胡黃連對缺血再灌注腦組織膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響

1、<p>　　胡黃連對缺血再灌注腦組織膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響</p><p>　　【摘要】 　　目的 觀察缺血再灌注大鼠腦內(nèi)膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）及GDNF mRNA的變化，探討胡黃連對神經(jīng)元的保護作用。方法 成年健康雄性Wistar大鼠36只，應(yīng)用線栓法制作腦缺血再灌注模型，用胡黃連甲醇提取物灌胃治療后，免疫組織化學(xué)染色法觀察皮質(zhì)、紋狀體GDNF蛋白表達，原位雜交方法觀察其mRNA表達。結(jié)果

2、 模型組缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)于缺血再灌1 d時GDNF蛋白、GDNF mRNA表達至高峰，與假手術(shù)組比較差異有顯著性（F=14.168、40.189，q=12.565～16.847，P&lt;0.01），14 d降至基礎(chǔ)水平；紋狀體區(qū)于缺血再灌3 d時GDNF蛋白、GDNF mRNA表達至高峰，與假手術(shù)組比較有顯著性差異（F=12.531、113.312,q=11.379～12.565,P&lt;0.01），14 d降至基礎(chǔ)水平

3、；胡黃連組缺血再灌注14、21 d時GDNF蛋白、GDNF mRNA表達與手術(shù)組及假手術(shù)組比較升高，有顯著性差異（q=16.847～30.079，P&lt;0.01)。結(jié)論 胡黃連對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元有保護作用，其機制可能與上調(diào)腦內(nèi)GDNF表達有關(guān)</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 胡黃連 腦缺血再灌注 膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 大鼠 Wistar </p><p>　?。跘BST

4、RACT］ Objective To observe the expression of glial derived neurotrophic factor (GDNF) and GDNF mRNA in cerebral tissue after reperfusion of focal cerebral ischemia, and to elucidate picrorhizae in the protection of neuro

5、n. Methods Ischemic reperfusion models were established with intraluminal thread method in 36 adult healthy male Wistar rats. The rats in model group were given intragastric administration with picrorhizae, the expressio

6、ns of GDNF and GDNF mRNA in cortex and striatum were de</p><p>　?。跭EY WORDS］ Picrorhizae; Ischemic reperfusion; Glialderived neurotrophic factor; Rats, Wistar </p><p>　　神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體可保護神經(jīng)元，對抗低氧、興奮

7、性氨基酸、自由基、細胞內(nèi)鈣超載等病理改變。因此，提高內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達，促進半暗帶神經(jīng)元存活對腦卒中功能恢復(fù)有積極意義。最近研究表明，中藥胡黃連甲醇提取物具有抗氧化和清除自由基的作用，在體外實驗中可提高神經(jīng)元存活率，增強神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)PC12 神經(jīng)細胞軸突生長[1]。本研究建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，觀察胡黃連甲醇提取物對腦缺血再灌后神經(jīng)元損傷的作用?，F(xiàn)報告如下。 </p><p><b>

8、　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 動物和分組 </p><p>　　健康雄性Wistar大鼠36只，清潔級，由山東大學(xué)動物實驗中心提供，3～4月齡，體質(zhì)量為(246±15)g。常規(guī)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22 ℃。隨機分為3組，模型組24只，治療組8只，假手術(shù)組4只。應(yīng)用改良線栓法[2]，經(jīng)左側(cè)頸外頸內(nèi)動脈插線建立大腦中動脈閉塞（MCAO）再灌注模

9、型，模型成功的標志為動物蘇醒后出現(xiàn)左側(cè)Horner征，提尾右前肢內(nèi)收屈曲，爬行時右側(cè)劃圈。模型組又分為缺血1.5 h再灌注6 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d組，每組4只；治療組又分為缺血1.5 h再灌注14、21 d組；假手術(shù)組僅插入尼龍線10 mm，其余步驟同模型組。 </p><p>　　1.2 實驗方法 </p><p>　　1.2.1 給藥方法 模型組及假手術(shù)

10、組大鼠每天給予生理鹽水灌胃1次，每次3 mL；治療組每天灌胃胡黃連甲醇提取物(1 g/L)1次，每次3 mL。 </p><p>　　1.2.2 腦組織取材 應(yīng)用10 g/L戊巴比妥鈉麻醉大鼠，暴露心臟，先以生理鹽水200 mL經(jīng)升主動脈沖洗，再以40 g/L多聚甲醛200～300 mL灌注固定，持續(xù)30　min后取腦備用。取材范圍為前囟后2.0 mm至前囟前3.0 mm。腦組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋

