動物實驗基本技術和方法_第1頁
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文檔簡介

1、動物實驗基本技術和方法,廣東藥學院實驗動物中心,主要內容,一、 實驗前準備二、實驗動物抓取與固定三、年齡的大致判斷四、性別、發(fā)情、與妊娠鑒定五、編號和標記六、分組七、去毛八、給藥途徑與方法九、采血方法十、其他體液采集十一、麻醉方法十二、處死方法十三、動物病理檢查,一、 實驗前準備,理論準備:了解動物實驗基礎知識 制定研究計劃和方案

2、 查閱關于實驗方法的參考文獻條件準備:儀器、器械、藥品 運輸 動物實驗和飼養(yǎng)場所,二、實驗動物抓取和固定,(一)小鼠,小鼠固定器固定,(二)大鼠,大鼠固定盒固定,(三)豚鼠,(四)家兔,兔子固定器固定,狗鉗,狗的抓取固定,(五)犬,犬嘴固定方法,貓的抓取,犬固定,(六)猴抓取與保定,猴徒手固定,三、年齡的大致判斷,

3、(一)大、小鼠1、根據(jù)形態(tài)鑒定日齡(大、小鼠情況基本一樣),2. 根據(jù)體重鑒定日齡⑴ 小鼠日齡與體重的對應,⑵ 大鼠日齡與體重的對應,(二)豚鼠一般老年豚鼠牙齒和趾爪長,被毛稀疏無光澤,眼神呆滯,行動遲緩。而年輕豚鼠牙齒短白,爪短軟,眼睛圓亮,行動敏捷,被毛有光澤,且緊貼身體。同樣,也可根據(jù)體重來推斷大致年齡。同日齡豚鼠,雌性體重略高于雄性。與大鼠一樣,其體重受多種因素的制約。實驗對年齡要求比較嚴格時,必須由卡片記錄提供準確年

4、齡。,(三)家兔 家兔的門齒和爪隨年齡增長而增長,是年齡鑒別的重要標志。青年兔門齒潔白,短小,排列整齊;老年兔門齒暗黃,厚而長,排列不整齊,有時破損。白色家兔趾小基本呈紅色,尖端呈白色。1歲家兔紅色與白色長度相等;1歲以下,紅多于白;1歲以上,白多于紅。還可根據(jù)趾爪的長度與彎曲度來區(qū)別。青年兔趾爪較短,直平,隱在腳毛中,隨年齡的增長,趾爪露出于腳毛之外,而且爪尖鉤曲。另外,家兔皮薄而緊,眼神明亮,行動活潑的為青年兔;皮厚而松,眼神頹廢

5、,行動遲緩的為老年兔。,(四)犬犬的年齡主要以牙齒的生長情況、磨損程度、外形顏色等情況綜合判定。仔犬在出生后十幾天即開始生出乳齒,2個月以后開始由門齒→犬齒→臼齒順序逐漸更換為恒齒,8~l0個月齒換齊。但犬齒需要1歲半以后才能長堅實。飼養(yǎng)場飼養(yǎng)的品種犬,可以根據(jù)記錄,明確了解年齡,而收購的雜種犬就無法知道確切年齡。實際中,可根據(jù)犬齒更換和磨損情況,估計犬的年齡。,四、性別、發(fā)情、與妊娠鑒定,(一)大、小鼠的性別鑒定,初生兔仔如陰部孔

6、洞扁圓而略大于肛門,且與肛門相向、距離較近的是母兔;孔洞呈圓形而略小于肛門,孔洞向前而距肛門較遠的是公兔。 三月齡以上的兔子,只要看有無陰囊即可區(qū)別公母。,(二)兔的性別鑒定,Female,Male,(三)大、小鼠發(fā)情鑒定,小鼠性周期陰道分泌物涂片變化,(四)妊娠鑒定,1、陰道栓法(大、小鼠、豚鼠)2、外部檢查法3、摸胎法4、陰道檢查法5、直腸檢查法6、超聲波檢查法7、孕酮含量測定法,陰道栓,五、編號和標記,1、染色

7、法:淺色動物 3.5-5%苦味酸溶液(黃色) 0.5%中性紅或堿性品紅溶液(紅色) 煤焦油酒精溶液(黑色) 龍膽紫溶液(紫色),2、打耳孔法:小型動物,3、剪趾法:小型動物,4、剪尾法:大、小鼠,僅限與兩組間區(qū)分5、烙印法:刺號鉗,中、大型動物6、針刺法:中、大型動物7、號牌法:耳標簽、項圈、腿圈,中、大型動物8、剪毛法:大動物9、籠子標號,六、分組,隨機化分組:避免人為影響

