2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第二節(jié) 重組體導(dǎo)入受體細胞的原理與技術(shù),一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法 二、重組DNA導(dǎo)入真核細胞的方法 三、轉(zhuǎn)化率及影響因素,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,相關(guān)概念 1.轉(zhuǎn)化(transformation)   細菌獲得外源質(zhì)粒DNA,產(chǎn)生新的遺傳性狀的過程?!?.轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)   以噬菌體為媒介,將外源DNA導(dǎo)入細菌的過程?!?.轉(zhuǎn)染 (transfection)   指

2、感受態(tài)的受體細胞捕獲和表達以噬菌體為載體的重組DNA分子的過程?!∞D(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染的區(qū)別   轉(zhuǎn)導(dǎo):通過λ噬菌體(病毒)顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA轉(zhuǎn)移到受體細胞的過程。    轉(zhuǎn)染:λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細胞的過程。,(一)轉(zhuǎn)化(transformation),(1)熱激法(heat shock),(2)電轉(zhuǎn)化法(electronporation),(3)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,(4)接合轉(zhuǎn)化,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿

3、菌的方法,1、化學(xué)轉(zhuǎn)化法    感受態(tài):細菌能從周圍環(huán)境中吸收DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)(competence).    感受態(tài)的出現(xiàn)是由于細菌表面出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點,這些位點只能與雙鏈DNA結(jié)合,而不與單鏈DNA結(jié)合。 這說明完整的雙鏈結(jié)構(gòu)對于轉(zhuǎn)化活性來說是必要的。   對于大腸桿菌細胞,一般采用CaCl2溶液來處理受體細胞,增加細胞膜的通透性,制備感受態(tài)細胞。,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌

4、的方法,細菌感受態(tài)細胞的制備過程,培養(yǎng)大腸桿菌,OD600至0.3-0.4,On ice 5-10 min,4℃離心收集菌,用冰冷的60mMCaCl2重懸,4℃離心收集菌,4℃離心收集菌,分裝、-70 ℃凍存,用冰冷的60mMCaCl2重懸,On ice 30 min,用冰冷的60mMCaCl2重懸,,,,,,,,,,,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,重組體導(dǎo)入受體細胞,10ng載體DNA,100?L感受態(tài)菌,On ice混合,靜置

5、30分鐘,37℃搖1小時,10-100?L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板,,,,,,,吸附DNA,攝入DNA,加入1mL LB培養(yǎng)基,42ºC 1.5分鐘,熱休克法,簡單,但轉(zhuǎn)化效率不高(106-108/?gDNA)。,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌,10-100?L轉(zhuǎn)化液,涂于含抗菌素的平板,37℃過夜,,,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,2.電擊轉(zhuǎn)化法   將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?;駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化

6、儀的樣品池中,兩極施加高壓電場。 在強大電場的作用下,細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙,質(zhì)?;駾NA重組分子便可進入細胞內(nèi)   原理:  用高壓脈沖電流擊破細胞膜或擊成小孔,使各種大分子(包括DNA)通過這些小孔進入細胞.,轉(zhuǎn)化效率高(高于109/?gDNA),一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6,冰浴15分鐘,2℃離心集菌,冰冷的水重

7、懸菌體,2 ℃離心集菌,冰冷的水重懸菌體,2 ℃離心收集菌體,少量冰冷的水重懸,分裝成 50-300?L,電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25?F,脈沖控制器200-400?,0.5?g質(zhì)粒DNA,On ice混合,加入1mLSOC培養(yǎng)液,37 ℃中速震蕩60分鐘,10-100?L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板,轉(zhuǎn)化,,,,,,,,,,,,,,,電擊轉(zhuǎn)化法,(二) 轉(zhuǎn) 導(dǎo),由噬菌體和細胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息的轉(zhuǎn)移過程,(三) 轉(zhuǎn) 染,噬菌體DNA不經(jīng)過蛋

8、白包裝成病毒顆粒,直接被感受態(tài)細胞捕獲的過程。,與轉(zhuǎn)化無本質(zhì)區(qū)別,體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌,形成噬菌斑。每?g ?DNA能形成106個噬菌斑,現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動物細胞的過程也稱轉(zhuǎn)染,體外包裝過程,二、重組DNA導(dǎo)入真核細胞,(一)導(dǎo)入酵母細胞,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化堿金屬離子介導(dǎo)的完整細胞轉(zhuǎn)化PEG1000轉(zhuǎn)化法電擊法,(二)導(dǎo)入植物細胞,(三)導(dǎo)入動物細胞,1. 利用原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化,酵母,原生質(zhì)體,感受態(tài),酶去壁,CaCl

9、2 PEG,插入外源基因的載體,,,轉(zhuǎn)化,,轉(zhuǎn)化細胞達原生質(zhì)體總數(shù)的1%~2%,轉(zhuǎn)化率受再生率影響共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%~33%,酵母,0.1mol/L LiCl 處理,,感受態(tài),2. 堿金屬離子介導(dǎo)的完整細胞轉(zhuǎn)化,,熱激,,,涂布選擇性平板,篩選轉(zhuǎn)化子,吸收線性DNA能力明顯大于環(huán)狀DNA,兩者相差80倍轉(zhuǎn)化率:103個 / ?g DNA;共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少,4. 電擊轉(zhuǎn)化,(1)適于原生質(zhì)體和完整細胞(2)轉(zhuǎn)化

