基于微流控的環(huán)境微生物基因檢測芯片研究.pdf

1、隨著環(huán)境科學(xué)的日益發(fā)展，環(huán)境中的微生物對人類社會(huì)的影響越來越受到重視，尤其是環(huán)境中的致病微生物，容易導(dǎo)致人類疾病和社會(huì)恐慌，因此成為了環(huán)境生物分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前，環(huán)境科學(xué)已經(jīng)與化學(xué)、生物和微流控等多種技術(shù)交叉融合，通過充分發(fā)揮各學(xué)科的技術(shù)優(yōu)勢，極大的促進(jìn)了環(huán)境微生物分析檢測的發(fā)展。其中，分子生物學(xué)分析具有操作簡單、靈敏性和特異性高的特點(diǎn)。但是，受到儀器、樣品和試劑的使用及成本的限制，在對多種樣品進(jìn)行大量分析時(shí)，存在著操作繁瑣和

2、成本較高等問題，而且無法滿足現(xiàn)場實(shí)施分析的需要。因此，亟需一種快速、便攜、高通量的檢測技術(shù)，用于環(huán)境致病微生物的現(xiàn)場監(jiān)測和分析。
　　本論文通過微流控芯片技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，以PDMS為材料，構(gòu)建了一種簡單廉價(jià)的連續(xù)流動(dòng)式PCR擴(kuò)增芯片，可以對環(huán)境微生物進(jìn)行快速檢測。一次擴(kuò)增需要的樣品和PCR試劑消耗量分別約為0.1ul和2ul。與傳統(tǒng)的PCR方法相比，本芯片結(jié)構(gòu)簡單，便于攜帶，可以對多個(gè)樣品進(jìn)行流動(dòng)式分析，而且操作簡便，

3、能夠初步滿足現(xiàn)場檢測的需要。
　　在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了用于空氣中微生物檢測的高通量流動(dòng)式PCR芯片。通過閥門的開啟和閉合，對反應(yīng)液的流動(dòng)進(jìn)行控制，實(shí)現(xiàn)了以連續(xù)流動(dòng)進(jìn)樣的方式一次針對六種空氣中的微生物的檢測。從細(xì)菌的富集和裂解到芯片PCR擴(kuò)增完成，耗時(shí)約2小時(shí)，一次分析需要的樣品量僅為0.13ul，PCR反應(yīng)試劑約2.5ul，特別適合對珍貴或稀少樣品的分析。以大腸桿菌為目標(biāo)菌株，測得該芯片的最低檢測限約為118個(gè)細(xì)菌。本研究構(gòu)建的微流

4、控芯片是首個(gè)具有直接針對空氣中的微生物進(jìn)行分子生物學(xué)分析能力的設(shè)備，在對環(huán)境氣溶膠中的病原微生物的快速分析中將發(fā)揮重要作用，通過改進(jìn)和完善，有望實(shí)現(xiàn)環(huán)境空氣微生物的現(xiàn)場檢測和早期預(yù)警。
　　為了進(jìn)一步滿足高通量檢測的需要，提高檢測特異性，我們在常規(guī)基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了基于微流控的靜態(tài)核酸雜交芯片。通過設(shè)計(jì)針對細(xì)菌16SrDNA可變區(qū)的寡核苷酸探針，可以實(shí)現(xiàn)一次對五種常見環(huán)境致病微生物的快速雜交分析。探針的特異性較好，最低檢

5、測限與常規(guī)的基因芯片技術(shù)相當(dāng)，但試劑消耗和反應(yīng)耗時(shí)分別約為常規(guī)方法的10％和50％。我們通過將連續(xù)流動(dòng)式PCR芯片與核酸雜交芯片進(jìn)行整合，開發(fā)了快速、便攜和成本低廉的微生物核酸分析系統(tǒng)。
　　本研究是環(huán)境科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)研究院的交叉聯(lián)合項(xiàng)目，通過環(huán)境生物學(xué)技術(shù)和微流控技術(shù)的結(jié)合，對環(huán)境微生物進(jìn)行分析和檢測，為環(huán)境科學(xué)的發(fā)展提供新的技術(shù)支持。另外，本研究所構(gòu)建的微流控芯片系統(tǒng)在對環(huán)境中其它微生物的檢測中也能發(fā)揮出獨(dú)特的優(yōu)勢，具有較高的