石蠟切片技術-顯微鏡門戶-中國顯微圖像網(wǎng)

1、顯微標本制作技術,河北大學細胞生物學實驗室,一、實驗原理,顯微標本的制作技術是組織學，胚胎學，生理學及細胞學等學科研究觀察細胞、組織的生理、病理形態(tài)變化的一種主要方法。大多數(shù)的生物材料，在自然狀態(tài)下是不適合顯微觀察的，也無法看到其內(nèi)部結構。因為材料較厚，光線不易透過，以致不易看清其結構，另外細胞內(nèi)的各個結構，由于其折射率相差很小，即使光線可透過，也難以辯明。但在經(jīng)過固定，脫水，透明，包埋等手續(xù)后就可把材料切成較薄的片子，再用不同的染色方

2、法就可以顯示不同細胞組織的形態(tài)及其中某些化學成份含量的變化，就可以在顯微鏡下清楚的看到其中不同的區(qū)域組分狀態(tài)，切片也便于保存，所以是教學和科研中常用的方法。,二、實驗方法,生物顯微制片有許多不同的方法，一般可分為非切片法與切片法兩大類： 非切片法有涂片、鋪片、壓片、磨片、整裝片等。 切片法又包括石蠟切片法、火棉膠切片法、冰凍切片法等。 顯微制片技術雖是生物學中很基本的操作技術，但由于生物材料的個體差異，化學

3、試劑的多樣性，因此操作技術相當細致而復雜，方法也很多，每一步驟的失誤都可導致整體的失敗，因此需要耐心細致，不斷總結經(jīng)驗，才能得到較好的結果。,即不用切片機，不經(jīng)切片手續(xù)而制成切片的方法，根據(jù)材料性質(zhì)的不同，有不同的處理方法，該類方法操作簡單快捷，其中鋪片法，封藏法可使原有組織結構不被破壞，涂片法，壓片法彌補了用包埋，切片法所不可能觀察清楚的不足，因此是顯微標本制備的中常用的手段。 1.1 涂片法 主要用于血液、精液、尿液、痰

4、液、微生物等不能切片成薄片的液態(tài)顆粒性材料，可在載玻片上涂成單層細胞，再經(jīng)固定，脫水，染色等手段制成永久標本。,1、非切片法,1.2 鋪片法 主要用于動、植物組織的表皮層觀察，可活體取待觀察動、植物組織，用尖鑷子撕去一層表皮，迅速平鋪在載玻片上。 如: 洋蔥表皮細胞的鋪片制備。1.3 壓片法 一些較幼嫩，柔軟的材料可將其置載玻片上，用小解剖刀將其分散，加染料一滴，再蓋上蓋玻片，用拇指垂直用力擠壓，使組織散成一薄片，

5、再進行觀察，如植物根尖觀察染色體，花粉粒觀察發(fā)育階段等。,1.4 離析法 該方法是利用化學試劑使組織的細胞間質(zhì)溶解，使細胞能分散成單個個體。經(jīng)染色，脫水，透明即可觀察其個體形態(tài)，適用于肌肉，葉片，莖等部位。1.5 磨片(Ground section) 用于很堅硬的組織，如骨和牙。,2 、切片法 切片法是必須依靠手或切片機將組織切成薄片來進行觀察的方法，為了能清晰地觀察到動、植物的組織結構及細胞形態(tài)，必

6、須先經(jīng)過一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬以利于切成薄片，根據(jù)所用支持劑的種類不同，可分為徒手切片法，石蠟切片法，火棉膠切法，冰凍切片法等類型，切成薄片后還需要去蠟，染色，脫水，透明等步驟，將其制成永久標本。 下邊以石蠟切片為例，介紹顯微標本的制備方法。,2.1 取材 根據(jù)不同的實驗目的，選擇相應的材料，材料要求新鮮、準確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。 所采集材料應立即放入固定劑，并編號

7、，注明采集時間、地點、名稱、組織部位，所取組織塊要大小適當，即要能說明問題，又要考慮固定劑的穿透能力。 一般組織學取材稍大，細胞學取材稍小，植物組織取材稍小，動物組織取材要稍大。,2.1.1動物的麻醉和殺死 從活的動物體上采取材料不象采集植物材料那么容易，因為在不施加麻醉的情況下，有的動物會收縮(如蚯蚓、水蛭)，有的會騷動(如蛙、鼠)，使我們無法下手。但制片所需的材料又要求越新鮮越好，尤其是細胞學方面的研究對材料的新

