瓊脂稀釋法操作步驟

1、瓊脂稀釋法操作步驟,,原理：,將抗菌藥物配制到瓊脂培養(yǎng)基中成：128ｕg/ml 、64ｕg/ml 、32ｕg/ml ……0.06ｕg/ml對(duì)倍稀釋的濃度系列多點(diǎn)接種器將制備好的細(xì)菌菌懸液迅速點(diǎn)種到瓊脂表面,經(jīng)35℃16-20小時(shí)培養(yǎng)肉眼觀察細(xì)菌生長(zhǎng),以未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)平板的最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC),抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備1,估算抗菌藥物最小稱(chēng)量瓊脂稀釋法最高藥物濃度為128ｕg/ml藥物和培養(yǎng)基的體積比1:14,即藥物濃度

2、將成15倍稀釋?zhuān)虼吮４嬉簽?128ｕg/mlΧ15 = 1920ｕg/ml如果1次用量為10ml ,則: 抗菌藥物最小稱(chēng)量=,,抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備2,抗菌藥物稀釋選擇合適的抗菌藥物稀釋液進(jìn)行藥物稀釋,稀釋液需要量見(jiàn)下列公式：稀釋液體積=,抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備3,實(shí)際操作：先計(jì)算完成一批試驗(yàn)需幾次完成,每次用量多少,然后可一起稱(chēng)量,一起稀釋,然后按每次需要量分裝在試管中,貼上標(biāo)簽,注明藥物名稱(chēng),濃度

3、,體積數(shù)及配制日期,置與≤-20℃保存,備用。,,培養(yǎng)基,菌液準(zhǔn)備1,生長(zhǎng)法：無(wú)菌環(huán)取4-5個(gè)菌落大小形態(tài)一致的菌落頂部后接種于4-5mlMH肉湯內(nèi)35℃ 培養(yǎng)4-6小時(shí)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，亦可過(guò)夜培養(yǎng),但不允許超過(guò)18小時(shí)用肉湯/生理鹽水校正至0.5麥?zhǔn)瞎軡舛?-2X108CFU/ml,菌液準(zhǔn)備2,直接菌落懸浮法：從孵育了18-24h新鮮培養(yǎng)物的平板上，用無(wú)菌環(huán)取單個(gè)菌落接種于無(wú)菌肉湯/生理鹽水內(nèi)校正至0.5麥?zhǔn)瞎軡舛?-2X1

4、08CFU/ml推薦用于苛氧菌和潛在的MRS,菌液準(zhǔn)備3,對(duì)絕大多數(shù)細(xì)菌來(lái)說(shuō),上述用生長(zhǎng)法或直接菌落懸浮法制備的0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?應(yīng)該再用無(wú)菌肉湯或生理鹽水行1:10稀釋,此時(shí)菌液濃度為1-2*107CFU/ml,調(diào)整好的菌液應(yīng)該在制備后的15分鐘內(nèi)完成點(diǎn)種,菌液準(zhǔn)備4,如一次實(shí)驗(yàn)需完成50株或100株細(xì)菌,則細(xì)菌要編上工作序號(hào)1-50或1-100,并在結(jié)果記錄紙上要一一對(duì)應(yīng)寫(xiě)上工作序號(hào)和菌種編號(hào),瓊脂稀釋法藥敏平板的制備 1,

5、配制融化的MH瓊脂或適合其他苛氧菌、厭氧菌等特殊細(xì)菌的培養(yǎng)基,待冷卻到48-50℃，澆制藥物平板。取滅菌的90mm平板12只,用記號(hào)筆在平板底部作好“點(diǎn)種標(biāo)記”、“藥物名稱(chēng)”、“藥物濃度”,濃度從0.06ｕg/ml……128ｕg/ml,每種濃度1只平板共12個(gè)濃度系列。,瓊脂稀釋法藥敏平板的制備2,取11支無(wú)菌玻璃試管(13Χ100mm),每支試管標(biāo)記為：960,480,240,120,60,30,15,7.5,3.75,1.875,

6、0.935ｕg/m,并于上述每根管子中用無(wú)菌移液管加無(wú)菌稀釋液1.5ml,瓊脂稀釋法藥敏平板的制備3,將保存在≤-20℃冰箱中的1920ｕg/ml濃度的抗菌藥物保存液取出融化后,用無(wú)菌移液管吸取2.5ml加入到128ｕg/ml標(biāo)記的平板內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1.5ml加入到960標(biāo)記的試管內(nèi),混勻后再吸取2.5ml加入到64ｕg/ml標(biāo)記的平板內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1.5ml再加入到480ｕg/ml標(biāo)記的玻璃試管內(nèi);混勻后再吸取2.

