魚類補體和c9基因的研究進(jìn)展【文獻(xiàn)綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　食品工程與科學(xué)</b></p><p>　　魚類補體和C9基因的研究進(jìn)展</p><p>　　摘要：魚類的補體在殺滅和中和微生物方面起著重要作用，該系統(tǒng)系統(tǒng)可激活溶血途徑和調(diào)理作用來實現(xiàn)其對機體的防御功能，其中C9是構(gòu)成補體重要結(jié)構(gòu)之一的末

2、端補體分子的一類分子。本文主要介紹了魚類補體特征、生物學(xué)作用以及魚類補體的合成發(fā)生。同時，也介紹了C9基因的研究進(jìn)展，以及適用于C9重組蛋白純化的試驗方法。</p><p>　　關(guān)鍵詞：魚類；補體；C9基因；研究進(jìn)展</p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　地球上的生物都在經(jīng)歷上億年的時間和不斷變化的自然環(huán)境的過程中，

3、慢慢的形成了它們自身特有的防御體系——免疫系統(tǒng)。動物的免疫系統(tǒng)是由先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)兩部分組成(于善謙等,1999)。其中魚類是脊椎動物中，種類數(shù)量占比重最多的一個類群，在進(jìn)化過程中，魚類是處于連接高等脊椎動物和低等無脊椎動物的一個特殊地位，但目前關(guān)于非特異性免疫因子以及其與高等脊椎動物的比較研究還很有限，還缺乏更多的分子生物學(xué)方面的證據(jù)。對魚類免疫系統(tǒng)的深入研究，在一定程度上有助于進(jìn)一步的了解到脊椎動物免疫系統(tǒng)的發(fā)生、進(jìn)化以及

4、其多樣性。和高等脊椎動物一樣，魚類也是利用免疫系統(tǒng)來初步防御外來病原生物的侵害，其免疫抵御機制包括非特異性免疫和特異性免疫，它們的共同作用是都能夠維持機體的正常功能以及魚類自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。</p><p>　　補體(Complement，C)是在先天免疫防御中具有重要功能的體液分子，其被病原體或者抗原抗體復(fù)合物等多種物質(zhì)激活后，能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生、抗體的形成以及介導(dǎo)病原體的清除。補體被抗原-抗體復(fù)合體或微生物

5、激活，然后可通過直接裂解或者促進(jìn)吞噬作用消滅病原微生物。在補體系統(tǒng)兩條激活途徑中，涉及到14個補體蛋白（C1-9，及B、D、P因子）的參與，近年來，其在分子遺傳學(xué)和分子克隆技術(shù)的應(yīng)用日漸廣泛。</p><p>　　本文對魚類補體系統(tǒng)的研究概況及與補體成分之一C9基因研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。</p><p>　　2魚類補體系統(tǒng)研究進(jìn)展</p><p>　　補體(Comple

6、ment,C)是先天免疫防御中重要的體液功能分子，在被病原體或者抗原抗體復(fù)合物等多種物質(zhì)激活后，能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和抗體的形成、介導(dǎo)病原體的清除(Ferreira et al,2000;Gasque,2004)。補體經(jīng)典溶血途徑能夠非特異性的補體系統(tǒng)與特異的獲得性免疫聯(lián)系起來，成為抗體介導(dǎo)的體液免疫的一種重要的效應(yīng)機制(Fujita et al,2004b;Morgan et al,2005)。自1894年P(guān)feiffer發(fā)現(xiàn)溶菌現(xiàn)象以來，

7、對補體的研究己經(jīng)有100多年的歷史，而魚類補體的研究起步比較晚，對其系統(tǒng)研究是20世紀(jì)80年代以后才開始的(Dodds&Day,1993)。</p><p>　　2.1 補體活化途徑</p><p>　　補體系統(tǒng)是一個古老的防御機制，在無脊椎動物階段就已經(jīng)存在(Nakao et al, 2003)。魚類補體活化途徑有經(jīng)典途徑(Classic Complement Pathway，C

8、CP)、旁路途徑(Alternative Complement Pathway，ACP)、凝集素途徑(Lectin Complement Pathway，LCP)和共同的終末途徑形成攻膜復(fù)合體(Membrane Attack Complex，MAC)。ACP和LCP在無頷類脊椎動物已經(jīng)存在(Sunyer&Lambris,1998;Fujita et al,2004b)。</p><p>　　補體活化途徑也

