有害物質(zhì)檢測(cè)

1、第十章 食品中有害物質(zhì)的檢測(cè),第一節(jié) 概論一、有害物質(zhì)與有毒物質(zhì)的概念有害物質(zhì)：當(dāng)某物質(zhì)或含有該物質(zhì)的物料被按其原來的用途正常使用時(shí)，若因該物質(zhì)而導(dǎo)致人體機(jī)能、自然環(huán)境或生態(tài)平衡遭到破壞，則稱有害物質(zhì)。 從對(duì)人健康影響的角度可將有害物質(zhì)分為普通有害物質(zhì)、有毒物質(zhì)、致癌物和危險(xiǎn)物有毒物質(zhì)：凡是以小劑量進(jìn)入機(jī)體，通過化學(xué)或物理化學(xué)作用能夠?qū)е陆】凳軗p的物質(zhì),二、食品中有害物質(zhì)的種類與來源,生物性有害物：AFT、李斯特

2、菌、口蹄疫致病菌化學(xué)性有害物：DDT，TTX,重金屬，放射性元素物理性有害物：金屬屑，石子，動(dòng)物排泄物來源？,三、加強(qiáng)食品中有害物質(zhì)檢測(cè)的必要性,與WTO接軌對(duì)安全性要求越來越高,第二節(jié) 食品中有害物質(zhì)常用的檢測(cè)方法,薄層色譜法,氣相色譜法,高效液相色譜法,質(zhì)譜法,色—質(zhì)聯(lián)用,酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定,一 薄層色譜法（TLC）,原理：用Rf值定性分析普通硅膠表面是極性硅醇基能與極性化合物形成氫鍵而表現(xiàn)出吸附性能，用于分離非極性或

3、極性較小的物質(zhì)，屬于正相鍵合。改性硅膠根據(jù)鍵合的鍵不同，與-CN,-NH2,-(OH)2等為正相鍵合，與十八烷基、辛烷基、乙基為反相,二、氣相色譜法（GC）,,三 高效液相色譜法（HPLC）,流動(dòng)相為液相，采用不銹鋼柱及高壓促流，而且填充料的粒徑小而均勻，達(dá)到快而重復(fù)性好的高效效果。不同于傳統(tǒng)的玻璃柱和重力引流的慢而重復(fù)性差的普通色譜柱,四 質(zhì)譜法（MS）,使所研究的混合物或單體在一定條件下形成氣態(tài)離子，使之通過依賴電磁場作用的質(zhì)量

4、分析器，使各離子按質(zhì)荷比大小的不同依次到達(dá)收集器并產(chǎn)生信號(hào)，經(jīng)過檢測(cè)記錄即可得到這些離子峰的信息,五 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),質(zhì)譜儀靈敏度高，定性效果好，但只能對(duì)單一組分色譜儀對(duì)混合物組分分離和定量有顯著優(yōu)勢(shì)兩者聯(lián)用的關(guān)鍵問題：解決色譜的流出物與質(zhì)譜相連的接口轉(zhuǎn)換,六 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）,采用酶標(biāo)記的抗體或抗原與樣品中的抗原或抗體間進(jìn)行的抗原-抗體反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：快速定性，特異性強(qiáng)，靈敏，一次多份（在酶標(biāo)板上）用于激素、

5、抗生素等的分析,第三節(jié) 食品中農(nóng)藥殘留及其檢測(cè),農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的各種藥劑統(tǒng)稱，種類很多。我國農(nóng)藥生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)： 目前全世界實(shí)際生產(chǎn)和使用的農(nóng)藥的品種為500多種，其中大量使用的有100種，主要是化學(xué)合成生產(chǎn)的。,農(nóng)藥包括：殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、植物生長調(diào)節(jié)劑。我國已由農(nóng)藥進(jìn)口國變成農(nóng)藥出口國。,我國現(xiàn)有主要農(nóng)藥合成企業(yè)近400家，已建成700千噸以上原藥生產(chǎn)裝置，可常年生產(chǎn)250多種原藥、農(nóng)藥中產(chǎn)量居

6、世界第二位（美國第一），農(nóng)藥產(chǎn)量呈逐年增長的趨勢(shì)。,新品種與新工藝不斷出現(xiàn)。 常用的有：有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等。 殺蟲劑有胺丙畏、苯胺硫磷等。 殺菌劑有腐霉利、乙霉威等。,除草劑有丙草胺、麥草畏等。 生長調(diào)節(jié)劑有烯效唑、多效唑、油菜素內(nèi)酯等。生物農(nóng)藥發(fā)展迅速。,1、產(chǎn)品結(jié)構(gòu)不合理，個(gè)別品種老化 殺蟲劑 殺菌劑 除草劑我國

