(fā)現(xiàn)未接觸自體骨的雙相鈣磷陶瓷成骨量較低(0.6%～22%)，相關(guān)分析表明植入鈣

26、磷陶瓷與自體骨接觸越緊密、越多，陶瓷內(nèi)部形成的新骨越多，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，這是因?yàn)橹补谴?、植骨塊或去皮質(zhì)骨粒在新骨長(zhǎng)入的過(guò)程中起重要的作用。去皮質(zhì)良好的植骨床及局部骨片能提供含骨髓干細(xì)胞的骨髓，而良好的接觸能確保來(lái)自于植骨床或自體骨塊的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞抵達(dá)陶瓷，從而促進(jìn)陶瓷內(nèi)部和周圍形成新骨，因此，行脊柱后路融合時(shí)必須將植骨床充分去皮質(zhì)化，并使植骨塊或去皮質(zhì)骨粒與鈣磷陶瓷充分混合，使其相互接觸，才能確保較多地骨長(zhǎng)入。雙相鈣磷陶瓷的生物降解過(guò)

27、程較復(fù)雜，機(jī)械磨擦、化學(xué)溶解、細(xì)胞吞噬及細(xì)胞活動(dòng)產(chǎn)生的酸性環(huán)境都能使其降解［6］。</p><p>　　本研究所有病例在植骨融合的同時(shí)都進(jìn)行了內(nèi)固定術(shù)，因此所有植入的雙相陶瓷具有穩(wěn)定的生物力學(xué)環(huán)境，但從嚴(yán)格意義上說(shuō)，脊柱后側(cè)和后外側(cè)融合的生物力學(xué)環(huán)境不盡相同，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明橫突間融合術(shù)陶瓷的新骨形成率明顯低于椎板間融合術(shù)。本研究部份病例的融合部位在腰段，標(biāo)本的取材部位可為椎板、關(guān)節(jié)突或橫突間。由于具體活檢部位的記載

28、不夠詳盡，因此不能進(jìn)一步分析這些差異，今后根據(jù)不同植入部位進(jìn)一步研究有助于闡明這些差異。</p><p><b>　　4 致 謝</b></p><p>　　感謝法國(guó)Calot醫(yī)院骨科Chopin醫(yī)師和Morin醫(yī)師熱情地提供臨床標(biāo)本，感謝法國(guó)Littoral大學(xué)生物材料和生物技術(shù)研究所Hardouin教授對(duì)研究所作的悉心指導(dǎo)。</p><p&

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