不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)

1、第六章 個(gè)別細(xì)胞和組織的培養(yǎng),,類型：正常細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng),第一節(jié) 正常細(xì)胞培養(yǎng),正常細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)都不易生長(zhǎng)，建立細(xì)胞系更難。正常細(xì)胞難培養(yǎng)的原因是它們是分化的細(xì)胞，對(duì)體外生存條件要求嚴(yán)格.但只要一切條件適當(dāng)仍有培養(yǎng)成功可能。,一、上皮細(xì)胞類培養(yǎng),上皮細(xì)胞可來(lái)源于外、內(nèi)、中三個(gè)胚層；培養(yǎng)中只有源于外和內(nèi)胚層的細(xì)胞能反映出上皮細(xì)胞的特征，細(xì)胞呈膜狀生長(zhǎng)的特點(diǎn)。,上皮細(xì)胞培養(yǎng)有三個(gè)難點(diǎn)：①需求特殊底物，如在底物上涂

2、有膠原底層則利于細(xì)胞生長(zhǎng)；②需求特殊培養(yǎng)基；③與上皮細(xì)胞相鄰的成纖維細(xì)胞常與上皮細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，并常壓過(guò)上皮細(xì)胞。純化和延長(zhǎng)上皮細(xì)胞生存期是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。,(一)表皮細(xì)胞培養(yǎng)1．特點(diǎn)：在有膠原的底物上易生長(zhǎng)；把人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3 細(xì)胞為飼養(yǎng)層(用射線照射后)上時(shí)，細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低pH、Ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。向培養(yǎng)基中加氫化可的松(10 μg/m1)、

3、10-6M的異丙基腎上腺素(Isoproterenol) 和10 ng/m1 促表皮生長(zhǎng)因子(EGF) 能促表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。,【飼細(xì)胞】飼細(xì)胞(Feeder Cells)也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過(guò)射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細(xì)胞附著底物的細(xì)胞層。飼細(xì)胞作用：有同化營(yíng)養(yǎng)液的能力。飼細(xì)胞能促克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，利于克隆的形成。克隆形成后飼細(xì)胞漸死亡，換液時(shí)清除。,飼細(xì)胞的制備：(1)取原代培養(yǎng)的人或動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞，90% 匯合

4、時(shí)制成細(xì)胞懸液，再按103 細(xì)胞/毫升重新接種培養(yǎng)；(2)在細(xì)胞半?yún)R合時(shí)，準(zhǔn)備0.25μg/ml 的絲裂霉素，按2ug/105 細(xì)胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過(guò)夜；或用射線單次照射，劑量30～50 戈瑞(Gy)；(3)細(xì)胞經(jīng)上述處理后，Hanks 液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24 小時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞制成懸液，按5×104/ml接種入新培養(yǎng)基中；(4)48 小時(shí)后，即可用于細(xì)胞克隆之用。,2．表皮細(xì)胞培養(yǎng)程序：(1) 取材

5、：取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成0.5 ~ 1cm2小塊；(2) EDTA 處理：先置入0.02％ EDTA 中室溫置5 分鐘。(3) 冷消化：換入0.25% 胰蛋白酶中，置4℃過(guò)夜；(4) 分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開(kāi)；,(5) 溫消化：取出表皮單獨(dú)處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30 ~ 60 分鐘；(6)制細(xì)胞懸液：用吸管輕

6、輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液；(7) 加培養(yǎng)液：通過(guò)80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸上清，直接加入Eagle 液和20％小牛血清.(8)培養(yǎng)：接種入碟皿中，CO2 溫箱培養(yǎng)。,注意事項(xiàng)：冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合松散；如冷消化后分離下來(lái)的表皮膜自身也已松散，此時(shí)亦可直接置入PBS 中用吸管吹打制備細(xì)胞懸液；不再經(jīng)過(guò)第二次消化。,(二) 胃上皮細(xì)胞培養(yǎng),適于胃上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的條件是：①膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法并用消化細(xì)胞；②應(yīng)

7、用膠原底物培養(yǎng)；③制備含有特定成分的培養(yǎng)基；,培養(yǎng)程序：(1) 取材：取胃潰瘍或胃癌手術(shù)切除胃標(biāo)本遠(yuǎn)端非病變區(qū)粘膜少許；(2) 清洗：用含慶大霉素(400μg/m1)和兩性霉素(2μg/m1 的Hanks)液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成1mm大??；(3) 消化：在I 型膠原酶和透明質(zhì)酸酶中，于37℃中消化80 分鐘；(4) 離心：收集細(xì)胞懸液，800 轉(zhuǎn)/分離心后，Hanks 液漂洗兩次；,(5) 接種：末次離心后加入含有1