7、 68.5% 10.4% 18.3%發(fā)達(dá)國 40% 20% 40%,農(nóng)藥加工劑型增多，主要有乳油、粉劑、粉粒劑、懸浮劑、水劑、片劑、煙劑等。原料及中間體已經(jīng)滿足國內(nèi)需求。存在問題：,2、農(nóng)藥加工落后，助劑研究滯后 我國原藥與制劑比例較低，目前為1：9但發(fā)達(dá)國家為1：10—303、生產(chǎn)規(guī)模小，工藝技術(shù)落后，產(chǎn)品質(zhì)量差 我國農(nóng)

8、藥產(chǎn)量約占全球的25%但銷售額不足8%4、生物農(nóng)藥還應(yīng)大力發(fā)展。,農(nóng)藥在防治農(nóng)作物病蟲害、控制人類傳染病、提高農(nóng)畜產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量以及確保人體健康等方面，都起著重要的作用。但是，大量廣泛用農(nóng)藥也會(huì)造成對(duì)食物的污染。農(nóng)藥殘留是指農(nóng)藥施用后，殘存在生物體、農(nóng)副產(chǎn)品和環(huán)境中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝產(chǎn)物、降解物和雜質(zhì)的總稱。殘留的數(shù)量叫殘留量。,,農(nóng)藥進(jìn)入人體的方式,,土壤、水 、空氣,,家禽、畜,,,,,,,,,,,,,,植物、飼料,水生

9、動(dòng)、植物,肉、蛋、乳,人,食品中普遍存在農(nóng)藥殘留, 殘留量隨食品種類及農(nóng)藥的種類不同而有很大差異，由于農(nóng)藥的毒性都很大，有的還可在人體內(nèi)蓄積，對(duì)人體造成危害。食品中殘留農(nóng)藥過高會(huì)導(dǎo)致癌癥和帕金森癥。 1994 年，我國農(nóng)藥中毒人數(shù)已超過10萬人，大部分是由于農(nóng)藥殘留而引起。,容易吸收農(nóng)藥的蔬菜,番茄、茄子、圓辣椒、卷心菜、白菜及大多數(shù)根菜類、薯類。對(duì)農(nóng)藥吸收率較低的 葉菜類、果類等。,為提高食品的衛(wèi)生質(zhì)量，保證食品的安全性，保障

10、消費(fèi)者身體健康，許多國家都對(duì)食品中農(nóng)藥允許殘留量作了規(guī)定。表13—l和13—2分別為我國和WHO制訂的有機(jī)氯農(nóng)藥六六六、滴滴涕在食品中的允許殘留量標(biāo)準(zhǔn)；表13—3為我國制訂的有機(jī)磷農(nóng)藥在食品中允許殘留量標(biāo)準(zhǔn)；表13 —4為FAO/WHO推薦的部分食品中有機(jī)磷農(nóng)藥允許殘留量標(biāo)準(zhǔn)。,,,,,小資料：我國全面禁用5種高毒農(nóng)藥包括：甲胺磷、久效磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、磷胺。,食品中農(nóng)藥殘留量的分析方法： 1) 比色法

11、 少特異性，靈敏度很低， 分光光度法 已很少使用 電化學(xué)分析2）紙色譜 TLC 3）GC —— 電子捕獲檢測(cè)器 適用有機(jī)氯農(nóng)藥。4）HPLC ——非揮發(fā)性、熱不穩(wěn)定性農(nóng)藥，如 部分有機(jī)磷農(nóng)藥。5）GC/ 紅外光譜 聯(lián)用、 GC/MS 聯(lián)用。,,一、有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)（一）有機(jī)氯農(nóng)藥的性質(zhì)

12、及常見品種,有機(jī)氯農(nóng)藥是農(nóng)藥中一類有機(jī)含氯化合物，一般分為五大類： 1、DDT類——氯化苯及其衍生物，包括DDT、 六六六。,2、氯化甲撐萘類——七氯、 艾氏劑、狄氏劑。 3、七O五四—— 純品為白色晶體，微溶于水， 易溶于某些有機(jī)溶劑。 主要用于殺滅蚊蠅。蓄積在動(dòng)植物脂肪中， 通過食物鏈進(jìn)入人體。中毒癥狀為乏力、失 眠、眩暈、惡心等，長期接觸可影響中樞

13、 神經(jīng)系統(tǒng)及肝臟。,4、氯丹—— 純品為無色或淡黃色液體，微溶于水，易溶于某些有機(jī)溶劑。中毒情況同7054 5、林丹（又名高丙體六六六）—— 本品為無色晶體，不溶于水，溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。中毒情況同7054 。主要用于糧食、蔬菜、果樹、煙草、森林、糧倉。目前仍有一些國家（包括我國）使用林丹由于有機(jī)氯性質(zhì)穩(wěn)定，在水域、土壤中仍有殘留，并會(huì)在較長時(shí)間內(nèi)繼續(xù)影響人類健康。,有機(jī)氯農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì),,（1）六六六 六六六分子式