8、鮮程度要求更嚴。因此，要割取生活著的動物組織，在一般情況下，就要對動物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉藥品，必須以不影響細胞結構為原則。,若是一般的組織學制片，要求不太嚴格的話則可將動物先殺死然后速取其組織進行固定。蛙、蟾蜍、鼠等較小的動物，可用斷頭法殺死，即用普通剪刀剪斷頸部。較大的動物，如大竺鼠、免、貓等可用木槌猛擊頭后部，使其昏倒，或用50m1的注射器從耳靜脈向心臟注入空氣，使動物發(fā)生急性空氣栓塞痙攣而死。,上述

9、動物若需麻醉后取材，則可用脫脂棉球蘸氯仿或乙醚、置于動物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大動物(狗、猴等)應用氨基甲酸乙酯作靜脈注射麻醉．劑量一般為每kg動物體重用1 g。麻醉后的動物也需放血后進行取材固定。 昆蟲等小動物可投入充滿氯仿或乙醚蒸氣的大口瓶中，令其麻醉。若要殺死，可將其投入含氰化鉀的毒瓶中。,2.1.2動物組織塊的切割 割取動物組織塊時，需注意以下幾點： 第一，要考慮所取的材料應包括各臟器的重要結構或全部

10、結構，如消化管就應包括粘膜、粘膜下層、肌層和外膜四層結構。若所取的器官太大，不易全部制片時，則可切取能代表該器官的部分材料，如狗的腎臟，可切取包括皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂的一部分為材料。 第二，應注意切割方向．如在管狀器官(腸等)取材時，一般是取其橫切面制片，但要觀察小腸的環(huán)行皺壁時，就應取其縱切面制片。,第三，組織塊必須切得小而薄。細胞學制片的組織塊不能超過2mm，一般組織塊的大小以0.5*0.5*0.2cm為宜，柔軟組織不易切小,

11、可先取稍大的組織塊固定2 - 3h。等組織稍硬后再切成薄的小塊繼續(xù)固定。,2.2固定,割取組織塊后，應立即進行固定。 固定是制片極為關鍵的一個步驟，制片質(zhì)量的優(yōu)劣。除與材料的新鮮程度有關外，還取決于最初的固定是否適當和完全。 2.2.1固定的意義 新鮮的組織被割取后,由于細胞內(nèi)酶的作用和細菌的繁殖，可引起組織的自溶和腐敗。因此，割取組織塊后，應立即采用一 種方法．將組織盡可能保持原有的形態(tài)結構，且有利于保存

12、和適于制片的操作，這一步驟稱為固定。,固定的目的和作用在于：①防止組織自溶和腐?。虎谑辜毎麅?nèi)的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等各種成分沉淀保存下來從而保存細胞的各種組成成分使其保持與生活時相近似的形態(tài)和結構；③因沉淀及凝固的關系，使細胞內(nèi)不同的成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學上的差別使原來在生活情況下看不清楚的結構變得清晰易見，且有的固定劑還有助染作用(如醋酸、苦味酸)，從而使細胞各部易于染色；④固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化而不易變形，

13、有利于操作。,2.2.2固定的方法 固定有物理方法和化學方法兩種。 物理方法固定有干燥、高熱和低溫騾冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；細菌涂片可用加熱法固定；許多組織化學反應的制片是以低溫騾冷固定作冰凍切片的。 化學方法固定就是用化學試劑配制成固定液使之固定。,2.2.3固定液的選擇 固定液的種類很多?？煞譃閮纱箢悾汉唵喂潭ㄒ汉突旌瞎潭ㄒ?。 簡單固定液又稱單純固定液，就是用一種化學試劑作

14、為固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它們只是對細胞的某種成分固定得較好；不能將細胞所有的成分都保存下來。如升汞固定蛋白質(zhì)、冰醋酸固定核蛋白、無水乙醇可固定糖原等，單純固定液是有局限性的。 混合固定液就是用幾種化學藥品，按一定的比例混合配制而成的，由于各種藥品的優(yōu)缺點互相彌補，因此可產(chǎn)生較好的效果。,2.2.4常用的固定液福爾馬林—醋酸—酒精混合固定液（FAA液） 是植物制片技術中較為良好的固定液和保存液。除