8、％ ~ 2％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，接種入不同孔數(shù)的培養(yǎng)板中；接種量依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。?xì)胞接種后一般在16 小時(shí)內(nèi)貼壁，細(xì)胞呈多角形，成島狀或片狀生長(zhǎng)，以后逐漸聯(lián)接成片。初代培養(yǎng)可維持2 ~ 3 周，第一周末達(dá)高峰，最后逐漸衰退剝落。,(三) 肝細(xì)胞培養(yǎng),肝臟具有取材方便和易于生長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，能獲得典型上皮細(xì)胞培養(yǎng)。1．初代組織塊培養(yǎng)：肝組織做組織塊培養(yǎng)效果很好。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝剪成1mm3 左右

9、的小塊，采用貼壁培養(yǎng)法。肝組織易于貼壁，生長(zhǎng)力好，一般次日即可出現(xiàn)生長(zhǎng)暈。,2．初代消化法培養(yǎng)：(1) 把肝組織切成2 ~ 4 立方毫米的小塊，用不合鈣鎂的BSS 液洗兩次；(2) 移入1:1 的0.1％胰蛋白酶和0.1％膠原酶(都用無(wú)鈣鎂BSS 配制) 中，4℃冷消化10 ~ 12 小時(shí)后，通過(guò)250 微米和64 微米尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)(用紗布濾過(guò)亦可)；(3) 收集細(xì)胞、BSS 液洗1 ~ 2 次、計(jì)數(shù)、接種培養(yǎng)；,3．肝

10、臟灌流法：需用全肝，以較小動(dòng)物如小鼠和大鼠為好。(1) 無(wú)菌解剖動(dòng)物，取出肝臟，先用BSS 洗除血污；(2) 取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器頭輕輕插入肝管中，用線繩結(jié)扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入膽管系統(tǒng)，并不時(shí)輕柔壓肝臟，以便消化液進(jìn)入肝小葉中； 消化液在肝內(nèi)停留20~ 30 分后，在吸出消化液的同時(shí)并輕柔壓肝臟，以使肝細(xì)胞脫落和消化液吸出；,(3) 待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心分離，用

11、RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)(較其它培養(yǎng)基為好)，能獲得較純的肝上皮細(xì)胞和獲較好的效果。,(四) 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng),應(yīng)用材料：人臍帶臍靜脈、動(dòng)物大動(dòng)脈等，用灌流消化法獲取細(xì)胞最為簡(jiǎn)便。,(1)取產(chǎn)后的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)可保存于4℃中，但不宜超過(guò)12 小時(shí)；無(wú)菌剪取長(zhǎng)10 ~ 15 厘米一段。 其它如胚胎和幼體動(dòng)物的大血管，亦可用于培養(yǎng)；(2) 先用三通注射器吸溫PBS 液注入臍帶的臍靜脈中，洗除殘血；注入口處宜用線繩

12、結(jié)扎，以防液體返流；,(3) 用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為0.1％的膠原酶，待末端出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿血管，注入口亦應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，消化3 ~10 分鐘；(4) 吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，注入離心管中；為獲取更多細(xì)胞，可再注入溫PBS 沖洗2 ~ 3 次徹底清除干凈殘余細(xì)胞，一并注入離心管中離心；(5) 吸除上清，加1640 培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，接種入瓶皿中培養(yǎng)，順利時(shí)2 ~ 3 天內(nèi)細(xì)胞即可

13、長(zhǎng)成單層。,人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細(xì)胞生長(zhǎng)后，一般傳6 ~ 7 代后即衰退，難以長(zhǎng)期維持。用兔血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)較好，可傳10 ~ 30 代；不同部位血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，對(duì)各種作用因素反應(yīng)亦有很大差別。,(五) 毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng),毛細(xì)血管細(xì)小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，內(nèi)皮細(xì)胞外有較多的結(jié)締組織，進(jìn)行分離培養(yǎng)有很大困難。近年毛細(xì)血管培養(yǎng)已獲成功；利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌組織(如卵巢癌) 等均可；,1．材料：[腫瘤條