14、為C6H6Cl6，化學(xué)名為六氯環(huán)己烷、六氯化苯，英文名為Benzene hexachl oride (簡稱 BHC)。BHC有多種異構(gòu)體，其常見的異構(gòu)體化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：,BHC為白色或淡黃色固體，純品為無色無臭晶體，工業(yè)品有霉臭氣味，在土壤中半衰期為2年，不溶于水，易溶于脂肪及丙酮、乙醚、石油醚及環(huán)己烷等有機(jī)溶劑。BHC對(duì)光、熱、空氣、強(qiáng)酸均很穩(wěn)定，但對(duì)堿不穩(wěn)定( β—BHC除外)，遇堿能分解(脫去HCl)。 C6H 6Cl6十3KOH

15、 C6H3Cl3十3KCl 十3H2O,,(2)滴滴涕 滴滴涕分子式為C14H9Cl15， 化學(xué)名為2，2——雙(對(duì)氯苯基)——1，1，1一三氯乙烷、二氯二苯三氯乙烷，簡稱二二三，英文名為Dichlorodiphenyl trichloroethane，簡稱DDT。根據(jù)苯環(huán)上Cl的取代位置不同形成如下幾種異構(gòu)體：,DDT產(chǎn)品為白色或淡黃色固體，純品DDT為白色結(jié)晶，熔點(diǎn)108.5—109℃，在土壤中半衰

16、期3—10年，（在土壤中消失95%需16——33年）。不溶于水，易溶于脂肪及丙酮、CCl4、苯、氯苯、乙醚等有機(jī)溶劑。DDT對(duì)光、酸均很穩(wěn)定，對(duì)熱亦較穩(wěn)定，但溫度高于本身的熔點(diǎn)時(shí)，DDT會(huì)脫去HCl而生成毒性小的DDE，對(duì)堿不穩(wěn)定，遇堿亦會(huì)脫去HCl。,1874年人工合成DDT，1939年瑞士化學(xué)家穆勒發(fā)現(xiàn)了DDT的殺昆蟲作用，并因此獲得了1948年的諾貝爾獎(jiǎng)。在二次世界大戰(zhàn)中及戰(zhàn)后的歐洲和亞洲，DDT用于殺滅傳播瘧原蟲的蚊子，挽救了

17、數(shù)千人的生命。,DDT在生物體內(nèi)富集作用很強(qiáng)。例如水鳥體內(nèi)DDT殘留為25 mg/kg，DDT污染的水要高出800——1000萬倍。DDT的污染是全球性的，在人跡罕至的南極的企鵝、海豹、北極的北極熊、甚至未出世的胎兒體內(nèi)均可檢出DDT的存在。,樣品的予處理,1.提取：以石油醚作主體溶劑，加入極性較大溶劑搭配，以索氏法或浸漬法提取含脂肪高的：用石油醚乙醚直接提取含水分高的動(dòng)物性食品：加無水硫酸鈉研磨，再用石油醚提取果蔬：加入丙酮（穿

18、透性強(qiáng)），過濾得濾液，加硫酸鈉溶液（增強(qiáng)丙酮極性，有利分層），再用石油醚提取,,蛋類：用丙酮-己烷提取牛奶：乙醇-草酸鉀處理（破壞脂肪膜，釋出脂肪），再用石油醚提取,2.凈化,用H2SO4磺化處理，除脂肪、蠟質(zhì)、色素等。石油醚：硫酸=1：1柱層析：合理選擇層析材料液液分配法：以乙腈-己烷為例，將乙腈加入到己烷溶液中，有機(jī)氯農(nóng)藥從己烷層轉(zhuǎn)移到乙腈層中，脂肪、色素、蠟質(zhì)仍留在己烷層。再將乙腈層放入另一潔凈分液漏斗中，加水，使乙腈濃度不

19、大于20%，加純凈己烷，振搖分液漏斗，農(nóng)藥又進(jìn)入己烷層，從而達(dá)到凈化目的,3.濃縮,以無水硫酸鈉脫水，減壓蒸餾濃縮到一定程度；或采用K—D減壓濃縮。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) GB/T 5009.19,,（二）GC-ECD法測(cè)定有機(jī)氯農(nóng)藥殘留（三）TLC法測(cè)定有機(jī)氯農(nóng)藥殘留,二、有機(jī)磷農(nóng)藥殘留及其檢測(cè),(一)有機(jī)磷農(nóng)藥的特性及種類 1．常見的有機(jī)磷農(nóng)藥及其結(jié)構(gòu) 有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphorus Pesticides)是

