藥物新劑型與新技術(shù)

1、基于雙能量共振轉(zhuǎn)移的腫瘤靶向診療前藥及其藥物監(jiān)測釋放和治療評價的研究,主講人：陳凱、李勇,,一、研究背景二、實驗部分,1、選題思路,腫瘤靶向藥物載體的構(gòu)建可以極大的提高抗腫瘤藥物的治療效果。然而，腫瘤區(qū)域的復(fù)雜微環(huán)境和腫瘤病人的個體化差異常導(dǎo)致標準化的治療方式的失效。為了滿足對腫瘤精確治療的更高要求，亟需要設(shè)計出集腫瘤靶向、診斷、成像、治療和預(yù)后為一體的多功能診療藥物載體。傳統(tǒng)的，通過修飾小分子配體或者通過納米粒子在腫瘤區(qū)域特有的增強

2、穿透和滯留 (EPR)效應(yīng)可以實現(xiàn)藥物載體對腫瘤組織的主動靶向或被動靶向。進一步的，從免疫細胞的腫瘤趨向性和腫瘤細胞的免疫逃逸的獨特性能中得到啟發(fā)，通過對藥物載體進行生物仿生功能化修飾甚至直接利用具有腫瘤趨向性的免疫細胞為載體將能構(gòu)建更為有效的腫瘤靶向診療系統(tǒng)。與此同時，利用能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)熒光成像技術(shù)和腫瘤細胞在治療過程中的信號轉(zhuǎn)換，可以實現(xiàn)對藥物分布、藥物釋放、實時響應(yīng)和治療效果等動態(tài)過程進行監(jiān)測，從而實現(xiàn)對腫瘤治療方式優(yōu)化

3、、劑量優(yōu)化、過程優(yōu)化的個性化治療方式。,2、腫瘤靶向方式,實現(xiàn)腫瘤靶向藥物傳遞的基本方式，包括 ERP 在內(nèi)的被動靶向，基于小分子配體、多肽、核酸適配子、抗體在內(nèi)的主動靶向，以及近年來被廣泛應(yīng)用的基于生物仿生的同源靶向和基于免疫細胞對腫瘤趨向性的腫瘤靶向。2.1增強穿透和滯留(EPR)效應(yīng)腫瘤的快速增長需要足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)，而腫瘤區(qū)域的血管生長過快，常表現(xiàn)出缺陷結(jié)構(gòu)，使得其具有增強的通透性。與此同時，由于腫瘤缺乏完整的淋巴系

4、統(tǒng)，會導(dǎo)致納米粒子在腫瘤區(qū)域有更常的滯留時間，以上現(xiàn)象統(tǒng)稱為 Enhanced Permeabilityand Retention (EPR)效應(yīng) ，導(dǎo)致納米粒子在腫瘤區(qū)域具有更強的富集現(xiàn)象。,EPR 效應(yīng)被廣泛的應(yīng)用到腫瘤靶向藥物傳遞體系之中，極大的增強抗腫瘤藥物治療效果的同時可以降低毒副作用。其中，以商業(yè)化的 Doxil ® 和 Abraxane ® 為例，通過將抗腫瘤化療藥物阿霉素(DOX)包載在聚乙二醇的脂質(zhì)

5、體中或者將抗腫瘤化療藥物紫杉醇(paclitaxel)通過白蛋白運輸，可以使抗腫瘤藥物在體內(nèi)的半衰期增長一百倍但是，基于 EPR 的被動靶向缺乏對腫瘤靶向的通用性，腫瘤區(qū)域血管的生成程度和血管中的孔隙大小與腫瘤的類型和腫瘤的狀態(tài)密切相關(guān)從而極大的影響腫瘤靶向效果。此外，由于納米藥物載體的表面修飾，導(dǎo)致納米藥物載體不能很好的與腫瘤細胞作用，從而影響到腫瘤細胞對藥物載體的內(nèi)吞 。雖然被動靶向可以增強藥物載體在腫瘤區(qū)域的富集，但卻不能進一步實

6、現(xiàn)對腫瘤細胞的靶向運輸。因此，為了增強藥物載體與腫瘤細胞的相互作用并且增強腫瘤細胞對藥物載體的內(nèi)吞，需要賦予藥物載體主動靶向的功能。,2.2 主動靶向,傳統(tǒng)的主動靶向方式按照靶向基團的類型可以分為小分子靶向，多肽靶向 核酸適配子靶向和抗體靶向 。治療藥物或者納米粒子表面修飾的靶向基團可以誘導(dǎo)其通過配體-受體作用特異性的向腫瘤細胞內(nèi)富集，從而提高腫瘤治療效果并降低對正常組織的傷害。另外，由于腫瘤細胞具有良好的免疫逃逸和同源靶向的能力，這些