11、，連續(xù)冠狀切片（片厚5 μｍ），粘于用多聚賴氨酸處理的切片上，室溫保存?zhèn)溆谩?</p><p>　　1.2.3 GDNF蛋白檢測 采用免疫組化方法。兔抗鼠GDNF一抗和SABC免疫組織化學(xué)試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供。按說明書操作，一抗?jié)舛葹?∶100，DAB顯色，細胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性著色，鏡下根據(jù)細胞著色情況控制反應(yīng)時間，室溫下約5～8 min，雙蒸水沖洗終止反應(yīng)；脫水、透明；中性樹膠封

12、片；免疫組化陽性細胞計數(shù)。以0.1 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。 </p><p>　　1.2.4 GDNF mRNA檢測 采用原位雜交方法。GDNF mRNA原位雜交試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。按說明書操作，標本切片，脫蠟，梯度乙醇水化至水；依次滴加H2O2、胃蛋白酶、預(yù)雜交液、雜交液、生物素化鼠抗地高辛、SABC后，DAB顯色，鏡下根據(jù)細胞著色情況控制反應(yīng)時間，雙蒸水沖洗終止反應(yīng)；

13、脫水，透明，封片。光鏡下觀察，細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。取部分切片不加探針以0.1 mol/L PBS代替作為陰性對照。 </p><p>　　1.2.5 結(jié)果觀察 參考PAXINOS和WATSON的大鼠腦圖譜，光學(xué)顯微鏡下(400倍)觀察皮質(zhì)、紋狀體區(qū)GDNF蛋白及GDNF mRNA陽性細胞的數(shù)量，采用德國歐波同公司VIDAS圖像分析系統(tǒng)將每個標本的圖像輸入電腦，對陽性細胞作吸光度掃描,獲得吸光度值。

14、 </p><p>　　1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 </p><p>　　結(jié)果以±s表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)間比較采用方差分析。 </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)GDNF蛋白的表達 </p><p&

15、gt;　　與假手術(shù)組比較, 模型組缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)GDNF蛋白表達陽性細胞于缺血再灌注6 h后著色開始加深，1 d時達到高峰，與假手術(shù)組比較差異有顯著性（F=14.168,q=12.565，P&lt;0.01），之后表達逐漸減弱，14 d降至基礎(chǔ)水平；紋狀體區(qū)GDNF蛋白表達陽性細胞于缺血再灌注1 d后著色開始加深，3 d達高峰，與假手術(shù)組相比較，差異均有顯著意義（F=12.531,q=11.379，P&lt;0.01），之

16、后表達逐漸減弱，14 d 降至基礎(chǔ)水平。治療組缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)GDNF蛋白表達陽性細胞含量于缺血再灌注14、21 d時明顯高于假手術(shù)組和相應(yīng)模型組, 差異有顯著性（q=4.908、4.319，P&lt;0.05）；治療組缺血側(cè)紋狀體區(qū)GDNF蛋白表達陽性細胞含量于缺血再灌注14、21 d時明顯高于假手術(shù)組和相應(yīng)模型組, 差異有顯著性（q=5.172、4.345，P&lt;0.05 ）。見表1。 </p><

17、;p>　　2.2 缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)GDNF mRNA的表達 </p><p>　　假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)GDNF mRNA表達的時相變化規(guī)律與GDNF蛋白表達基本相似，模型組缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)于缺血再灌注6 h后陽性細胞著色開始加深，1 d時達到高峰，其值與假手術(shù)組大鼠比較差異有顯著意義（F=40.189，q=16.847，P&lt;0.01），之后表達逐漸減弱，14 d降至基礎(chǔ)水平；紋狀體

18、區(qū)GDNF mRNA表達陽性細胞于缺血再灌注1 d后著色開始加深，3 d達高峰，與假手術(shù)組相比較，差異有顯著意義（F=113.312，q=30.079，P&lt;0.01），之后表達逐漸減弱，14 d降至基礎(chǔ)水平。治療組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)GDNF mRNA反應(yīng)陽性細胞含量于缺血再灌注14、21 d均明顯高于假手術(shù)組和模型組，差異有顯著意義（q=0.003、0.031，P&lt;0.05、0.01）；治療組大鼠缺血側(cè)紋狀體區(qū)

19、GDNF mRNA反應(yīng)陽性細胞含量于缺血再灌注14、21 d時明顯高于假手術(shù)組和相應(yīng)模型組, 差異有顯著性（q=5.013、3.731，P&lt;0.05、0.01）。見表2。 </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　GDNF是轉(zhuǎn)化生長因子家族的新成員之一[3]，屬半胱氨酸蛋白家族，是一糖基多肽。GDNF是多巴胺能神經(jīng)元存活和分