20、農(nóng)藥中一類含磷的有機(jī)化合物，其種類很多，目前大量生產(chǎn)與使用至少有60多種，按其毒性可分成高毒、中等毒及低毒三類；按其結(jié)構(gòu)則可劃分為磷酸酯及硫代磷酸酯兩大類，其結(jié)構(gòu)通式如下：,根據(jù)R，Rl及X等基團(tuán)不相同，可構(gòu)成不同的有機(jī)磷農(nóng)藥。 2．有機(jī)磷農(nóng)藥的理化性質(zhì) 有機(jī)磷農(nóng)藥中，除敵百蟲、樂果為白色晶體外，其余有機(jī)磷農(nóng)藥的工業(yè)品均為棕色油狀。有機(jī)磷農(nóng)藥有特殊的蒜臭味，揮發(fā)性大，對(duì)光、熱不穩(wěn)定，并具有如下性質(zhì)：,①溶解性：由于各種有機(jī)磷農(nóng)

21、藥的極性強(qiáng)弱不同，故對(duì)水及各種有機(jī)溶劑的溶解性能也不一樣，但多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥難溶于水，可溶于脂肪及各種有機(jī)溶劑，如疏水性有機(jī)溶劑：丙酮、石油醚、正己烷、氯仿、二氯甲烷及苯等，親水性有機(jī)溶劑；乙脂、二甲基亞砜等。,②水解性：因有機(jī)磷農(nóng)藥屬酯類(磷酸酯或硫代磷酸酯)，故在一定條件下能水解，特別是在堿性介質(zhì)、高溫、水分含量高等環(huán)境中，更易水解。如敵百蟲在堿性溶液中易水解為毒性較大的敵敵畏。,③ 氧化性：有機(jī)磷農(nóng)藥中，硫代磷酸酯農(nóng)藥在溴作用下或在

22、紫外線照射下，分子中S易被O取代，生成毒性較大的磷酸酯。,樣品預(yù)處理 1.提取 一般根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥與樣品的種類，選擇適當(dāng)?shù)奶崛∪軇┡c提取方法。用乙腈、丙酮、氯仿或二氯甲烷等提取。,2．凈化 將樣品提取液經(jīng)乙晴或二甲基亞砜分配提取后，再用柱色譜凈化，柱中吸附劑可由活性炭、氧化鋁、弗羅里矽土、無水Na 2SO4或硅藻土等按一定比例組成。,目前，國際上許多國家與組織(包括FDA，AOAC)FDA—美國食品藥物管理局。大量使

23、用由storher相wans在1965年提出的，后經(jīng)多次改進(jìn)的掃集共蒸餾法(sweepco—distillation)來凈化有機(jī)磷農(nóng)藥樣品提取液。 3.濃縮——K—D減壓濃縮。,（二）有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)GC法測(cè)定—— 氮磷檢測(cè)器。幾種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：馬拉硫磷 GB/T 5009.36倍硫磷 GB/T 5009.20甲胺磷 GB14876,(一)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的性質(zhì)及常用品種 氨基甲酸酯類農(nóng)藥可視為氨基甲酸的衍

24、生物，氨基甲酸是極不穩(wěn)定的，會(huì)自動(dòng)分解為 C02和 H20，但氨基甲酸的鹽和酯均相當(dāng)穩(wěn)定，該類農(nóng)藥通常具有以下通式：,三、氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留及其檢測(cè),R2 ／ RlOOC--N ＼ CH3,R2是氫或者是一個(gè)易于被化學(xué)或生物方法斷裂的基團(tuán)。大多數(shù)氨基甲酸酯類的純品為無色和白色晶狀固體，易溶于多種有機(jī)溶劑中，但在水中溶解度較小，只有少數(shù)如涕滅威、滅多蟲等

25、例外。氨基甲酸酯一般沒有腐蝕性，其貯存穩(wěn)定性很好，只是在水中能緩慢分解，提高溫度和堿性時(shí)分解加快。,常見的氨基甲酸酯農(nóng)藥有：甲萘威(carbaryl)、戊氰威(Nitrilacarb)、呋喃丹(carbofuran)、仲丁威(Fenobucarb)、異丙威(Isoprocarb)、速滅威(Metolcarb)、殘殺威(Propoxur)、涕滅威(Aldicarb)、抗蚜威(Pirimicarb)、滅蟲威(Methiocarb)、滅

26、多威(Methomyl)、惡蟲威(Bendiocarb)、硫雙滅多威(Thiodicarb)、雙甲瞇(Amitraz)等。,這些氨基甲酸酯農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與日常生活中，主要用作殺蟲劑、殺螨劑、除草劑、殺軟體動(dòng)物劑和殺線蟲劑等。20世紀(jì)70年代以來，由于有機(jī)氯農(nóng)藥受到禁用或限用，且抗有機(jī)磷農(nóng)藥的昆蟲品種日益增多，因而氨基甲酸酯的用量逐年增加，這就使得氨基甲酸酯的殘留情況備受關(guān)注。,(二)氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的測(cè)定,GC—ECD法測(cè)定氨基甲酸