15、單細胞和絲狀藻類外，均可用此液固定．也通用于昆蟲和甲殼類的固定。 FAA液配方： 福爾馬林 5m1 冰醋酸 5m1 50％或70％酒精 90m1,Bouin氏液 是常用的良好固定液，廣泛應用于一般動物組織、昆蟲組織、無脊椎動物的卵和幼蟲，以及胚胎學材料的固定。也適用于裸子植物的雌配子體和被子植物的胚囊的固定。 Bouin氏液配方： 苦味酸飽和水

16、溶液 75份 福爾馬林 25份 冰醋酸 5份 此液穿透迅速而均勻，使組織收縮少，不使組織變硬變脆，著色良好。一般動物組織固定12—24h，小塊組織數(shù)小時即可。固定后直接入70％酒精中洗去黃色，但留一點黃色對染色并無妨礙。植物材料的固定時間為12—48h。,2.2.5固定的注意事項 (1)固定的材料越新鮮越好。因此，采集或割取后須立即投入預先準備好的固定液中

17、進行固定，切勿耽誤。 (2)材料大小以直徑不超過5mm為宜，材料與固定液的比例為 1:20。 (3)根據(jù)材料的性質(zhì)和制片的目的選擇固定液。 (4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物質(zhì)，則可用含有酒精的固定液固定。 (5)含有氣泡的材料投入團定液后，材料不會下沉，故須將氣泡抽出使材料下沉。最簡易的抽氣方法是將材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽動幾次。也小用抽氣裝置進行抽氣。,(6)固定時，要防止

18、材料變形。 (7)外有被膜，而內(nèi)部站構又極易松散的器官，應將整個器官投入固定液2—2h后，再將其修成小塊材料繼續(xù)則定。(8)含行粘液、污物或血液的材料需用生理鹽水洗凈后．再行固定。 (9)材料投入固定液后．須經(jīng)常搖晃。(10) 容器外需貼標簽。,2.3 脫水 脫水是用一種即能與水又能與透明液混合的液體來逐漸置換樣品中游離的水。 現(xiàn)采用的脫水劑一般是丙酮或乙醇來進行梯度脫水，脫水的時間，可根據(jù)組

19、織的類型，大小而定。 脫水的過程：一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100% →100% 脫水應逐步而不應跨越太大進行，否則將引起組織強烈的收縮或變形，在經(jīng)無水乙醇處理時，應保證試劑的純度。,2.4 透明 透明是用一種即能與乙醇又能與包埋介質(zhì)互溶的液體來置換樣品中的乙醇，從而為最終的包埋創(chuàng)造一個有利的條件。 現(xiàn)采用的透明劑一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。 其過程為： 1/3

20、二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯 二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，它具有滲透力強，溶解石蠟量大，又易揮發(fā)的優(yōu)點，其缺點是易使組織收縮，變硬，變脆，因此透明時間應根據(jù)組織塊大小及質(zhì)地酌情而定。,2.5 滲蠟 將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中，不斷提高石蠟的比例，直至用石蠟完全置換了組織塊中的透明劑，便于今后的包理與切片。 石蠟有液態(tài)與

21、固態(tài)二種，滲蠟要在恒定溫箱（60°c）中進行，以保證石蠟處于液態(tài)中。,2.6 包埋 樣品經(jīng)石蠟滲透后，其內(nèi)部間隙已完全被石蠟占據(jù)，此時還需要用同種硬度的石蠟包埋成蠟塊以利于后邊的切片，包埋可用相同的器具，也可折疊一牛皮紙盒。 將液態(tài)石蠟緩緩倒入紙盒中，再用鑷子輕輕將浸好蠟的組織塊夾入紙盒，擺好位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢。 至此，一塊組織已完成前處理過程，可以切片，前邊的步驟看來既無高深的理

22、論，又無復雜的技術，一切看似簡單，但一步做不到都會造成整個制片的前功盡棄。,我們可以看到： ①水和酒精可以相溶。 ②酒精和二甲苯相溶。 ③二甲苯和石蠟可以相溶。 因為以上相鄰步驟所使用的液體均可以互溶，所以保證每一步驟液體能置換完全。 水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蠟不能相溶，所以如果有一個步驟的處理不徹底，殘留的液體帶到下一個步驟將不能互溶，最終帶到滲蠟步驟中，成為細小的空洞，以至不能成為質(zhì)地致密的石蠟塊，也

