論文答辯模板

1、動物科技學院碩士研究生畢業(yè)論文答辯,布魯氏菌019株弱化與基因缺失株構建及初步免疫評價,姓 名：指導老師：,研究背景,研究目的,試驗研究,全文結論,1,2,3,4,匯報內容,論文創(chuàng)新,5,文章發(fā)表,6,,一、研究背景,布魯氏菌病 (Brucellosis) 是一種人畜共患傳染病，在全世界范圍內廣泛分布，在我國也有大量的動物發(fā)生感染，新疆是我國的高發(fā)地區(qū)。 動物感染布魯氏菌后主要表現(xiàn)為波浪熱，關節(jié)腫大及生殖系統(tǒng)的疾病。,,

2、,目前布魯氏菌病的預防控制主要通過疫苗接種，我國主要采用弱毒活疫苗有M5-90、S2等。 疫苗株的缺陷：毒力仍然較強；存在返強的潛在威脅；不能有效區(qū)分疫苗免疫和自然感染。,一、研究背景,pgm基因編碼的磷酸葡萄糖變位酶，參與布魯氏菌脂多糖O鏈裝配過程，該基因的缺失會影響光滑型布魯氏菌LPS的合成。 由于LPS是介導宿主先天性免疫反應的重要抗原，pgm基因是布魯氏菌重要的毒力基因。,一、研究背景,目前，國內外已有布

3、魯氏菌pgm基因突變或缺失的報道： Juan等將布魯氏菌S19進行了pgm基因敲除，獲得了布魯氏菌pgm基因缺失株，動物試驗結果表明：pgm基因缺失株不能合成LPS，同時也檢測不到O鏈抗體，和親本株S19有相似的免疫保護性。,一、研究背景,,,布魯氏菌019株是1980年在新疆紫泥泉種羊場被發(fā)現(xiàn)并分離；較其他野毒株，毒力較弱，但依然可誘發(fā)動物的病理損傷，主要引起公羊的附睪炎等癥狀。 布魯氏菌氫氧化鋁佐劑滅活苗接種羊群后

4、，保護率可達75%。,一、研究背景,通過物理和化學的方法對布魯氏菌019株進行誘導突變，分析生長狀況及毒力的變化。 針對布魯氏菌磷酸葡萄糖變位酶基因（pgm）定向構建布魯氏菌019的pgm基因缺失株，并對其毒力及免疫效果進行評價；探討布魯氏菌019株致弱后作為疫苗株的潛力。,二、研究目的,,,三、實驗研究,,布魯氏菌019株弱化與毒力評價,,,,實驗二,布魯氏菌019Δpgm基因缺失株構建,,,,實驗三,布魯氏菌019Δpgm

5、毒力及初步免疫評價,,實驗一 布魯氏菌019株弱化與毒力評價,0.1%、0.05%吖啶橙,實驗方案,連續(xù)轉接50次,0.1%、0.05%苯酚,紫外線照射5min、2min,,生長曲線,小鼠脾臟指數(shù),脾臟CFU計數(shù),評價毒力變化,布魯氏菌019株,,,自身生長能力,疫苗應用前景評價,,,,結果與分析,,1、生長曲線的繪制,結果顯示：25 h后進入對數(shù)生長期，細菌隨時間變化快速增長，61 h后菌數(shù)趨于穩(wěn)定。,2、代時比較,,結果顯示：

6、各處理組細菌代時與親本019株相比較均有不同程度的增加。,結果與分析,3、小鼠脾臟指數(shù)變化,,,結果顯示：1?108菌/只腹腔接種小鼠后，苯酚處理組和紫外照射處理組小鼠脾指數(shù)明顯低于親本株019株（P0.05）。,結果與分析,,,4 、小鼠脾臟細菌計數(shù),結果顯示： 各處理組布魯氏菌在小鼠脾臟內的細菌均有不同程度的減少，但均顯著高于疫苗株M5-90組。經0.1g/L吖啶橙處理和5min紫外線處理組小鼠脾臟CFU與親本株019相比明顯減少，

7、差異顯著（P<0.05）。,結果與分析,對布魯氏菌019株進行紫外照射或吖啶橙、苯酚誘導處理后，毒力發(fā)生了一定變化。 各處理組生長特性也發(fā)生了不同程度的變異，說明短暫的誘導不僅可以影響其毒力的變化也影響了其自身生存能力。,討論,,,實驗二 布魯氏菌019Δpgm基因缺失株構建,根據(jù)GeneBank上發(fā)表的綿羊附睪布魯氏菌019基因組序列設計引物，擴增pgm基因的上下游同源臂,上下游同源臂融合后連接T載體，測序正確后

8、與pGEM-7zf+載體連接,,基因突變株傳代10代進行遺傳穩(wěn)定,根據(jù)發(fā)表的枯草芽孢桿菌SacB基因序列設計引物，擴增目的基因,,,自殺質粒電轉化至布魯氏菌019株中，分別經過Amp抗性篩選和蔗糖敏感性篩選，獲得同源重組交換子,構建布魯氏菌同源重組自殺質粒pGEM-7zf+Δpgm-sacB,SacB基因與T載體連接，測序,,,,實驗方案,,,結果與分析,pgm-N基因的PCR 擴增圖,pgm-C基因的PCR 擴增圖,1、PCR擴增p