27、酯類農(nóng)藥殘留與本節(jié)有機(jī)磷農(nóng)殘的氣相色譜測(cè)定方法相同，詳見GB／T 17331—1998。,,四、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留及其檢測(cè),(一)擬除蟲菊酯的特性及常用品種擬除蟲菊酯(Pyrethroids)是近年來發(fā)展較快的一類重要的合成殺蟲劑。擬除蟲菊酯分子較大，親脂性強(qiáng)，可溶于多種有機(jī)溶劑，在水中的溶解度小，在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下易分解。,擬除蟲菊酯具有高效、廣譜、低毒和生物降解等特性，擬除蟲菊酯和除蟲菊酯殺蟲劑在光和土壤微生物的作用

28、下易轉(zhuǎn)變成極性化合物，不易造成污染。擬除蟲菊酯在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有的共同特點(diǎn)之一是分子結(jié)構(gòu)中含有數(shù)個(gè)不對(duì)稱碳原子，因而包含多個(gè)光學(xué)和立體異構(gòu)體。這些異構(gòu)體又具有不同的生物活性，即使同一種擬除蟲菊酯，總酯含量相同，若包含的異構(gòu)體的比例不同，殺蟲效果也大不相同。,常見的擬除蟲菊酯有：烯丙菊酯(Allethrin)、胺菊酯(Tetramethrin)、醚菊酯(Ethofenprox)、苯醚菊酯(Phenothrin)、甲醚菊酯(Methothr

29、in) 氯菊酯(Permethrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(Dehamethrin)、氰菊酯(Fenpropanate)、殺螟菊酯(Phencyclate)、氰戊菊酯(Fenvalerate)、氟氰菊酯(Flucythrin)、氟胺氰菊酯(Fluvalinate)、氟氰戊菊酯(Flucythtinge)、溴氟菊酯(Bmthrinate)等。,目前，已合成的菊酯數(shù)以萬計(jì)，迄今已商品化的擬除蟲菊酯有近40個(gè)品

30、種，在全世界的殺蟲劑銷售額中占20％左右。擬除蟲菊酯主要應(yīng)用在農(nóng)業(yè)上，如防治棉花、蔬菜和果樹的食葉和食果害蟲，特別是在有機(jī)磷、氨基甲酸酯出現(xiàn)抗藥性的情況下，其優(yōu)點(diǎn)更為明顯。除此之外，擬除蟲菊酯還作為家庭用殺蟲劑被廣泛應(yīng)用，它可防治蚊蠅、蟑螂及牲畜寄生蟲等。(二)擬除蟲菊酯殘留的檢測(cè) 參考本節(jié)中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，詳見GB／T 17332—1998。,第四節(jié) 食品中霉菌毒素及其檢測(cè) 一、霉菌毒素的種類 霉菌是一些絲狀真菌的

31、通稱，在自然界分布很廣，幾乎無處不有，主要生長在不通風(fēng)、陰暗、潮濕和溫度較高的環(huán)境中。霉菌可非常容易地生長在各種食品上并產(chǎn)生危害性很強(qiáng)的霉菌毒素。目前已知的霉菌毒素約有200余種，與食品關(guān)系較為密切的有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、雜色曲霉素等。已知有5種毒素可引起動(dòng)物致癌，它們是黃曲霉毒素(B、G、M，)、黃天精、環(huán)氯素、雜色曲霉素和展青霉素。,霉菌污染食品可使食品的食用價(jià)值降低，甚至使之完全不能食用，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年平

32、均有2％的谷物由于霉變不能食用。霉菌毒素引起的中毒大多通過被霉菌污染的糧食、油料作物以及發(fā)酵食品等引起。霉菌毒素多數(shù)有較強(qiáng)的耐熱性，一般的烹調(diào)加熱方法不能使其破壞。當(dāng)人體攝入的霉菌毒素量達(dá)到一定程度后，可引起中毒。霉菌中毒往往表現(xiàn)為明顯的地方性和季節(jié)性，臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致突變等。,二、黃曲霉毒素,黃曲霉毒素(Aflatoxins。簡寫AFT)是黃曲霉、寄生曲霉及溫特曲霉等產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物 ，是一

33、群結(jié)構(gòu)類似的化合物。目前已發(fā)現(xiàn)17種黃曲霉毒素。 根據(jù)其在波長為365nm紫外光下呈現(xiàn)不同顏色的熒光而分為B、G二大類： B大類在氧化鋁薄層板上于紫外光照射下呈現(xiàn)藍(lán)色熒光；G大類則呈綠色熒光。,AFT主要污染糧油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染嚴(yán)重，此外各種植物性與動(dòng)物性食品也能被廣泛污染，如在胡桃、杏仁、高梁、小麥、豆類、王豆、皮蛋、奶與奶制品、干咸魚及辣椒中均有AFT污染。其污染程度與各種作物生物學(xué)特性和化學(xué)