8、例:將14只小鼠隨機分成兩組。①先將小鼠編為I~14號,②在隨機數(shù)字表上任點一數(shù),按任意方向連續(xù)抄14個隨機數(shù)字。 編排如下:,動物編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14隨機數(shù)字 16 22 77 94 39 49 54 43 54 82 17 37 93 23歸 組 B B A B

9、 A A B A B B A A A A③奇數(shù)代表A織,偶數(shù)代表B組④A組: 3 5 6 8 11 12 13 14 B組: 1 2 4 7 9 10⑤調整分組:接剛才隨機數(shù)字23繼續(xù)抄表得隨機數(shù)字78,用78除以8(因為需要把A組的8個數(shù)字調整掉一個),得余數(shù)6,所以把A組的第6個動物,即12號

10、動物調整到B組,⑥ 最終分組A組: 3 5 6 8 11 13 14B組: 1 2 4 7 9 10 12,例:12只大鼠隨機分為3組①大鼠編號1~12②在隨機數(shù)字表上任點一數(shù),按任意方向連續(xù)抄12個隨機數(shù)字。③每個數(shù)分別用3除,記錄余數(shù),④ 根據(jù)余數(shù)分組大鼠編號:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12隨機數(shù)字:08,27,01,

11、50,15,29,39,39,43,79, 69,10余數(shù): 2, 0, 1, 2, 0, 2, 0, 0, 1, 1, 0, 1組別: B, C, A, B, C, B, C, C, A, A,C, A,⑤ A:3,9,10,12 B;1,4,6 C:2,5,7,8,11⑥調整分組:接剛才隨機數(shù)字10繼續(xù)抄表得隨機數(shù)字61,用61除以5(因為需要

12、把C組的5個數(shù)字調整掉一個),得余數(shù)1,所以把C組的第1個動物,即2號動物調整到B組。⑦最終分組 A:3,9,10,12 B;1, 2 ,4,6 C:5,7,8,11,七、去毛,1、剪毛:彎頭剪毛剪。2、拔毛:大小鼠尾靜脈、家兔耳緣靜脈注射。3、剃毛:將剃毛部位先用剪刀粗剪一遍,蘸溫肥皂水潤濕,用剃刀順著被毛方向剃毛,用電動剃毛推剪,則逆被毛向剃毛。,4、化學脫毛:常用脫毛劑①8%硫化鈉水溶液②硫化鈉

13、3份,洗衣粉1份、淀粉7份,加水調成糊狀③硫化鋇50克,氧化鋅25克,淀粉25克,加水100毫升調成糊狀④硫化鈉10克,生石灰15克,加水到100毫升,適合犬和其他大動物。,八、給藥途徑與方法,(一)自動口服:加入飼料或飲水(二)投喂藥片:掰開口,放到舌根部,(三)灌胃(i.g),1、小鼠、大鼠、豚鼠 灌胃時將灌胃針按在注射器上,吸入藥液。左手抓住鼠背部及頸部皮膚將動物固定,右手持注射器,將灌胃針插入動物口中,沿咽后壁徐徐

14、插入食道。動物應固定成垂直體位,針插入時應無阻力。若感到阻力或動物掙扎時,應立即停止進針或將針拔出,以兔損傷或穿破食道以及誤入氣管。  一般當灌胃針插入小鼠3~4cm,大鼠或豚鼠4~6cm后可將藥物注入。常用的灌胃量小鼠為0.2~ 1ml,大鼠1~4ml,豚鼠為1~5ml。,2、狗、兔、貓、猴  灌胃時,先將動物固定,再將特制的擴口器放入動物口中,擴口器之寬度可視動物口腔大小而定,如狗的擴口器可用木料制成長方形,長約

15、10~15cm,粗細應適合狗嘴,約2~3cm,中間粘一小孔,孔的直途為5~10cm。灌胃時將擴口器放于上述動物上下門牙之后,并用繩將它固定于嘴部,將帶有彈性的橡皮導管(如導尿管),經(jīng)擴口器上的小圓孔插入,沿咽后壁而進入食道,此時應檢查導管是否正確插入食道,可將導管外口置于一盛水的燒杯中,如不發(fā)生氣泡,即認為此導管是在食道中,未誤入氣管,即可將藥液灌入。灌胃管插入長度狗為20cm,兔子為12-15cm。,動物最大灌胃量,(四)直腸給藥