14、件培養(yǎng)基制備](1) 取C3H 小鼠的S-180 實(shí)體肉瘤組織；(2) 胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良Eagle 氏培養(yǎng)液15m1 (含10％小牛血清) 種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；,(3) 在細(xì)胞生長(zhǎng)接近完全匯合時(shí)，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；再用含10％小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條件培養(yǎng)基；(4) 4000 轉(zhuǎn)／分離心后，再通過(guò)0.22μm 微孔濾膜濾過(guò)，-20℃凍存?zhèn)溆?臨用前融解)。[凝膠底層制備](

15、1) 取60 mm Falcon 產(chǎn)培養(yǎng)皿，加1% Difco 產(chǎn)明膠(用不合鈣和鎂的Hanks 液配制)，鋪蓋瓶底，形成薄層；(2) 置4℃過(guò)夜；用前再用少許培養(yǎng)液沖洗一次。,2．初代培養(yǎng)(1) 取材：取新鮮牛腎上腺數(shù)個(gè)，先用Hanks 液洗除血污；(2) 消化：剝除被膜，分離出皮質(zhì)，切成l mm3 小塊，加0.5％膠原酶室溫中消化1 小時(shí)；每隔10 分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；(3)過(guò)濾：通過(guò)不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)，網(wǎng)眼要求只允許

16、能通過(guò)小于110 微米長(zhǎng)的毛細(xì)血管小段；(4)離心：650 rpm，4℃，離心7 分鐘后，棄掉上清膠原酶；,(5)再離心：沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次；(6) 制細(xì)胞懸液：末次沉淀物仍用含10％小牛血清的Dulbecco 改良Eag1e 氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打；(7)接種：接種入鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)；在培養(yǎng)頭1 ~ 3 小時(shí)中，毛細(xì)血管小段和內(nèi)皮細(xì)胞最先貼附于底物上，而腎上腺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞卻仍在

17、培養(yǎng)液中漂?。?8)換液：吸除培養(yǎng)液，再加入腫瘤條件培養(yǎng)液；每?jī)商鞊Q液一次。毛細(xì)血管小段一般成自1 ~ 4 個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，以后每個(gè)小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細(xì)胞島，能持續(xù)2 ~ 5 天。,3．毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)：(1) 初代培養(yǎng)2 ~ 3 天后，鏡下確認(rèn)幾個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃圈圈起；(2) 鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，可用顯微細(xì)針在倒置顯微鏡下挑除；用細(xì)胞解剖器也可，宜在凈化臺(tái)無(wú)菌氣流中

18、、打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋進(jìn)行，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)(15 ~ 20 分鐘)；圈外非內(nèi)皮細(xì)胞可用無(wú)菌膠刮刮除；,(3) 用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞；(4) 剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如小(5 ~ 20 個(gè)細(xì)胞) 而少時(shí)，生長(zhǎng)增殖常變得緩慢或完全不生長(zhǎng)，此時(shí)需加入3T3等飼細(xì)胞；飼細(xì)胞接種量為4000 細(xì)胞／cm2；(5) 當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基；(6) 接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)(飼細(xì)胞死亡被淘汰)，細(xì)胞

19、增殖生長(zhǎng)匯合后，按1:5 傳代。,二、結(jié)締組織類細(xì)胞培養(yǎng),(一) 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)包括人在內(nèi)的各種成纖維細(xì)胞都很容易培養(yǎng)，也是其它組織培養(yǎng)時(shí)的副產(chǎn)物，極易獲得。用人或動(dòng)物胚體為好；動(dòng)物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒包皮是培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的很好對(duì)象。,小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)條件,12.5~14.5d胎齡的小鼠胎兒分離效果最好；最佳培養(yǎng)基為DMEM添加15%小牛血清；第3代細(xì)胞增

20、殖最旺盛；室溫條件下，0.125%胰蛋白酶消化時(shí)間以8~10min為宜。在培養(yǎng)ES細(xì)胞時(shí)，應(yīng)選擇第3~5代的小鼠成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。,,小鼠成纖維細(xì)胞；細(xì)胞來(lái)源：swiss小鼠胚胎,(二) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。但屬不繁殖型細(xì)胞群，難以長(zhǎng)期生存，好的條件下僅能生活2 ~ 3周，因之多用作初代培養(yǎng)。巨噬細(xì)胞也能

21、建成無(wú)限細(xì)胞系；大多來(lái)自小鼠，如P388D-1、J774A．1、RAW309、Cr. 1 等。,1．培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)：[來(lái)源和取材] 巨噬細(xì)胞可來(lái)源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。實(shí)驗(yàn)多從動(dòng)物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動(dòng)物腹腔取材最常用。用40μg 的PHA 注入腹腔中，能產(chǎn)生6 ~ 8×106 個(gè)細(xì)胞，而且無(wú)刺激性，效果較好。,2．培養(yǎng)方法：培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各種方法和各種來(lái)源獲取細(xì)胞，其中以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用