23、就切不成良好的切片。,2.7 切片修塊： 切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，從切面看組織周圍的石蠟相等。固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺上，以便于固定在切片機上。切片：一手持毛筆，一手轉動切片機，切片的蠟片連成一長條蠟帶。切下的蠟帶放在一干凈黑紙上。貼片：用小刀根據(jù)需要切成數(shù)段，分別用粘片劑貼在干凈載玻片上。在恒溫展片臺上展平，烘干。,2.8.1染料、染色液染料必須具備兩個條件： ①

24、要具有顏色 ②和被染物體之間具有親和力。 如果只有顏色而與被染物體之間無親和力，那只能是顏料或合色物質(zhì)，而不是染料。染料的顏色和親和力都是由分子結構決定的，即由產(chǎn)生顏色的發(fā)色團和與組織產(chǎn)生親和力的助色團所決定。 發(fā)色團：能使染料分子產(chǎn)生顏色的原子團稱為發(fā)色團，也就是能吸收一定波長的光線并因之而呈現(xiàn)顏色的化學結構。 助色團：能使染料對織物纖維或組織成分產(chǎn)生親和力的原子團稱為助色團，也就是使化合物具有成鹽性

25、質(zhì)的原子團。,2.8染色,2.8.2染色劑的分類 2.8.2.1根據(jù)來源分 (l)天然染色劑 此類染色劑是從動、植物體中提取的，為天然產(chǎn)物，產(chǎn)量少。目前常用的有蘇木精、洋紅、地衣紅和靛藍等。其中最常用的為蘇木精和洋紅。 (2)合成染色劑 全是由芳香環(huán)或具有芳香性的雜環(huán)化合物所構成。最早是由煤焦油蒸餾產(chǎn)物合成而得的，所以又稱為煤焦油染料。 除上述兩類外，在生物染色中還使用一些無機化

26、合物，如硝酸銀、氯化金、鋨酸等。,2.8.2.2根據(jù)用途分 (l)細胞核染色劑 用于細胞核的染色劑有天然染色劑的蘇木精、洋紅以及合成染色劑中的番紅、結品紫、硫堇、甲苯胺藍、甲基綠、美藍、孔雀綠和焦油紫等。 (2)細胞質(zhì)染色劑 用于細胞質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的曙紅、亮綠、橘黃G、酸性品紅、苦味酸和水溶性苯胺藍等。 （3）脂質(zhì)染色劑 用于顯示脂質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的蘇丹III、蘇丹Iv、

27、硫酸尼羅藍及油紅等。,2.8.2.3根據(jù)染色劑的化學性質(zhì)分 堿性染色劑、酸性染色劑和中性染色劑。 堿性、酸性和中性染色劑都是由一種酸和一種堿所構成的鹽類。 堿性染色劑和酸性染色劑的主要區(qū)別，就在于染色劑的主要有色部分是陽離子還是陰離子。若染色劑電離后，其分子的主要部分成陽離子為堿性染色劑．若電離后，其分子的主要部分為陰離子即為酸性染色劑。,2.8.2染色原理 有關染色的理論至今是一個并

28、末完全清楚的很復雜的問題。目前一般還是從物理和化學的作用來解釋各種組織或細胞的染色現(xiàn)象。 2.8.2.1染色的物理作用 此理論認為組織細胞的染色是以物理作用為基礎的，主要是依靠下列三種物理作用的一種或全部，使染色劑進入組織或細胞內(nèi)。 (1)毛細管作用及滲透作用 但染色劑與組織細胞沒有牢固的結合 (2)吸收作用 又稱溶解學說。這種學說認為組織細胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。組織吸收染色劑，作

29、牢固的結合。組織的著色與溶液的顏色相同，但不一定和干燥染色劑的顏色相同。,例如，品紅溶液為紅色，所染組織也為紅色，而干燥的品紅則為綠色。蘇丹類染色劑使脂質(zhì)著色，是一種溶解現(xiàn)象。因為蘇丹類染色劑在脂質(zhì)中的溶解度大于在酒精等溶劑中的溶解度。當蘇丹類的酒精溶液與組織細胞中的脂質(zhì)接觸時染色劑就從酒精中溶解到脂質(zhì)中，從而使其著色。 (3)吸附作用 吸附作用是固體物質(zhì)的特性，即較大的物體能從周圍溶液(染液)中吸附一些小顆粒(化合物或離子)到自