34、組成以及成熟期所處的氣候條件有很大關(guān)系。一般來說，富含脂肪的糧食易產(chǎn)生AFT。此外，收獲季節(jié)高溫、高濕，也易造成AFT的污染。,AFT屬劇毒物質(zhì)，其毒性比氰化鉀還高，也是目前最強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)。其中AFT Bl的毒性和致癌性最強(qiáng)，故其在食品中允許量各國都有嚴(yán)格規(guī)定。FAO／WHO規(guī)定食品中 AFTBl＜15 ppb，美國≤20 ppb，日本≤10 ppb，以色列與瑞典規(guī)定不得檢出。,（一）黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì),1、黃曲霉毒

35、素的結(jié)構(gòu),2、黃曲霉毒素的理化性質(zhì) 1） 溶解性：AFT的分子量為312—346，中等極性化合物，難溶于水、乙醚、石油醚及己烷中，易溶于油和甲醇、丙酮、氯仿、苯 等有機(jī)溶劑中。 2）穩(wěn)定性：AFT是一組性質(zhì)比較穩(wěn)定的化合物；其對(duì)光、熱、酸較穩(wěn)定，而對(duì)堿和氧化劑則不穩(wěn)定。,（二）霉菌毒素的檢測(cè)我國涉及黃曲霉毒素的限量及檢測(cè)的國家標(biāo)準(zhǔn)有GB 2761—1981(食品中黃曲霉毒素B1允許量標(biāo)準(zhǔn))、GB 9676--1988(

36、牛乳及其制品中黃曲霉毒索M，限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn))、GB／T 17480--1998(酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定飼料中黃曲霉毒素B、)、GB／T 5009．22--1996[薄層色譜法(第一法)／ELISA(第二法)測(cè)定食品中黃曲霉毒素B，GB／T 5009．23—1996[薄層色譜法(第一法)／微柱篩選法(第二法)測(cè)定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,,薄層色譜法測(cè)定食品中黃曲霉毒素M1 、B1其最低檢出量0.4 ng是各實(shí)驗(yàn)室所公認(rèn)的

37、。 高效液相色譜法測(cè)定食品中AFT B1、B3、Gl、G 2、M1,GB／T 5009．24—1996,黃曲霉毒素的測(cè)定,薄層層析法測(cè)黃曲霉毒素 薄層層析是在黃曲霉毒素研究方面應(yīng)用最廣的分離技術(shù)。自1990年，它被列為AOAC(association of official agricultural chemists)標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法同時(shí)具有定性和定量分析黃曲霉毒素的功能。,。,原理,本法是利用樣品中的黃曲霉毒素

38、B1，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、凈化、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測(cè)定黃曲霉毒素B1的含量。 薄層色譜法黃曲霉毒素B1的最低檢出量為0．000 4ug，最低檢出濃度為5ug／Kg。,儀器,小型粉碎機(jī)樣篩電動(dòng)振蕩器玻璃濃縮器玻璃板5cm×20cm、薄層板涂布器展開槽(25cm×6cm×4cm)紫外光燈100一125w、波長365nm濾

39、光片、微量注射器(2),試劑,三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、無水乙醚或乙醚經(jīng)無水硫酸鈉脫水、丙酮。以上試劑在試驗(yàn)前需先進(jìn)行空白試驗(yàn)，如不干擾測(cè)定即可使用，否則需逐一進(jìn)行重蒸。,吸附劑－－硅膠,薄層層析用硅膠有多種規(guī)格。應(yīng)用最多的是摻有粘合劑石膏的硅膠，稱有硅膠G，其摻入的石膏量為5-20%不等。硅膠有時(shí)含有鐵鹽及氯離子等雜質(zhì)，它們可被展開劑提取出來，對(duì)層析的結(jié)果產(chǎn)生一定影響。硅膠H

40、――不含粘合劑和其他添加劑（不會(huì)被展開劑提出雜質(zhì)）。硅膠HF254 ――摻有熒光指示劑，可在短波254納米的紫外光下觀察到熒光。硅膠GF254――含石膏及熒光物質(zhì)。,黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液,1、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取1～1．2mg AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光、于冰箱4℃保存。此標(biāo)準(zhǔn)液濃度約為10ug／mL。先用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，再用苯一乙腈混合液調(diào)整其濃度為準(zhǔn)確10．0

41、ug／mL。在350nm，AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩爾消光系數(shù)為19 800 .,2、黃曲霉毒素B標(biāo)準(zhǔn)使用液： I液(1.0ug／mL)：取1mL AFTB標(biāo)準(zhǔn)液(10.0ug／mL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀釋、定容。 Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。 Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI。，按上法定容5mI。思考：在配制黃曲霉毒素B標(biāo)準(zhǔn)使用液時(shí)，為什