9、稱作補體系統(tǒng)。補體的各成分，為抗原抗體復(fù)合體以及其他成分，離子等相繼會合連鎖被活化，結(jié)果引起免疫細(xì)胞溶解和免疫溶血，也就是細(xì)胞和細(xì)菌、紅血球等的溶解或免疫粘著等許多免疫生物學(xué)現(xiàn)象（C1-C9為補體的第一到第九成分），這一機制稱為補體活化途徑，大致可分為兩種途徑，第一補體途徑（classical pathway）和第二途徑，第二途徑亦稱為代替途徑（alternate pathway）。</p><p>　　2.2補

10、體的合成和發(fā)生</p><p>　　補體是存在于人和動物血清與組織液中,由近40種可溶性蛋白和膜蛋白組成，可溶補體蛋白的主要功能是結(jié)合和破壞入侵的病原，補體系統(tǒng)的膜蛋白又分為補體受體和補體調(diào)節(jié)蛋白。補體受體啟動吞噬細(xì)胞結(jié)合和吞噬結(jié)合了補體調(diào)理素的病原。補體調(diào)節(jié)蛋白保護(hù)機體正常組織免受可溶補體蛋白的意外損害(Bohana-Kashtan et al,2004)。</p><p>　　許多不同

11、的組織細(xì)胞能夠合成補體蛋白，包括肝細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞(腎臟，肺和腸道)，脂肪細(xì)胞(Volanakis,1995; 謝佩蓉,1997)，以及腦細(xì)胞(神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元)等(Fabry et al,1994)。血漿中大部分補體組分由肝細(xì)胞分泌。單核巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生幾乎所有具有活性的補體成分，而其它類型的細(xì)胞或組織產(chǎn)生其中個別成分(Dalmo et al,1997)。</p&g

12、t;<p>　　魚類肝臟是合成補體的主要器官(Ellingsen et al,2005;Huttenhuis et al,2006)，但在其它組織器官如眼視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、脊索、胃、腸道、胰腺、心臟、腦、脾臟、腎臟和鰓中也檢測到(Nakao,1998;Lange et al,2004b; Chondrou et al, 2006b)。</p><p><b>　　2.3魚類補體特性</

13、b></p><p>　　2.3.1 魚類補體具有較低的反應(yīng)溫度</p><p>　　硬骨魚類補體在較低的溫度下激活，魚類補體活化的最適溫度是20~25℃，哺乳動物則是37℃；溫水魚類在45~50℃補體失活(Sakai et al,1981)，而虹蹲等冷水魚類補體的滅活溫度是40~45℃ (Magnadottir, 2000; Claire et al ,2002)，哺乳動物的AC

14、P滅活溫度是56℃，CCP的滅活溫度是50℃。許多種魚類在0~4℃也仍然顯示溶血活性，兩棲類和爬行類的補體也存在同樣的特性(Koppenheffer,1957;Sunyer&Lambris,1998)。低溫環(huán)境下，當(dāng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)減弱時，魚類補體系統(tǒng)仍然保持較高活性。</p><p>　　2.3.2 魚類具有較高的ACP活性</p><p>　　魚類的ACP溶血活性(使用ACH5

15、0值表示)比哺乳動物的ACH50值高5~10倍，體現(xiàn)了ACP在魚類先天性免疫中具有更重要的作用。也可能是對被溶解靶細(xì)胞的敏感性存在種類特異性差異(Claire et al,2002)，通過ACP魚類補體可以間接的裂解多種動物紅細(xì)胞，魚類補體的這種性質(zhì)顯示可能具有較寬范圍的識別外源物種的能力，這種識別非己成分的能力可能歸因于魚類的一些補體成分存在的多種亞型(Sunyer et al,1995)。</p><p>　

16、　2.3.3 魚類補體成分的多態(tài)性</p><p>　　硬骨魚類補體的一些成分由多基因編碼。魚類多種補體蛋白都有多種亞型存在，這些多態(tài)性是不同基因的產(chǎn)物，顯示在硬骨魚類出現(xiàn)之前發(fā)生了一系列的基因復(fù)制事件(Holland&Lambris,2002)。虹蹲的4個C3亞型被鑒定(sunyer et al,1996)，鯉的8個C3的cDNA和5個蛋白分別被鑒定和分離(Nakao et al,2003)，研究顯示