22、。人的材料除來(lái)源不同外，培養(yǎng)方法大同小異。[程序](1) 實(shí)驗(yàn)前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無(wú)菌硫基乙酸肉湯1ml (勿注入腸內(nèi))；(2) 引頸殺死動(dòng)物；手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中3 ~ 5 秒；(3) 置動(dòng)物于解剖臺(tái)上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開(kāi)皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；(4) 再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中，同時(shí)從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)；,

23、(5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動(dòng)物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)；(6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中， (4℃)離心10 分鐘后，去上清，加10 ml Eagle 培養(yǎng)基；(7) 計(jì)數(shù)細(xì)胞，每只小鼠可產(chǎn)生20 ~ 30×106 細(xì)胞，其中90％為巨噬細(xì)胞；(8) 為獲取3×105 個(gè)貼附細(xì)胞／平方厘米，需接種2.5×106／m1；(9) 為純化培養(yǎng)細(xì)胞，去除其它白細(xì)胞，接種數(shù)

24、小時(shí)后，去除培養(yǎng)液，用Eagle 液沖洗1 ~ 2 次后，再加新Eagle 培養(yǎng)液置37℃ CO2 溫箱中培養(yǎng)。,三、肌組織細(xì)胞培養(yǎng),以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實(shí)用。(一) 骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物胚或幼體的大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料。取材常用生后1 ~ 2 天的乳鼠(Wistar 大鼠更好)。(1) 取材：殺死動(dòng)物，無(wú)菌取大腿肌組織，切成0.3 ~ 0.5 厘米小塊；(2)消化：用不含鈣鎂離子的Hanks 液配的0.25％胰蛋白酶消化，

25、無(wú)菌紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)，合成培養(yǎng)基加10％小牛(或馬)血清培養(yǎng)，為促進(jìn)分化可加1％ 的胎汁；,(3)接種：細(xì)胞接種量為2×106/皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化。明膠制備比較簡(jiǎn)單，常用Hanks 液配的0.01％明膠。生長(zhǎng)特點(diǎn)：細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始呈紡錘形，培養(yǎng)50 ~ 52 小時(shí)后將出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時(shí)能觀察到橫紋。一般在融合后二三天內(nèi)能見(jiàn)到收縮現(xiàn)象；因收縮運(yùn)動(dòng)有時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞從底物脫離。,(

26、二) 心肌細(xì)胞培養(yǎng),最常用材料：雞胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎兒心肌等都可應(yīng)用。心肌是比較容易培養(yǎng)和生長(zhǎng)的組織，可應(yīng)用多種方法進(jìn)行培養(yǎng)，如懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法等，主要取心室肌培養(yǎng)，均能獲得良好的生長(zhǎng)效果。,[程序](1) 選新鮮受精雞卵，置溫箱中孵育(溫箱中放有水槽，以維持箱內(nèi)濕度)；每日翻動(dòng)一次(180 度)，孵育9 ~ 12 天；(2) 取雞胎；(3) 用眼科剪剪開(kāi)胸腔，剝出心臟，置入皿中用Hanks 液漂洗1

27、~ 2 次；(4) 小心剪除大的動(dòng)靜脈，保留心室??；用組織塊或消化培養(yǎng)法均可。初代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，純化及生長(zhǎng)特點(diǎn)：常雜有成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；心肌細(xì)胞亦較其它成分貼壁慢，可反復(fù)貼壁法排除其它細(xì)胞成分。在培養(yǎng)成功時(shí)，相差顯微鏡下可觀察到橫紋；一周后便可出現(xiàn)節(jié)律性收縮現(xiàn)象。,,乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng),,四、神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)神經(jīng)組織主要由兩種神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）組成。神經(jīng)元為高度分化的細(xì)胞，在組織發(fā)生晚期已失掉增殖能

28、力，對(duì)生存條件要求高，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或在加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF) 和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，才能生存，并可能出現(xiàn)一定程度的分化現(xiàn)象，如長(zhǎng)出突起等，但卻難使之增殖；即使培養(yǎng)胚胎組織情況也是如此。,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為較易培養(yǎng)成分，它分少突、星形和小膠質(zhì)三種。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元有共存關(guān)系。,人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞,大鼠c6膠質(zhì)細(xì)胞,(一) 初代培養(yǎng) 神經(jīng)元能發(fā)生一定分化現(xiàn)象，如生長(zhǎng)突起，但因無(wú)增殖能力，最后衰退死亡；但神經(jīng)膠質(zhì)尤

