細(xì)胞工程第八章植物胚胎培養(yǎng)

1、第八章　植物胚胎培養(yǎng),第八章 植物胚胎培養(yǎng),主要內(nèi)容： 第一節(jié) 胚培養(yǎng) 第二節(jié) 胚乳培養(yǎng) 第三節(jié) 胚珠和子房培養(yǎng) 第四節(jié) 離體授粉與離體受精,學(xué)習(xí)的目標(biāo)與要求： 了解植物胚培養(yǎng)類型、過程、培養(yǎng)條件，以及胚培養(yǎng)的應(yīng)用。了解植物胚乳培養(yǎng)過程和培養(yǎng)條件，了解胚乳培養(yǎng)在實(shí)踐中的應(yīng)用。認(rèn)識植物胚珠和子房培養(yǎng)方法及其在生產(chǎn)上應(yīng)用。 具備胚胎培養(yǎng)基本

2、認(rèn)知，有進(jìn)行各類胚胎培養(yǎng)的基本能力。,植物胚胎培養(yǎng),植物胚胎培養(yǎng)（Embryo Culture）概念: 指對植物的胚、子房、胚珠和胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植物的技術(shù)。包括胚培養(yǎng)(embryo culture)（成熟胚培養(yǎng)、幼胚培養(yǎng)）、胚珠培養(yǎng)(ovule culture)、子房培養(yǎng)(ovary culture)、胚乳培養(yǎng)(endosperm culture)、離體受精(in vitro pollination)等類

3、型。 1904年Hanning最早成功培養(yǎng)蘿卜和辣根的胚。,胚胎培養(yǎng)的類型,植物胚胎結(jié)構(gòu),合子發(fā)育成胚,珠被發(fā)育成種皮,受精極核發(fā)育成胚乳,一、胚培養(yǎng),（一）胚培養(yǎng)：指在無菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來，置于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。 胚的發(fā)育過程包括從合子分裂到幼胚形成直至發(fā)育為成熟胚的過程。,（二）植物胚胎發(fā)生過程： 原胚－球形胚－心型胚－魚雷胚－子葉胚,球形胚前期,心型胚前期,魚雷胚,球形胚,（三）胚培養(yǎng)的意義

4、（1）促使發(fā)育不良或中途敗育的胚發(fā)育成熟（2）縮短育種周期（3）獲得單倍體植株（4）打破休眠期促進(jìn)胚萌發(fā)（5）建立高頻再生體系（6）可作為轉(zhuǎn)基因受體材料,（四）胚培養(yǎng)技術(shù) 胚的發(fā)育對營養(yǎng)的要求有2個(gè)階段，即： 異養(yǎng)期：這一時(shí)期的幼小胚完全依賴胚乳和周圍的母體組織提供營養(yǎng)。 自養(yǎng)期：這一時(shí)期胚能吸收培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽和糖，經(jīng)過自身的代謝作用合成其生長必需的物質(zhì)，在營養(yǎng)上已可以完全獨(dú)立。,1、依據(jù)所剝

5、離胚的發(fā)育時(shí)期不同：,子葉形成之前,子葉形成之后,2、成熟胚培養(yǎng),,胚囊,3、成熟胚培養(yǎng)：指子葉期至發(fā)育成熟的胚培養(yǎng)。成熟胚是自養(yǎng)的，培養(yǎng)基需要簡單。僅提供一定的溫度、濕度就可以發(fā)芽生成植物體。如種子的發(fā)育。 培養(yǎng)過程： 種子——95%酒精消毒——選取完好種子——70%酒精浸數(shù)秒——0.1%升汞或10%次氯酸鈉浸泡——無菌水沖洗——種子培養(yǎng)幾天——剝離種胚——接種在培養(yǎng)基上。,成熟胚培養(yǎng)一般較易獲得成功,4、幼胚培養(yǎng)：