42、么需要用貯備液來稀釋而不是直接配制？,次氯酸鈉溶液,配制：取100g漂白粉，加入500mL水，攪拌均勻。另將80g工業(yè)用碳酸鈉(Na2CO3·H2O)溶于500mL溫水中。將兩液合并、攪拌、澄清、過濾。此液含次氯酸25g／L。思考題：1、次氯酸鈉溶液的作用是什么？消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸鈉溶液浸泡可達(dá)到去毒的效果。2、為什么次氯酸鈉溶液能起到消毒的作用？,操作步驟,樣品處理→提取 →濃縮→薄板制備→點(diǎn)樣→展開→

43、定量,(1)樣品處理,樣品從大樣經(jīng)粗碎及連續(xù)多次用四分法縮減至0．5～lkg后全部粉碎。糧食樣品全部通過20目篩，花生樣品全部通過10目篩、混勻。,(2)提取,稱取20.00g經(jīng)粉碎樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水清液。　　　振蕩30min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過濾于分液漏斗中，待下層甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶內(nèi)。,取20.00mL甲醇水溶液置于另一12

44、5mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振搖2min、靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可滴加甲醇促使分層。放出三氯甲烷層，經(jīng)盛有約10g預(yù)先用三氯甲烷濕潤的無水硫酸鈉的定量慢速濾紙，過濾于50mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。,濃縮,將蒸發(fā)皿放在通風(fēng)柜，于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后于冰盒上冷卻2～3min后，準(zhǔn)確加入1mL苯一乙腈混合液。用帶橡皮

45、頭的滴管的管尖將殘?jiān)浞只旌?，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL的具塞試管中?！　∽⒁猓喝粲斜降慕Y(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失。,測(cè)定－－單向展開法,1、薄板制備：稱取3g硅膠G，加2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊狀后，倒人涂布器推成5cm×20cm，厚度約0.25mm的薄層板3塊。在空氣中干燥15min，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置時(shí)間較長，可再活化后使

46、用。,點(diǎn)樣,將薄板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血紅素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距為lcm，點(diǎn)直徑約3mm，在同一板上滴加點(diǎn)的大小應(yīng)一致，滴加時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)用冷風(fēng)邊吸邊加。滴加樣式如下：,,第一點(diǎn)：10μL AFTB，標(biāo)準(zhǔn)使用液 (0．04μg／mL)。 第二點(diǎn)：20μL樣液。 第三點(diǎn)：20μL樣液+10μL 0.04μg／mL

47、 AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第四點(diǎn)：20μL樣液+10μL 0.2μg／m L AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液。,展開與觀察,在展開槽內(nèi)加10mL無水乙醚，預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加10mL丙酮一三氯甲烷(8：92)，展開10～12cm，取出，在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下：,,a．由于樣液上加滴了AFTB1標(biāo)準(zhǔn)，可使AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液

48、中AFTB1熒光點(diǎn)重疊。若樣液為陰性，薄板上第三點(diǎn)AFTB1為0．000 4μg，可用作檢查樣液中AFTB1最低檢出量是否正常出現(xiàn)；若樣液為陽性；則起定性作用。薄層板上第四點(diǎn)AFTB1標(biāo)準(zhǔn)為0．002ug．主要起定位作用。,,b．若第二點(diǎn)與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)位置上無藍(lán)色熒光點(diǎn)，則表示樣品中AFTBl含量<5ug／kg；若在相應(yīng)位置上有藍(lán)色熒光點(diǎn)，則須進(jìn)行確證試驗(yàn)。,確證試驗(yàn),為確認(rèn)薄層樣上樣液熒光系由黃曲霉毒素B1產(chǎn)生的，

49、加滴三氟乙酸（TFA），產(chǎn)生AFTB1的衍生物，展開后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄層板左邊依次滴加兩個(gè)點(diǎn)。 第一點(diǎn)：10uL 0．04ug／mL AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第二點(diǎn)：20／μL樣液于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2min(板上溫度不高于40℃)，再于薄層板上滴加以下兩點(diǎn)。 第三點(diǎn)：10uL 0.04ug／mL AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。第四點(diǎn)：20μL樣液。,按上法展開并觀察

50、，樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四兩點(diǎn)，可依次作為標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對(duì)照。 ④稀釋定量：樣液中的AFTB1熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，如與AFTB1。標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)最低檢出量(0.00 04μg)的熒光強(qiáng)度一致，則樣品中AFTB1含量為即為5μg／kg．,,若樣液中熒光強(qiáng)度比最低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)，減少滴加微升數(shù)，或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù)，直至樣液的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。滴加式樣