20、化的高特異性營養(yǎng)因子，同時對海馬錐體細胞、外周運動神經(jīng)元亦有保護作用。在新生鼠的海馬、紋狀體、皮質(zhì)、小腦區(qū)均有GDNF mRNA的較高表達，提示在發(fā)育過程中GDNF對這些區(qū)域的神經(jīng)元有支持作用；在成年鼠中，GDNF mRNA表達較低，但當(dāng)腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境改變，如缺血損傷時，可誘導(dǎo)GDNF mRNA在一些腦區(qū)表達增加，特別是在對缺血損傷相對耐受的腦區(qū)其表達明顯高于易損腦區(qū)，提示GDNF對缺血神經(jīng)元的損傷有保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬內(nèi)注入GD

21、NF后，缺血誘發(fā)的酪氨酸羥化酶（TH）mRNA水平降低，認為GDNF可通過調(diào)節(jié)TH mRNA及其蛋白水平實現(xiàn)神經(jīng)保護作用[4]。重組人類GDNF誘發(fā)促細胞分裂劑激活性蛋白激酶(MAPK)途徑的活化,減少了NMDA引發(fā)的鈣內(nèi)流,從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。GDNF可減小腦缺血后的梗死面積和腦水腫, 減輕DNA斷裂及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶免疫陽性反應(yīng)[5]。MIYAZAKI等[6]則觀察到，GDNF可減少短暫性前腦缺血模型中的遲發(fā)性神經(jīng)元死

22、亡。 </p><p>　　表1 缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)GDNF蛋白表達（略） </p><p>　　與假手術(shù)組相比，F(xiàn)=14.168、12.531，*q=11.379～12.565，P&lt;0.01；與模型組相比，△q=4.345～5.172，P&lt;0.05 </p><p>　　表2 缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)GDNF mRNA表達（略） &

23、lt;/p><p>　　與假手術(shù)組相比，F(xiàn)=40.189、113.312，*q=16.847～30.079，P&lt;0.01；與模型組相比，△q=0.003～5.013，P&lt;0.05 </p><p>　　本實驗利用大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型觀察到，缺血再灌注6 h后GDNF蛋白表達陽性細胞著色開始加深，皮質(zhì)區(qū)于1 d時達高峰，紋狀體區(qū)于3 d達高峰；缺血再灌后皮質(zhì)區(qū)

24、和紋狀體區(qū)GDNF mRNA表達的時相變化規(guī)律與GDNF蛋白表達基本相似，支持GDNF對缺血神經(jīng)元的損傷有保護作用的觀點。但是本文也同時觀察到，腦缺血誘導(dǎo)的GDNF表達增加時程短, 再灌注14 d降至基礎(chǔ)水平，難以對受損神經(jīng)元起到全面而持久的保護作用。 </p><p>　　胡黃連為我國傳統(tǒng)中藥，主要生物活性成分是環(huán)烯醚萜甙類。LI等[7]報道，環(huán)烯醚萜甙類化合物具有增強神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)PC12神經(jīng)細胞軸突生長的

25、作用。陶移文等[1]通過建立神經(jīng)細胞自由基損傷模型觀察到，胡黃連苷Ⅱ可提高PC12神經(jīng)細胞的存活率，減少乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量,降低細胞內(nèi)活性氧水平，對PC12 神經(jīng)細胞損傷具有明顯的保護作用。張偉等[8]通過建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型觀察到，胡黃連可下調(diào)腦內(nèi)NMDA R1 mRNA表達，從而減輕興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性，起到神經(jīng)保護作用。本文觀察了中藥胡黃連甲醇提取物對缺血再灌大鼠腦GDNF表達的影響，結(jié)果表明，治療組缺血

26、側(cè)皮質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)GDNF蛋白表達陽性細胞含量于再灌注后14、21 d均明顯高于假手術(shù)組和模型組，差異有顯著性；皮質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)GDNF mRNA表達陽性細胞含量于14、21 d均明顯高于假手術(shù)組和模型組，差異有顯著性。提示胡黃連促進缺血再灌注后較長時程內(nèi)GDNF的合成是其神經(jīng)保護作用的機制之一。 </p><p><b>　　【參考文獻】 </b></p><p>

27、　　[1]陶移文,劉建文,魏東芝,等. 胡黃連苷Ⅱ在體外對PC12 神經(jīng)細胞損傷的保護作用[J]. Chin J Clin Pharmacol Ther, 2003,8(1):2730. </p><p>　　[2]LONGA E Z, WEISTEIN P R, CARISON S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without cra

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29、<p>　　[4]MIYAZAKI H, ONO T, OKUMA Y, et al. Glial cell linederived neurotrophic factor modulates ischemiainduced tyrosine hydroxylase expression in rat hippocampus[J]. Eur J Neurosci, 2000,12(6):20322038. </

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31、 1998,20(4):333336. </p><p>　　[6]MIYAZAKI H, OKUMA Y, FUJII Y, et al. Glia cell line derived neurotrophic factor protects against delayed neuronal death after transient fore brain ischemia in rats[J]. Neuro

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