7、5ml依次類(lèi)推,直至最后一個(gè)0.06ｕg/ml標(biāo)記的平皿內(nèi)加入1ml,則抗菌藥物稀釋完成,瓊脂稀釋法藥敏平板的制備4,準(zhǔn)備2只無(wú)藥的平板,作點(diǎn)種前和點(diǎn)種后質(zhì)控對(duì)照所有藥物平板應(yīng)保持表面干燥,不可有肉眼可見(jiàn)的水珠(可在35℃孵箱內(nèi)倒置平板開(kāi)蓋烘干15-20分鐘),瓊脂稀釋法藥敏平板的制備5,如果需使用的藥物平板為100Χ100mm的方平板,則 每根玻璃管內(nèi)需加入2.5ml的抗菌藥物稀釋液； 每次無(wú)菌吸管吸取的抗菌藥物量應(yīng)該為4.5

8、ml 每只方平板應(yīng)加入2ml抗菌藥物試液 無(wú)菌吸管內(nèi)應(yīng)存留下2.5ml與下一個(gè)濃度的玻璃試管內(nèi)的2.5ml稀釋液進(jìn)行充分混勻 藥敏培養(yǎng)基應(yīng)加入28ml,測(cè)試菌液的點(diǎn)種1,預(yù)先將點(diǎn)種針和點(diǎn)種板高壓滅菌,并在孵箱內(nèi)烘干（52孔、100孔、或21孔）將已調(diào)整好濁度(1-2Χ107CFU/ml)的菌液用微量加樣器將菌液依次加入菌液點(diǎn)種板小孔內(nèi),并作好與藥物平板相應(yīng)的點(diǎn)種標(biāo)記,一般每小孔內(nèi)應(yīng)加入菌液270ｕl。每批試驗(yàn)均須保留有質(zhì)控菌位置

9、和無(wú)菌菌液位置用酒精棉球清潔多點(diǎn)接種器后，將點(diǎn)種針安裝在多點(diǎn)接種器架子上，再將加好菌液的點(diǎn)種板安置上多點(diǎn)接種器的點(diǎn)種板位置上,測(cè)試菌液的點(diǎn)種2,開(kāi)啟多點(diǎn)接種器進(jìn)行點(diǎn)種，因每一根點(diǎn)種針直徑約3mm,因此點(diǎn)種到藥物平板上每點(diǎn)的菌液量約為2ｕl，所以接種量為104 CFU/點(diǎn)點(diǎn)種時(shí)應(yīng)先點(diǎn)種對(duì)照前的質(zhì)控平板，然后從最低藥物濃度開(kāi)始點(diǎn)種依次點(diǎn)種到藥物濃度最高的平板,藥物平板的孵育,上述接種好的平板應(yīng)在室溫下靜置至接種點(diǎn)上的菌液被瓊脂完全吸收，

10、再將藥敏平皿倒置，于35℃孵育16-20小時(shí)如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，則需33-35℃，絕對(duì)不能超過(guò)35℃，孵育24小時(shí)，閱讀結(jié)果萬(wàn)古霉素藥敏試驗(yàn)的腸球菌和葡萄球菌等需孵24小時(shí)后，閱讀結(jié)果淋病奈瑟球菌需在5%CO2空氣環(huán)境中孵育20-24小時(shí)，閱讀結(jié)果,結(jié)果閱讀和判斷,結(jié)果閱讀時(shí)，平板應(yīng)置于黑色不反光的表面上，記錄的MIC是完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度，單個(gè)菌落或接種物所致的輕微的不清晰現(xiàn)象可忽略不計(jì)。如果在MIC判斷