17、金頭綢有5個C3亞型(Sunyer et al,1997)。</p><p>　　低等脊椎動物補體基因多態(tài)性的產(chǎn)生與擴增其自身的免疫識別能力和免疫反應(yīng)能力有關(guān)。變溫脊椎動物的獲得性免疫容易受到環(huán)境水溫變化的影響，因此主要依賴其多樣化的先天性免疫機制，主要不同點體現(xiàn)在補體系統(tǒng)。魚類補體成分的多態(tài)性和反應(yīng)的高效性，為魚類提供快速、強大而多樣的自然免疫能力(Sunyer et al,1997)。</p>

18、<p>　　3 C9基因研究進(jìn)展</p><p><b>　　3.1 C9分子</b></p><p>　　C9分子是補體溶解途徑膜攻擊復(fù)合體（MAC）的一個成員，為形成MAC的最后一個分子，是單鏈糖蛋白，分子量是79kd。C9分子的多肽鏈與c8a和c8b結(jié)構(gòu)上相類似，也含有TSP-1、LDL受體前提結(jié)構(gòu)功能域，及與穿孔蛋白同源的結(jié)構(gòu)功能域。</p&g

19、t;<p>　　圖1 膜攻擊復(fù)合體（MAC）的結(jié)構(gòu)模式圖</p><p>　　經(jīng)對cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，C9為一兩性分子。C端37kDa由疏水性氨基酸組成稱C9b，N端34kDa由親水性氨基酸組成稱C9a。因此C9以其羧基端部分嵌入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層中，而N端則為與C 5b-8相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。由12-16個C9分子聚合形成的多聚體C9，可形成內(nèi)徑10nm、壁厚2nm的中空穿膜孔道嵌入膜內(nèi)

20、。孔道的內(nèi)面由許多親水性氨基酸殘基和碳水化物組成，而與雙層脂接觸的管壁外面則是疏水性氨基酸殘基。由于細(xì)胞內(nèi)容物的外漏，最終可導(dǎo)致細(xì)胞溶解破壞。編碼入C9的基因定位于第5號染色體上，末發(fā)現(xiàn)C9有多態(tài)性(Willian E,2003)。</p><p>　　C9重組蛋白的提取純化方法</p><p>　　適用于C9重組蛋白的分離提取的方法有：無機物沉淀法、高分子有機聚合物沉淀法、有機溶劑沉淀法

21、、超濾法。</p><p>　　適用于C9重組蛋白的純化精制方法有：離子交換色譜法（周鳳蘭和張頁,1992）、凝膠過濾法(李培成,1991)、嗜硫色譜法、親和色譜法(秦衛(wèi)松和李芳秋,2001)、疏水作用色譜法。</p><p>　　以上提取純化方法中，超濾法雖然所得純度不高，但操作簡單，與水稀釋法連用可不加任何化學(xué)試劑而用于食品級Ig的分離；色譜的純化效率雖高，但抗體損失較大，多種色譜聯(lián)合

22、使用可以達(dá)到較高純度，但往往得率低，操作費時；嗜硫色譜在Ig的純化中顯示出選擇性強、活性回收率高、易于工業(yè)化放大的優(yōu)點，已成功用于重組單鏈抗體片段與Fab段的分離；生物工程構(gòu)建配體TG19318親和色譜的應(yīng)用簡化了免疫球蛋白的分離，但其制備和使用成本相對較高，對Ig的非特異性一步色譜純化可用嗜硫色譜法；應(yīng)用于免疫檢測的抗體，宜用抗原偶聯(lián)的色譜柱純化獲得特異性Ig；金屬離子色譜法可用于Ig亞群的分析分離研究（徐欽和劉成國,2010）。&l

23、t;/p><p>　　C9缺乏與生理疾病研究進(jìn)展</p><p>　　補體重要結(jié)構(gòu)之一末端補體分子：C6，C7，C8和C9是構(gòu)成膜攻擊復(fù)合體（MAC），是能夠引起靶細(xì)胞溶解破壞的重要組成成分。補體成分的缺失，會影響動物體內(nèi)補體系統(tǒng)的正常工作，C9作為MAC重要組成之一，目前有應(yīng)用于一些相關(guān)疾病的檢測，隨著研究成果的不斷深入和具體，C9的研究也越來越廣泛?，F(xiàn)今已通過研究證實和C9有關(guān)的疾病主要有

24、食管癌、腦出血、心臟病、SLE樣綜合征和干燥綜合征等。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 于善謙, 王洪海, 朱乃碩等. 免疫學(xué)導(dǎo)論 [M]. 北京:高等教育出版社, 1999.</p><p>　　[2] Ferreira A M, Irigoin F, Breijo M, et al.. How Ec

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