6、是指處于原胚期、球形期、心形期、魚雷期的胚培養(yǎng)；幼胚完全是異養(yǎng)的，離體條件下培養(yǎng)要求培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)不易成功。 （1）幼胚培養(yǎng)的基本程序A、取子房B、常規(guī)表面消毒C、解剖鏡下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚。D、固體培養(yǎng),（2）幼胚離體培養(yǎng)的生長發(fā)育方式： 胚性發(fā)育： 胚只是在體積上增大甚至超過正常胚大小而不能萌發(fā)成苗。早熟萌發(fā)：幼胚不再發(fā)育，迅速萌發(fā)成幼苗。多數(shù)情況一個(gè)幼胚萌發(fā)成一個(gè)植株，有時(shí)因細(xì)胞分裂形成許多胚狀體

7、，進(jìn)而形成許多植株，即叢生胚現(xiàn)象。愈傷組織：多數(shù)植物幼胚形成愈傷組織。再分化成胚狀體或形成芽苗。,（3）影響幼胚培養(yǎng)成功的因素 培養(yǎng)基：無機(jī)鹽、碳水化合物、激素等 環(huán)境條件：溫度：多數(shù)為25-30℃，因植物種類有所差別。光照：一般認(rèn)為黑暗或弱光條件較為合適。) 提高幼胚的成活率，可采用胚乳看護(hù)培養(yǎng),（4）胚齡與胚性發(fā)育的關(guān)系 胚齡越小，離體培養(yǎng)越困難；胚的發(fā)育分為自養(yǎng)期和異養(yǎng)期，雙子葉植物

8、球形胚之前屬于異養(yǎng)，心形胚以后轉(zhuǎn)入自營養(yǎng)。,二、胚乳培養(yǎng),胚乳培養(yǎng)（Endosperm culture）：是指將胚乳組織從母體上分離出來，通過離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。 被子植物胚乳是由2個(gè)單倍的極核和1個(gè)單倍的精子結(jié)合而成的3倍體組織。由它可獲得無子結(jié)實(shí)的3倍體植株，進(jìn)而可將它加倍成6倍體植株。 裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳為配子體的一部分，由大孢子直接分裂發(fā)育而成，因此是單

9、倍體組織。,1、胚乳離體培養(yǎng)的意義（1）胚乳培養(yǎng)再生植株證明了全能性理論（2）研究胚和胚乳的關(guān)系及胚乳組織的功 能（3）再生植株多為三倍體，產(chǎn)生無籽果實(shí)（4）可以從胚乳愈傷中分離和篩選各種類型的非整倍體植株（5）胚乳細(xì)胞是研究淀粉、蛋白質(zhì)和脂類天然產(chǎn)物代謝途徑的理想系統(tǒng),2、胚乳培養(yǎng)過程 含胚乳的果實(shí)或種子→表面消毒→無菌條件下胚乳的剝離→接種培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)室溫度25-27℃，黑暗或弱光下,3、影響植物胚乳

10、培養(yǎng)的主要因素 胚乳是一種獨(dú)特的組織，在被子植物中它是雙受精的產(chǎn)物，在倍性上屬于三倍體，事實(shí)上我們培養(yǎng)胚乳的首要目的也是為了直接獲得三倍體植株。（1）基因型（2）胚乳的發(fā)生類型和發(fā)育程度：胚乳處于細(xì)胞形成期并仍保持旺盛分生能力。（游離胚乳核時(shí)期和成熟胚乳時(shí)期均不適合）。（3）胚因子 （4）培養(yǎng)基,4、胚乳培養(yǎng)的器官發(fā)生 愈傷組織形成、器官發(fā)生 （1）愈傷組織的誘導(dǎo)

11、（2）愈傷組織的再分化 （3）胚乳苗的生根培養(yǎng),三、胚珠和子房培養(yǎng),雌蕊與子房的類型,1、胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的意義（1）胚珠培養(yǎng)的意義: A、防止雜種胚早期敗育，獲得雜種植株； B、受精前胚珠培養(yǎng)，可作為試管受精的基礎(chǔ)； C、未受精胚珠培養(yǎng)，能培養(yǎng)獲得單倍體植株， 用于單倍體育種。,（2）子房培養(yǎng)的意義: A、獲得雜種植株； B、未授精子房培養(yǎng)為試管受精提供技術(shù)基礎(chǔ)；

