棉鈴蟲北疆田間種群鈣粘蛋白基因突變的檢測(cè)與鑒定.pdf

1、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera Hübner）是一種世界性害蟲，是轉(zhuǎn)基因Bt抗蟲棉花（Bt棉）的重要靶標(biāo)害蟲之一。我國(guó)自1997年開始種植Bt棉，目前在黃河流域和長(zhǎng)江流域棉區(qū)Bt棉種植面積已達(dá)棉花總面積90％以上，在新疆棉區(qū)Bt棉僅占10％左右，北疆尚未種植Bt棉。大面積種植Bt棉勢(shì)必帶來棉鈴蟲的抗性風(fēng)險(xiǎn)問題。對(duì)室內(nèi)篩選獲得的棉鈴蟲Bt抗性品系的研究表明，棉鈴蟲鈣粘蛋白基因突變可以對(duì)Bt毒素Cry1Ac產(chǎn)生高水平抗性。

2、在黃河流域棉區(qū)和長(zhǎng)江流域棉區(qū)棉鈴蟲田間種群，已經(jīng)檢測(cè)到與Cry1Ac抗性相關(guān)的多個(gè)鈣粘蛋白基因突變型。本研究以F1代檢測(cè)法對(duì)尚未種植Bt棉的北疆沙灣棉鈴蟲種群進(jìn)行鈣粘蛋白基因突變的檢測(cè)與鑒定，該研究結(jié)果將有助于明確田間棉鈴蟲種群鈣粘蛋白基因突變的起始頻率和基因突變的多樣性，為新疆棉區(qū)棉鈴蟲Bt抗性的監(jiān)測(cè)預(yù)警和抗性治理提供理論依據(jù)。
　　 1.F1代檢測(cè)法的建立和驗(yàn)證
　　 在棉鈴蟲Cry1Ac抗性品系SCD-r1（鈣粘蛋

3、白基因r1突變純合品系）內(nèi)建立10個(gè)單對(duì)系，采用1μg/cm2 Cry1Ac對(duì)其F1代進(jìn)行檢測(cè)，10個(gè)單對(duì)系F1代的存活率均＞90％;在SCD-r1抗性品系和SCD敏感品系間建立10個(gè)單對(duì)系，采用1μg/cm2 Cry1Ac對(duì)其F1代進(jìn)行檢測(cè)，10個(gè)單對(duì)系F1代的存活率均＜10％。因此，1μg/cm2 Cry1Ac可以作為F1代檢測(cè)法的區(qū)分劑量。根據(jù)前期研究結(jié)果，確定以下標(biāo)準(zhǔn)以判斷田間個(gè)體鈣粘蛋白基因型:(1)田間個(gè)體與室內(nèi)抗性品系(r

4、1r1)單對(duì)系F1代在Cry1Ac區(qū)分劑量下的存活率＜30％，田間個(gè)體為鈣粘蛋白敏感基因型;(2)存活率在30％與70％之間，田間個(gè)體為鈣粘蛋白基因突變雜合子;(3)存活率＞70％，田間個(gè)體為鈣粘蛋白突變純合子。
　　 為了驗(yàn)證上述方法的可靠性，將2009年采自北疆沙灣的棉鈴蟲雄蛾和SCD-r1雌蛾進(jìn)行單對(duì)雜交，對(duì)其F1代用Cry1Ac區(qū)分劑量進(jìn)行檢測(cè)。其中，SW144單對(duì)系F1代在區(qū)分劑量下的存活率為44.4％，表明該單對(duì)系田

5、間個(gè)體為鈣粘蛋白基因突變雜合子。對(duì)F1代存活幼蟲鈣粘蛋白cDNA進(jìn)行了克隆和分析，發(fā)現(xiàn)田間個(gè)體攜帶的鈣粘蛋白cDNA在第781bp處缺失96bp，導(dǎo)致氨基酸序列在196位提前終止。該結(jié)果證明了本文所建立的F1代檢測(cè)法具有可行性和可靠性。
　　 2.北疆棉鈴蟲沙灣田間種群鈣粘蛋白基因突變的檢測(cè)與鑒定
　　 2010年在北疆沙灣燈誘田間雄蛾，并與抗性品系SCD-r1雌蛾進(jìn)行單對(duì)雜交。共建立了208個(gè)單雌系，產(chǎn)生有效卵的為10

6、5個(gè)，單對(duì)配對(duì)成功率為50.5％。對(duì)產(chǎn)生有效卵的單對(duì)F1代用Cry1Ac區(qū)分劑量（1μg/cm2）進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)6個(gè)候選單對(duì)的田間親本可能為鈣粘蛋白基因突變雜合子。將這6個(gè)候選單對(duì)F1代存活者和室內(nèi)敏感品系SCD雜交，對(duì)其雜交后代以Cry1Ac區(qū)分劑量進(jìn)行處理，檢測(cè)結(jié)果表明，田間親本抗性基因都為隱性。對(duì)6個(gè)候選單對(duì)系F1代存活幼蟲鈣粘蛋白cDNA分別進(jìn)行克隆和測(cè)序。SW60單對(duì)系田間親本鈣粘蛋白cDNA在第23bp處缺失348bp，導(dǎo)致

7、鈣粘蛋白信號(hào)肽和第一個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域之間缺失116個(gè)氨基酸;SW80單對(duì)系田間親本則在第15個(gè)外顯子末尾缺失12bp，導(dǎo)致4個(gè)氨基酸缺失(801YTIT804); SW84單對(duì)系田間親本在第3275個(gè)堿基G突變?yōu)锳，產(chǎn)生終止密碼子TGA，導(dǎo)致翻譯提前終止。但是，在SW2、SW33和SW155單對(duì)系田間親本中，鈣粘蛋白基因序列完整，與SCD品系的相比僅存在氨基酸多態(tài)性;該結(jié)果表明，鈣粘蛋白基因可能通過氨基酸變異導(dǎo)致對(duì)Cry1Ac產(chǎn)生抗性。與我