7、特殊的性質(zhì)與腫瘤細胞細胞膜表面的抗原蛋白緊密相關(guān)。因此，近年來基于細胞膜的生物仿生材料被廣泛研究并用于提高藥物載體的血液循環(huán)時間和腫瘤靶向能力，并且，利用免疫細胞對腫瘤組織的趨向性，這些免2.2.1 小分子靶向由于其簡單的制備方法和結(jié)構(gòu)的多樣性，基于小分子的靶向基團在藥物載體中得到了極大應(yīng)用。其中，以葉酸和糖類為主的靶向基團得到了極大的研究 。葉酸與細胞膜表面的糖基磷脂酰肌醇相連的細胞膜糖蛋白有很高的親和力，而這種葉酸受體在諸如絨毛

8、膜癌、骨肉瘤、子宮肉瘤、腦膜瘤等腫瘤細胞中都有廣泛的表達，卻在絕大多數(shù)正常組織中沒有表達，而在諸如肺、腎、甲狀腺等器官中有較低的表達。值得注意的是，超過 90%的卵巢癌中被發(fā)現(xiàn)有葉酸受體的表達。因此，對藥物、熒光分子或者藥物載體修飾葉酸，可以極大的促進其向腫瘤和腫瘤細胞的靶向富集疫細胞的固有的腫瘤靶向能力同樣可以實現(xiàn)對腫瘤的靶向藥物傳遞。,,2.2.2 多肽靶向,多肽是一類具有良好生物相容性和生物活性的靶向小分子。其中，精氨酸-甘氨酸-

9、天冬氨酸(RGD)三肽序列是在細胞纖維連接蛋白中發(fā)現(xiàn)的。RGD 靶向肽可以有效地與靶向細胞外基質(zhì)中的 α v β 3 整合素識別和作用。而 α v β 3 整合素在諸如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、乳腺癌和前列腺癌中都有過度表達。因此，可以通過 α v β 3整合素與 RGD的相互作用實現(xiàn)腫瘤區(qū)域的靶向藥物傳遞和腫瘤治療。,2.2.3 抗體靶向,抗體靶向相比小分子和多肽靶向基團具有更高的選擇性和親和力。因此，諸Rituxan ® ，H

10、erceptin ® ，Avastin ® 和 Erbitux ® 在內(nèi)的諸多抗體已經(jīng)被美國 FDA 批準應(yīng)用于腫瘤治療。但是，抗體存在生產(chǎn)費用較高，并且在使用過程中可能會誘導(dǎo)人體的免疫響應(yīng)等問題。而通過抗體工程技術(shù)改造得到的片段或者嵌合抗體可以在一定程度上解決這個問題。,2.2.4 核酸適配子靶向,適配子是一種由 15-40 個堿基對組成的小分子核酸序列，它能夠高選擇性的與靶點配對并且形成三維折疊結(jié)構(gòu)。在

11、 1015個自由的核苷酸序列中，適配子都能對靶點堿基對都具有較高的親和力和特異性。而相對于抗體靶向來說，適配子具有諸如較低分子量、較低的免疫原性和易于制備等特點。其中，包括 Pegaptanib 和 AS1411 在內(nèi)的超過200 個靶向適配子被成功分離，用于臨床開發(fā)。,,但是，適配子作為靶向基團同樣具有一定的缺陷。其中，血液中的核酸酶對適配子的降解作用會導(dǎo)致其在血液中被快速清除，從而降低其靶向傳遞的能力。為了解決這個問題，對適配子進行

12、修飾可以極大的提高其在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，從而應(yīng)用到諸如抗腫瘤藥物的傳遞和熒光量子點的自組裝等應(yīng)用中。Kolishetti et al. 報道了利用 A10 適配子靶向前列腺癌細胞特異性膜抗原(PSMA)，從而實現(xiàn)對前列腺腫瘤細胞精確靶向協(xié)同治療。,2.2.5 仿生靶向,逃逸免疫系統(tǒng)的清除是腫瘤靶向藥物載體所面臨的一個重要挑戰(zhàn)。當(dāng)血液中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)皮系統(tǒng)或者血液中的單核吞噬細胞識別了外來的物質(zhì)，它們將通過先天的免疫系統(tǒng)將其清除。傳統(tǒng)的，通過