30、身的特性。細胞中各種蛋白質(zhì)或膠體有不同的吸附面，因此能選擇性地吸收不同的離子，即某種蛋白質(zhì)對某種染色劑有吸附作用,而對別種染色劑無吸附作用，這就可以解釋鑒別染色現(xiàn)象。,2.8.2.2染色的化學作用 化學作用的主要理論根據(jù) 是染色劑的性質(zhì)可分為酸性、堿性和中性染色劑，而動、植物的細胞內(nèi)—般也可區(qū)分為酸性(陰離子)和堿性(陽離子)部分。當堿性染色劑溶液中的有色部分成為陽離子時，就能與細胞的陰離子(酸件部分)較牢固地結合，當酸性染

31、色劑溶液中的有色部分成為陰離子時，就能與細胞內(nèi)的陽離子(堿性部分)較牢固地結合。 例如，細胞核，尤其是核內(nèi)的染色質(zhì)，主要由核酸組成，是酸性的組成成分．故和堿性染色劑(蘇木精)的親和力很強，易于著色。細胞質(zhì)含堿性物質(zhì)，故和酸性染色劑(曙紅)的親和力很大，易于著色。,所以，在蘇木精—曙紅(H．E．)染色中，細胞核被堿性染色劑蘇木精所染，細胞質(zhì)被酸性染色劑曙紅所染。這也就是細胞核是嗜堿性的，細胞質(zhì)是嗜酸性的。除染色質(zhì)外，粘液和軟骨的基

32、質(zhì)等都是嗜堿性的，細胞質(zhì)內(nèi)含的某些顆粒也為嗜酸性。須注意的是嗜堿性和嗜酸性是相對而不是絕對的，若細胞在堿性染色劑溶液中停留過久，則細胞質(zhì)也可染上堿性染色劑的顏色。某些細胞(如血細胞）具有特殊性質(zhì)，能和中性染色劑發(fā)生親和力而結合。 由此可見，細胞各成分的染色強弱是與細胞成分及染色劑的性質(zhì)有密切關系：兩者之間的親和力強，染色就深；親和力弱或無，染色也就淺或無。 但是，染色的實際情況是極為復雜的，組織細胞的染色作用，還隨所用溶

33、液的pH值而變動。,2.8.3染色劑和染色液的配制 Deiafield氏蘇木精 Deiafield氏蘇木精配方 蘇木精 4g 無水酒精 25m l 10％銨明礬(硫酸鋁銨)水溶液 400m1 配制時先將蘇木精溶于無水酒精，待先全溶解后加入10％銨明礬水溶液，充分攪動混合后

34、，注入細口瓶內(nèi)，瓶口用紗布封住。然后將瓶置于溫暖有光處3—4天后過濾，濾后再加入100 m1甘油和100ml甲醇，混合均勻后，瓶口仍用紗布封口，再置于光線充足處1—2月使之成熟。待顏色變成紫褐色時即為成熟。成熟后過濾，塞緊瓶口置于陰涼處貯存， 可長期保存，多年不壞。此液著色力較強，染數(shù)分鐘即可。也可用染液l份加蒸餾水3—5份稀釋后使用，染色時間需延長一至數(shù)小時。此液染細胞核及嗜堿顆粒效果良好。染植物細胞的纖維壁比用其它任何染液著色更好

35、。,2.8.4 染色 切片可用不同方法，使其干燥，然后進行染色。因為每一張載片上粘貼的是蠟帶，因此必須先用二甲苯去除石蠟再用酒精去除二甲苯，再進入水中，才能染色，染色的方法很多，要根據(jù)每張標本要求顯示的目的選擇不同的染劑，最常用的是蘇木精，伊紅染色（簡稱 H·E 染色）。蘇木精使細胞核顯深紫色，伊紅使細胞質(zhì)顯粉紅色，以此顯示清晰的細胞形態(tài)和核的大小，位置，染色后再根據(jù)制片的基本原理，使帶水的載片經(jīng)歷脫水→透明步驟最后

36、用樹膠封片。,,,HE染色：蘇木精（Hematoxylin）伊紅（Eosin）染色,堿性染料,將嗜堿性物質(zhì)（本身酸性）染成藍色,酸性染料,將嗜酸性物質(zhì)（本身堿性）染成紅色,,,,細胞核中的DNA、RNA細胞質(zhì)中的RNA,細胞質(zhì)、膜性結構（線粒體、溶酶體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）,,,,其步驟如下： 二甲苯→二甲苯→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→30%乙醇→蘇木精染液→0.01%