29、以星形細(xì)胞能繼續(xù)生存和分裂增殖。(二) 傳代培養(yǎng) 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞并可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。,(三) 培養(yǎng)方法人腦組織可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)組織來(lái)自手術(shù)室無(wú)菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)均可用于培養(yǎng)，1．程序：(1) 細(xì)胞懸液制備：獲取腦組織后，先仔細(xì)剝除腦膜和血管等纖維成分，置入Hanks 液中漂洗1 ~ 2 次后，置于30 ~ 50倍的Hanks 液中；腦組織比較柔軟，

30、反復(fù)吹打即可制備成細(xì)胞懸液；(2) 排除脂肪成分和其它碎塊：把懸液注入離心管中，在室溫直立5 ~ 10 分鐘后，細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊自然下沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如此反復(fù)二三次可獲較多的細(xì)胞成分；,(3)濾過(guò)、計(jì)數(shù)、接種：向末次沉降物中加入適量營(yíng)養(yǎng)液，通過(guò)紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整好細(xì)胞密度，接種入培養(yǎng)瓶或皿中，置5％C02 溫箱中培養(yǎng)；(4)傳代：細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后，可用0.25％胰蛋白酶消化法做傳代處理。,2．生長(zhǎng)特

31、點(diǎn)：接種后初期，細(xì)胞可能出現(xiàn)飄浮不貼壁現(xiàn)象，貼壁后在短期內(nèi)也可能不見(jiàn)細(xì)胞分裂現(xiàn)象；細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過(guò)程較長(zhǎng)，然而一旦生長(zhǎng)后，即能進(jìn)入較旺盛的增殖狀態(tài)。生長(zhǎng)開(kāi)始常雜有巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，逐漸形成均一的星形膠質(zhì)細(xì)胞，一般形成連接不甚緊密的單層細(xì)胞,第二節(jié) 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng),腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究

32、癌變機(jī)理、抗癌藥檢測(cè)、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。,培養(yǎng)方法腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面。初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。一、要點(diǎn)1．取材：人腫瘤細(xì)胞來(lái)自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材時(shí)盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。,2．培養(yǎng)基：腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的RPMI l640、DMEM、Mc-Co

33、y5A 等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)血清的需求比正常細(xì)胞低，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大。培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長(zhǎng)因子培養(yǎng)更易成功。,3．成纖維細(xì)胞的排除：成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。,成纖維細(xì)胞排除法,1．機(jī)械刮除

34、法：是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)，或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序?yàn)椋?1) 標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的部位；(2) 刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記空間；(3) 用Hanks 液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；(5) 注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至

35、完全除掉為止。,2．反復(fù)貼壁法：根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液， (1) 細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2 次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；(2) 編號(hào)為A、B、C 三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A 培養(yǎng)瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng)5—20 分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B 培養(yǎng)瓶中后；向A 瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置

36、溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(3) B瓶中細(xì)胞5~20 分鐘后，按處理A 的方法，把培養(yǎng)液注入C 培養(yǎng)瓶中；再向B 瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。,當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見(jiàn)A 瓶主要為成纖維細(xì)胞，B 瓶?jī)深惣?xì)胞相雜，C 瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。,3．消化排除法：(1) 先是用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA (1:1) 混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)

37、消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來(lái)后，便立即停止消化；(2) 把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶?jī)?nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落，經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。,4．膠原酶消化法：本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。(1) 可用0．5mg／ml 的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，

38、當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化；(2) 用Hanks 洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞末被除凈，可再次重復(fù)。,5．其它方法：有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025 ~ 1.085 的密度梯度離心液，加入細(xì)胞懸液后，在23℃中800g 離心10 分鐘。在比重1.025 ~ 1.050 層為成纖維細(xì)胞，在比重1.065 ~ 1.085 層為上皮細(xì)胞，再

39、經(jīng)過(guò)分離進(jìn)行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD 抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。選用上述任何一種方法，都需進(jìn)行試驗(yàn)，取得必要經(jīng)驗(yàn)，找出適合的條件，才能獲得好的效果。,二、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長(zhǎng)率措施1．適宜底物：如：把經(jīng)過(guò)純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等。2．生長(zhǎng)因子：應(yīng)用促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促生長(zhǎng)物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及