51、如下： 第一點(diǎn)：l0uL AFTB1，標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.04ug／mL)。 第二點(diǎn)：根據(jù)情況滴加10uL樣液。 第三點(diǎn)：根據(jù)情況滴加15uL樣液。 第四點(diǎn)：根據(jù)情況滴加20uL樣液。,4)結(jié)果計(jì)算 X = 式中：X 一 樣品中AFTBl的含量，ug／kg； V1一加入苯一乙腈混合液的體積，mL； V2—出現(xiàn)最低熒光時(shí)滴加樣液的體積，mL； D一樣

52、液的總稀釋倍數(shù)； m1—加入苯一乙腈混合液溶解時(shí)相當(dāng)樣品的質(zhì)量，g；0.0004—AFTBl的最低檢出限量，ug。,測(cè)定－－雙向展開法,原理 如用單向展開法后，薄層色譜由于雜質(zhì)干擾掩蓋了AFTB1的熒光強(qiáng)度，需采用雙向展開法。薄層板先用無水乙醚做橫向展開，將干擾的雜質(zhì)展至樣液點(diǎn)的一邊，而AFTB1不動(dòng)，然后再用丙酮一三氯甲烷(8+92)做縱向展開，樣品在相應(yīng)處的雜質(zhì)底色大量減少，因而提高了方法的靈敏度。,操作步驟,(1

53、)點(diǎn)樣：取薄層板三塊，在距下端3cm基線上，在距左邊緣0．8～1cm第二篇食品理化檢測(cè)技術(shù)處，各滴加10uL AFTB1(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液，在距左邊緣2.8～3cm處，各滴加20uL樣液。然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上滴加l0uL AFTBl(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液，在第三塊板的樣液點(diǎn)上滴加10uL AFTB1(0.02ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液。,(2)展開： a．橫向展開：在展開槽內(nèi)的長邊置一玻璃支架，加10mL無水乙醇，將

54、上述點(diǎn)好的薄層板靠標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的長邊，置于展開槽內(nèi)展開，展至板端后，取出揮干。根據(jù)情況，需要時(shí)，可再重復(fù)l～2次。 b．縱向展開：揮干的薄層板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展開至10～12cm為止。丙酮與氯甲烷的比例，根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)。,觀察與評(píng)定結(jié)果,a．在紫外光下觀察第一、二塊板，若第二塊板在AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而在第一板與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光，則樣品中AFTBl含量<5ug／kg.b．若第一

55、塊板與第二塊板的相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一塊板與第三塊板比較，這第三塊板上第二點(diǎn)與第一塊板上第二點(diǎn)的相同位置上的熒光點(diǎn)是否與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行確證試驗(yàn)。在具體測(cè)定中，三塊板可以同時(shí)做，也可按順序做。當(dāng)?shù)谝粔K板出現(xiàn)陰性時(shí)，第三塊板可以省略，如第一塊板為陽性，則第二塊板可省略，直接做第三塊。,確認(rèn)試驗(yàn),另取薄層板二塊，于第四、五兩板距左邊緣0.8～1cm處，各滴加10u LATTB1(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液及一小

56、滴三氟乙酸；在距左邊緣2.8～3cm處，于第四板滴加20uL樣液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20gL樣液、10uL。AFTBl(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液及一小滴三氟乙酸，反應(yīng)5min后，用熱風(fēng)吹2min(板上溫度不高于40℃)。再用雙向展開法展開后，觀察樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物。觀察時(shí)，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。若樣液AFTB1含量較高時(shí)，則將樣液稀釋后，按單向展開法中(4)做確認(rèn)試驗(yàn) .,(5)稀釋定量：

57、 若樣液中AFTBl含量較高，可按單向展開法中(5)稀釋定量操作。若AFTB1含量較低，稀釋倍數(shù)小，在定量的縱向展開板上仍有雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果判斷，可將樣液再做雙向展開法測(cè)定，以確定含量。 3.2.3 結(jié)果計(jì)算 同單向展開法。 3.2.4 說明及注意事項(xiàng),由于AFT是一劇毒且強(qiáng)致癌性物質(zhì)，使用時(shí)應(yīng)特別小心應(yīng)按以下規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)后的清洗消毒工作。①實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)戴口罩；配標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)戴手術(shù)手套

58、。②若衣服被污染，須用5％次氯酸鈉溶液浸泡15 —30分鐘再用清水洗凈。③對(duì)于剩余的AFT標(biāo)液或陽性樣液，應(yīng)先用5％次氮酸鈉處理后方可倒到指定的地方。,④實(shí)驗(yàn)中所用的或被污染的玻璃器皿須經(jīng)5％次氯酸鈉溶液浸泡5分鐘再清洗之。不能用洗衣粉洗滌，因其中含熒光物質(zhì)，可用肥皂水。 ⑤實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)用5％次氯酸鈉清洗消毒實(shí)驗(yàn)臺(tái)等。 ⑥萬一手皮膜被污染，可用次氯酸納溶液搓洗，再用肥皂水洗凈。,(三）酶聯(lián)免疫法測(cè)定原理： 固相酶聯(lián)免疫