棉鈴蟲田間種群Cry1Ac抗性基因頻率的估算及鈣粘蛋白基因突變的鑒定.pdf

1、棉鈴蟲Helicoverpa armigera(Habner)是為害棉花的一種重要世界性害蟲。20世紀(jì)90年代初，由于棉鈴蟲對(duì)化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生嚴(yán)重抗性而導(dǎo)致其在我國(guó)北方棉區(qū)連年大爆發(fā)。Bt抗蟲棉由于其良好的殺蟲效果被廣泛種植，持續(xù)、大面積應(yīng)用Bt抗蟲棉將對(duì)靶標(biāo)害蟲形成強(qiáng)大的選擇壓力，靶標(biāo)害蟲的潛在抗性風(fēng)險(xiǎn)將成為Bt抗蟲棉使用壽命的限制性因子。調(diào)查田間棉鈴蟲對(duì)Bt抗蟲棉的敏感性水平，檢測(cè)田間低水平的抗性基因頻率，將為抗性治理策略的制訂和實(shí)施

2、提供可靠依據(jù)。以DNA為基礎(chǔ)的抗性基因分子檢測(cè)方法將大大提高田間抗性檢測(cè)的效率，但是此方法需要深入了解Bt抗性竹分子機(jī)制。本文對(duì)2004年、2005年華北地區(qū)棉鈴蟲田間種群對(duì)CrylAc的抗性基因頻率進(jìn)行了估算，鑒定了田間棉鈴蟲鈣粘蛋白基因突變的類型，從而為建立DNA為基礎(chǔ)的抗性分子檢測(cè)方法提供了重要基礎(chǔ)。 1．不同地區(qū)棉鈴蟲田間種群對(duì)CrylAc活化毒蛋白的敏感性差異用毒蛋白涂表法測(cè)定了2004年、2005年采自河南安陽、河

3、北高陽、河北滄縣、新疆阿克蘇和新疆沙灣棉鈴蟲田間種群對(duì)CrylAc活化毒蛋白的敏感性水平，結(jié)果表明華北棉區(qū)與新疆內(nèi)陸棉區(qū)棉鈴蟲種群對(duì)CrylAc的敏感性存在一定的地區(qū)性差異(<8倍)。我國(guó)華北地區(qū)棉鈴蟲田間種群對(duì)CrylAc還沒有產(chǎn)生明顯的抗性。 2．棉鈴蟲田間種群對(duì)CrylAc抗性等位基因頻率的估算采用改進(jìn)的F<,1>篩查法檢測(cè)了2004年、2005年采自華北地區(qū)的棉鈴蟲田問種群對(duì)Bt毒蛋白CrylAc的抗性基因頻率。2004

4、年從河南安陽、2005年從河南安陽和河北滄縣Bt抗蟲棉上采集二代棉鈴蟲卵，在室內(nèi)用人工飼料飼養(yǎng)至2齡幼蟲，用CrylAc活化毒蛋白(1μg/cm<'2>)進(jìn)行初篩，將初篩存活成蟲與室內(nèi)篩選的GYBT抗性品系成蟲進(jìn)行單對(duì)雜交，并用區(qū)分劑量(2.5gg/cm<'2>)對(duì)F<,1>代二齡幼蟲進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)和估算，2004年河南安陽田間種群的抗性基因頻率為5.6x10<'-3>；2005年河南安陽棉鈴蟲種群和河北滄縣棉鈴蟲種群對(duì)CrylAc抗

5、性基因頻率基本一致，分別為1.4×10<'-3>和1.5×10<'-3>。 3．田間棉鈴蟲鈣粘蛋白基因突變的鑒定通過F<,1>篩查，有7個(gè)單對(duì)系F<,1>代抗性個(gè)體(田間個(gè)體×室內(nèi)抗性個(gè)體)可能攜帶一對(duì)與抗性相關(guān)的鈣粘蛋白等位基因，一條來自抗性品系親本(rl，GenBank登錄號(hào)為AY647975，已經(jīng)證明其發(fā)生了缺失突變)，另一條來自田間親本。采用RT-PCR及3'-RACE技術(shù)，分別克隆了這7個(gè)單對(duì)系F<,1>代抗性個(gè)體中來

6、自田間親本的鈣粘蛋白基因全長(zhǎng)cDNA，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的鈣粘蛋白基因突變型。通過與敏感品系鈣粘蛋白氨基酸序列(Ha_BrR，GenBank登錄號(hào)為AY647974)的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)基因突變型(r2)在翻譯區(qū)1113位堿基變異產(chǎn)生了一個(gè)提前的終止密碼子TGA，從而導(dǎo)致表達(dá)的受體蛋白被嚴(yán)重截短，僅有371個(gè)氨基酸。另一個(gè)基因突變型(r3)在鈣粘蛋白基因的重復(fù)區(qū)域EC1和EC3之間缺失了507個(gè)堿基，導(dǎo)致169個(gè)氨基酸的缺失。本研究發(fā)現(xiàn)了田間