9、gm基因上下游同源臂,,,結果與分析,PMD19-T--Δpgm質粒酶切鑒定圖,pgm-N-C融合片段,2、PMD19T-Δpgm質粒構建,,,結果與分析,pGEM-Δpgm-SacB質粒酶切鑒定圖,SacB基因的PCR 擴增圖,3、pGEM-7zf+Δpgm-SacB質粒構建,結果與分析,019 Δpgm傳代圖,4、缺失株019Δpgm的遺傳穩(wěn)定性檢測,驗證結果表明：019 Δpgm具有良好的遺傳穩(wěn)定性,,,1.同源重組機制的分析

10、 本實驗結論：同源重組是整個環(huán)形質粒先線性化后插入布魯氏菌的染色體上，再進一步地進行基因置換。 2. 影響同源重組效率的因素 基因敲除過程中，電轉化是將外源基因導入到靶細胞內最常用的手段之一，受各方面的影響：如電壓、電擊時間、電擊杯厚度、質粒濃度、感受態(tài)細胞質量。 只有當這些條件均合適時才能達到最高的轉化效率，快速獲得基因缺失株。,討論,,,實驗三 布魯氏菌019Δpgm毒力變化

11、及初步免疫評價,小鼠實驗,,ELISA檢測血清中IgG的含量,,ELISA檢測小鼠血清中IFN-γ含量,實驗方案,M5-90、S2、019和019Δpgm,脾臟指數(shù),脾臟CFU計數(shù),,019、019Δpgm滅活佐劑的制備,,,毒力評價,,免疫效果評價,,,,,結果與分析,,1、小鼠脾臟指數(shù),結果顯示：布魯氏菌019?pgm與019無明顯（P>0.05），但顯著性高于布魯氏菌M5-90和S2組（P<0.05）。,,,結果與分析

12、,2、感染后小鼠脾臟CFU計數(shù),,結果顯示：019?pgm與親本株019無明顯差異（P>0.05），顯著性高于布魯氏菌M5-90和S2組（P<0.05）,,,結果與分析,3、體液免疫水平檢測-IgG,019?pgm滅活全菌佐劑制劑與親本株019滅活全菌佐劑制劑相比其IgG含量差異不顯著（P>0.05），隨之時間的延長，抗體水平呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)趨勢，但是，均顯著性低于疫苗株M5-90（P<0.05）。,,結果與分析

13、,4、細胞免疫水平檢測—IFN- γ,30天內019?pgm和019滅活全菌佐劑制劑相比，其IFN-γ含量差異不顯著（P>0.05），但均低于疫苗株M5-90（P<0.05）；在第30天，019?pgm活全菌佐劑制劑誘導產生的IFN-γ含量最低，顯著低于其他實驗組。,,,討論,1、 感染小鼠后毒力評價 019Δpgm相較與親本019株感染小鼠實驗結果顯示， 019Δpgm毒力沒有發(fā)生明顯下降，可能是由

14、于pgm基因并非布魯氏菌的主效毒力因子，或該基因在布魯氏菌內還有其他功能相近的基因共同發(fā)揮作用。,討論,,2、體液免疫水平分析 019?pgm組與親本株019組小鼠在感染初期第10天即可產生較高水平的 IgG，并在第20天后達到最高水平。 同時本研究中使用的完全弗氏佐劑，可以使抗原在體內緩慢釋放，延長與免疫細胞作用時間，并可有效誘導機體產生高滴度的抗體。,討論,,,3、

15、細胞免疫水平分析 IFN-γ是強有力的巨噬細胞活化因子，對于殺死胞內的布魯氏菌發(fā)揮巨大的作用。 細胞因子IFN-γ檢測結果表明，M5-90在誘導機體產生IFN-γ的能力強于019Δpgm和019全菌佐劑制劑，說明滅活疫苗在誘導細胞免疫方面仍然存在不足。,討論,1. 經紫外照射5min處理可有效降低布魯氏菌019毒力。2. 構建并篩選了019Δpgm缺失株，10代內未發(fā)生回復突變；其毒力與

16、親本株無明顯差異。3. 制備布魯氏菌019Δpgm滅活全菌佐劑制劑，初步免疫評價結果顯示：其可誘導產生一定水平的體液免疫和細胞免疫水平，但均低于M5-90弱毒苗。,四. 全文結論,本實驗構建了布魯氏菌019株pgm基因缺失株，并檢測了其毒力；并對其免疫效果進行了初步評價。,五. 論文創(chuàng)新,六. 文章發(fā)表,文章發(fā)表,六. 文章發(fā)表情況,李亞, 陳創(chuàng)夫, 張輝, 等. 流產布魯氏菌2308株磷酸甘露糖變位酶pmm基因缺失株構建及鑒定.西