環(huán)境未培養(yǎng)微生物資源的發(fā)掘與系統(tǒng)分類學(xué)研究.pdf

1、自然界中通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法只能得到微生物總量的0.01％-10％，而90％-99％的微生物處于活的但不可培養(yǎng)的(viable but non-culturable，VBNC)狀態(tài)，嚴(yán)重阻礙了人們對微生物資源的發(fā)掘及利用。研究表明通過復(fù)蘇促進(jìn)因子(resuscitation promoting factor，Rpf)和最大可能數(shù)法(most probable number，MPN)培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)合平板稀釋法可提高廢水等特殊污染環(huán)境中微生物

2、的分離豐度，VBNC菌群的形成是影響環(huán)境污染物質(zhì)生物降解成效的限制因子。本課題以難生物降解造成嚴(yán)重環(huán)境問題的制藥廢水為研究對象，探索制藥廢水中未培養(yǎng)或處于VBNC狀態(tài)細(xì)菌的組成，解明系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系，為揭示制藥廢水等特殊污染環(huán)境功能菌群的組成及利用提供新的途徑和科學(xué)依據(jù)。
　　首先對Micrococcus luteus IAM14879(=Micrococcus luteus NCIMB13267,藤黃微球菌)內(nèi)含有672bp的rp

3、f基因（對應(yīng)223個氨基酸）進(jìn)行克隆表達(dá)，純化后最終獲得了濃度為2mg/mL的Rpf重組蛋白，分子量為:29-30KDa，20％(BL21-rpf)工程菌摩爾濃度為1.63×104pmol/L?；诳寺〉腞pf重組蛋白添加進(jìn)MPN培養(yǎng)體系中，對制藥廢水樣品進(jìn)行VBNC資源菌的復(fù)蘇分離的可培養(yǎng)化研究。共獲得了28株細(xì)菌，其中23株屬于VBNC細(xì)菌，均登錄至國際基因庫DDBJ，由此建立起了一個小型制藥廢水VBNC菌種資源庫，且豐富了實(shí)驗室V

4、BNC菌種資源。所分離23株VBNC菌分屬14個屬:Aminobacter（氨基桿菌屬）、Xanthobacter（黃色桿菌屬）、Rhizobium（根瘤菌屬）、Alcaligenes（產(chǎn)堿桿菌屬）、Candidimonas（念珠菌屬）、Acidovorax（嗜酸菌屬）、Comamonas（叢毛單胞菌屬）、Pseudomonas（假單胞桿菌屬）、Enhydrobacter（嗜熱桿菌屬）、Pseudoxanthomonas（假黃單胞菌屬）

5、、Micrococcus（微球菌屬）、Microbacterium（微桿菌屬）、Leucobacter（亮桿菌屬）、Gordonia（戈登氏菌屬）。其中經(jīng)復(fù)蘇活化、達(dá)新種水平的VBNC菌株ZYSR67-ZT進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育特性、表型特征、生理生化特性、化學(xué)分類、基因型鑒定、DNA-DNA雜交等多相分類學(xué)及其系統(tǒng)學(xué)解析，并經(jīng)國際菌種保存機(jī)構(gòu)CGMCC和JCM保存(保藏號:CGMCC1.15498T，JCM31306T)。
　　研究表明菌