10、率高,105個 / ?g DNA(3)單鏈轉(zhuǎn)化率高于雙鏈,3. PEG1000轉(zhuǎn)化,PEG處理酵母細胞,可獲得類感受態(tài),用于轉(zhuǎn)化,二、重組DNA導(dǎo)入真核細胞,(一)導(dǎo)入酵母細胞,載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(農(nóng)桿菌介導(dǎo))DNA直接導(dǎo)入(基因搶法、電擊法等)種質(zhì)系統(tǒng)法(花粉管通道法等),(二)導(dǎo)入植物細胞,(三)導(dǎo)入動物細胞,(二)導(dǎo)入植物細胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,將目的基因插入到載體的T-DNA區(qū),形成重組DNA,(二)

11、導(dǎo)入植物細胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,將重組DNA轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌,(二)導(dǎo)入植物細胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,通過農(nóng)桿菌侵染植物外植體,(二)導(dǎo)入植物細胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,將含有外源目的基因的T-DNA整合到植物細胞基因組中,獲得轉(zhuǎn)基因植株,在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng)2天,葉盤法的具體操作,又稱生物彈擊法、微彈轟擊法,借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細胞的轉(zhuǎn)化技

12、術(shù)。,金屬微粒加速,進入受體細胞,2. 基因槍法(gene gun),基因槍,具體操作,植物細胞,原生質(zhì)體,,纖維素酶和果膠酶,DNA,混合入電擊緩沖液,,,,電擊處理,愈傷組織,,幼苗,分化,,3. 電擊法(電穿孔法),選擇培養(yǎng),二、重組DNA導(dǎo)入真核細胞,(一)導(dǎo)入酵母細胞,1. 磷酸鈣沉淀法2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法3. 顯微注射法4. DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法,(二)導(dǎo)入植物細胞,(三)導(dǎo)入動物細胞,原理:,(三)導(dǎo)入動物細胞,

13、1. 磷酸鈣沉淀法,通過磷酸鈣-DNA共沉淀,將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎?依據(jù)不同的細胞類型,平皿上最多能有10%的細胞能吸收DNA沉淀。,操作簡便,成本低廉、可大批量轉(zhuǎn)染、對細胞毒性小、效果穩(wěn)定,但轉(zhuǎn)染效率低。,2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法,脂質(zhì)體包埋DNA,通過細胞膜進入細胞。,脂質(zhì)體(lipofectin)載體法,應(yīng)用玻璃顯微注射器,直接把外源DNA注射到宿主細胞核里,使其整合到染色體上。,3. 顯微注射法,1)外源基因制備:線性化

14、的質(zhì)粒或目的片段2)收集受精卵:受孕后幾小時內(nèi)3)顯微注射:將外源基因注入受精卵的雄原核4)受精卵移植,顯微注射法(microinjection),二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖為多聚陽離子試劑,能促進哺乳動物細胞攝入外源DNA。,4. DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法,,葡聚糖,葡聚糖,,,DEAE-dextran,外源DNA,細胞,混合,,,,DEAE-dextran對細胞有毒,常采用低濃度長時間處理,吸附到細胞表面后被細胞吞入,部分D

15、NA可以進入到細胞核里。,4. DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法,導(dǎo)入外源DNA的幾種方法,三、轉(zhuǎn)化率及影響因素,轉(zhuǎn)化率(cfu / μgDNA):每微克重組DNA轉(zhuǎn)化后,接納DNA分子的受體細胞的個數(shù),即陽性克隆數(shù)。,(一)轉(zhuǎn)化率的計算:,轉(zhuǎn)化率 = 產(chǎn)生菌落的總數(shù) / DNA的加入量,三、轉(zhuǎn)化率及影響因素,例:取1μl(0.1 ng/μl)完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100μl的感受態(tài)細胞。向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入900μl培養(yǎng)液,讓細菌恢復(fù)一小段時間,取10

16、0μl鋪板。培養(yǎng)過夜,產(chǎn)生1000個菌落,轉(zhuǎn)化率為多少?,轉(zhuǎn)化率=1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /μg,三、轉(zhuǎn)化率及影響因素,例:某一DNA重組實驗的重組率為20%,轉(zhuǎn)化率為107 cfu / mg 天然載體,經(jīng)酶切和連接處理后的重組載體轉(zhuǎn)化率比天然載體約低100倍,欲獲得104個重組克隆,需要投入多少重組載體DNA進行重組實驗?,104 = 107 cfu / mg ×10-2 × a

17、× 20% 重組載體 a = 0.5 mg,三、轉(zhuǎn)化率及影響因素,普通的亞克隆實驗:1×10 6 cfu/μg DNA;更復(fù)雜的亞克隆:1×107 cfu/μg DNA,如有限量的DNA的轉(zhuǎn)化,T-A克??;構(gòu)建文庫:> 1×108 cfu/μg DNA。,1)載體DNA類型、大?。恢亟MDNA濃度、純度2)受體細胞3)轉(zhuǎn)化方法:同一轉(zhuǎn)化方法技術(shù)參數(shù)影響轉(zhuǎn)化率,(二)轉(zhuǎn)化率的影響因素,

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