13、高分子材料對藥物載體進行修飾可以在一定程度上提高藥物載體在血液中的循環(huán)能力。但是，通過高分子修飾同樣可能會導(dǎo)致人體免疫系統(tǒng)的激活。眾所周知，腫瘤細胞具備逃逸免疫系統(tǒng)清除的能力和同源靶向的能力。腫瘤細胞的這些特殊功能與他們細胞膜表面表達的抗原蛋白緊密相關(guān)，而通過腫瘤細胞膜修飾的納米材料可以極大的復(fù)制腫瘤細胞表面抗原的多樣性，從而可以模仿腫瘤細胞免疫逃逸和同源靶向的功能 。,2.2.6 免疫細胞靶向,一般來說，藥物載體的設(shè)計需要考慮以下幾個

14、方面 ：1.藥物載體需要具有良好的生物相容性。2.藥物載體能夠有效的靶向腫瘤以提高抗腫瘤活性并降低毒副作用。3.藥物載體需要具備長血液循環(huán)時間，同時滿足良好的藥代動力學(xué)要求。4.在腫瘤區(qū)域有良好的控制釋放的性能。雖然傳統(tǒng)的藥物載體在藥物控制釋放上有較大的優(yōu)越性，可是卻不具備良好的生物相容性而容易被免疫系統(tǒng)清除。眾所周知，循環(huán)細胞具備逃避免疫系統(tǒng)清除的能力，因而在執(zhí)行為組織輸送養(yǎng)分、清除病原體或者監(jiān)視免疫系統(tǒng)的功能前能保持一定的惰

15、性，如下圖所示，通過結(jié)合傳統(tǒng)的藥物載體和循環(huán)細胞相結(jié)合可以獲得性能優(yōu)越的藥物載體。,二、實驗部分,基于雙能量共振轉(zhuǎn)移的腫瘤靶向診療前藥及其藥物監(jiān)測釋放和治療評價的研究,1.1合成 V-prodrug1.1.1FAM-GCSDEVDSKRGD 的合成,1.2 Apo-M 與 Mal-hyd-DOX結(jié)合,,將 Apo-M 和 Mal-hyd-DOX 在二甲基甲酰胺、二異丙基乙胺,通過巰基-馬來酰胺的加成反應(yīng),2、表征,3.1Caspase

16、-3 響應(yīng)性,Dabcyl 是一個廣譜的熒光猝滅劑 。在常見的分子信標和分子熒光探針Dabcyl能夠通過能量共振轉(zhuǎn)移高效地猝滅其臨近的熒光分子的熒光。在這個工作中，Dabcyl 被同時用作 DOX 和 FAM 的熒光猝滅劑。將 Apo-M 以 100 μM 的濃度溶解在 DMSO 中配制成母液，然后用 pH 為 7.4 的 PBS將濃度稀釋到 1 μM。最后，將 0.5 μM 的 Apo-M 分別和 100 pM，300 pM 的 c

17、aspase-3以及經(jīng)過 caspase-3 抑制劑 Ac-DEVD-CHO(50 μM)預(yù)處理 1 h 的 caspase-3 (100 pM)在 37℃條件下共培養(yǎng)。而溶液中的熒光強度隨時間的變化通過熒光光譜儀監(jiān)測。激發(fā)波長：465 nm。,3.2UV 和 DOX 誘導(dǎo)的凋亡成像,western blot（蛋白印跡分析法）,激光掃描共聚焦顯(CLSM)是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器。它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或

18、可見光激發(fā)熒光探針。利用計算機進行圖象處理，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖象,3.3 分子內(nèi) FRET 效應(yīng)的驗證,由于 V-prodrug 中 DOX 的釋放和 caspase-3 的激活是一個長期的過程，所以我們首先通過實驗驗證了 DOX 和 FAM 熒光的恢復(fù)是由于分子內(nèi)的 FRET 效應(yīng)的消失導(dǎo)致的。因為 FRET 效應(yīng)的發(fā)生需要熒光分子之間的距離在 10 nm 以內(nèi)，因此我們通過混合兩種熒光分子的辦法證明 V-prod

19、rug 分子中的 FRET 效應(yīng)。,3.5 V-prodrug 對腫瘤細胞的靶向性,流式細胞儀對前藥的內(nèi)吞,流式細胞儀（Flow cytometer ）是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來。,3.5 酸敏感釋放和藥物釋放監(jiān)測,3.6 亞細胞器分布,證明 V-prodrug 主要分布在腫瘤細胞的