12、 C、未受精子房培養(yǎng)能獲得獲得單倍體植株， 用于單倍體育種。,2、胚珠培養(yǎng) 胚珠培養(yǎng)：將胚珠從母株中分離出來，放在無菌的人工環(huán)境條件下，讓其進(jìn)一步生長發(fā)育，以致形成幼苗的過程。 根據(jù)胚珠是否受精分為兩類： 受精胚珠的培養(yǎng) 未受精胚珠的培養(yǎng),,3、胚珠培養(yǎng)的方法培養(yǎng)受精胚珠，摘取授粉時(shí)間合適的子房，如培未受精胚珠，則在授粉前摘取子房→表面滅菌→開子房壁，取出胚珠或帶胚珠的胎

13、座接種培養(yǎng)。4、影響胚珠培養(yǎng)成功的因素 （1）材料的選擇 （2）發(fā)育時(shí)期 （3） 胎座組織 （4）培養(yǎng)基,5、子房培養(yǎng)的技術(shù) 子房培養(yǎng)：將子房從母株上摘下，放在無菌的人工環(huán)境條件下，讓其進(jìn)一步生長發(fā)育，以至形成幼苗的過程。包括授粉子房和未授粉子房培養(yǎng)。 受精后的子房仍需進(jìn)行表面消毒后再接種。而未受精子房可將花被表面消毒后，在無菌條件下直接剝?nèi)∽臃拷臃N。 子房培養(yǎng)只需較簡單的培養(yǎng)基即可

14、形成果實(shí)，并含成熟種子。 子房培養(yǎng)的方法,授粉或授粉后的子房,表面消毒,接種培養(yǎng),,,6、影響子房培養(yǎng)的因素（1）材料的選擇：品種間的差異、胚囊發(fā)育時(shí)（2）培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基、激素、蔗糖（3-10）（3）接種方式：要注意極性；營養(yǎng)吸收7、 單倍體來源和發(fā)育途徑（1）由助細(xì)胞或胚囊的無配子生殖產(chǎn)生單倍體（2）卵細(xì)胞、助細(xì)胞、反助細(xì)胞均可發(fā)育產(chǎn)生單 倍體（3）非正常發(fā)育的大孢子四分體產(chǎn)生單倍體,四、離體授粉與離

15、體受精,1、離體授粉與離體受精的意義（1）可以克服遠(yuǎn)緣雜交中的不親和性，特別是離體子房授粉和離體胚珠授粉，能消除柱頭和花柱所造成的受精前障礙。（2）克服自我不親和性（3）誘導(dǎo)孤雌生殖（4）雙受精及胚臺早期發(fā)育的機(jī)理研究,2、離體授粉技術(shù) 離體授粉技術(shù)：將未授粉的離體胚珠或子房接種在培養(yǎng)上，然后在試管內(nèi)撒播花粉?；ǚ郯l(fā)芽后，花粉管長入胚珠內(nèi)受精。受精后的胚珠進(jìn)一步發(fā)育成種子。 根據(jù)授粉的部位可分為：離體胚珠授粉、

16、離體胎座授粉和離體柱頭授粉,3、離體受精技術(shù) 離體受精技術(shù)：在離體條件下完成被子植物精、卵融合，并將受精所所生的“人工合子”培養(yǎng)成再生植株。 離體受精技術(shù)的突破的技術(shù)前提：（1）雌配子和雄配子分離技術(shù)（2）單對原生質(zhì)體(精卵)融合技術(shù)（3）微培養(yǎng)技術(shù)(合子培養(yǎng)與植株再生技術(shù)),4、影響離體授粉與離體受精成功的因素 （1） 影響離體授粉結(jié)實(shí)的因素 培養(yǎng)材料的選擇和處理