16、(五)呼吸道給藥 (六)滴鼻 (七)點眼 (八)經(jīng)皮膚給藥:常用于檢測藥物、毒物、化妝品等的透皮吸收、局部作用、至敏作用等。家兔和豚鼠選擇脊柱兩側皮膚,大小鼠常采取浸尾方式。 (九)皮內注射(i.d):一般用于接種或過敏實驗。將藥液注射在真皮和表皮之間。皮內注射時需將注射的局部脫去被毛,消毒后,用左手拇指和食指按住皮膚并使之繃緊,在兩指之間,用注射器連4(1/2)號細針頭,緊貼皮膚表層刺入皮內,然后再向上挑起并再稍刺入,即可注射

17、藥液,此時可見皮膚表面鼓起一白色小皮丘。,(十)皮下注射(s.c):注射時以左手拇指和食指提起皮膚,將連有5(1/2)號針頭的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、貓多在大腿外側,豚鼠在后大腿的內側或小腹部;大白鼠可在側下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。(十一)肌肉注射(i.m):股部肌肉,(十二)腹腔注射(i.p):用大、小白鼠做實驗時,以左手抓住動物,使腹部向上,右手將注射針頭于左(或右)下腹部刺入皮

18、下,使針頭向前推 0.5~1.0cm,再以45度角穿過腹肌,固定針頭,緩緩注入藥液,為避免傷及內臟,可使動物處于頭低位,使內臟移向上腹。若實驗動物為家兔,進針部位為下腹部的腹白線離開1cm處。,(十三)靜脈注射(i.v):,1、小鼠:尾靜脈2、大鼠:尾靜脈、 陰莖靜脈、 舌下靜脈、 淺背側跖靜脈,大小鼠有上、左、右3根尾靜脈,成

19、品字型,小鼠尾靜脈注射,,大鼠陰莖靜脈注射,大鼠舌下靜脈注射,大鼠淺背側跖靜脈注射,3、豚鼠:淺背側跖靜脈、耳靜脈注射4、家兔:耳靜脈注射5、豬:耳緣靜脈6、猴:前肢橈靜脈、后肢隱靜脈注射,豬耳緣靜脈注射,7、貓、狗:前肢內側頭靜脈、后肢外側小隱靜脈注射,狗前肢內側頭靜脈,狗后肢外側小隱靜脈,猴的后肢皮下靜脈注射,(十四)腦腔注射:1、小鼠 小指夾鼠尾,拇指和是指置小鼠頭兩側固定,中指和無名指壓住鼠身,在注射

20、處消毒后,右手持注射器,以食指固定針芯,垂直刺入針頭深度約5~7mm。2、兔 將兔用固定器固定好,剃去頭頂?shù)谋幻?,左手將頭皮繃緊,消毒后,右手持錐子,自頭頂正中稍偏一側部位,錐穿頭骨,即換以左手固定錐子,右手持注射器,使針頭沿錐尖刺入,慢慢拔出錐子,即刻將針頭刺入約10~20mm,即可推液。,(十五)關節(jié)腔注射:(十六)椎管內注射:注射入蛛網(wǎng)膜下腔(十七)淋巴囊內注射:蛙和蟾蜍,(十八)小腦延髓池注射:,幾種動物

21、不同給藥途徑的常用注射量(毫升),九、采血方法,(一)大、小鼠:1、眶靜脈叢(竇): 少量多次采大小鼠血。 小鼠0.2~0.3ml, 大鼠0.4~0.6ml2、摘眼球:用于一次大量采小鼠血,可得到4~5%體重的血量3、尾靜脈:用于少量多次采大小鼠血,尾靜脈采血,4、剪頭:用于一次性大量采小鼠血,可得到0.5~1.0ml的血量5、大血管:包括頸動脈(靜脈),股動脈(靜脈),腋下動脈(靜脈),腹主動脈,此方法

22、不常用于小鼠采血,而多用于大鼠一次性大量采血??傻?ml左右血量。6、心臟采血:小鼠少用,可用于大鼠一次性(開胸)或多次采血(不開胸)。,心臟采血,(二)家兔 :1、耳緣靜脈:中等血量的采集,可反復采血,每次5~10ml。2、耳中央動脈:可反復采血,每次10~15ml。,3、心臟采血:可用于 一次性(開胸)或 多次采血(不開胸)。 一次性開胸采血可 得到80~100ml血量4、頸動靜脈采血:用于一次

23、性采血,需要手術,可得血量80~10ml。,(三)豚鼠:1、心臟采血:可用于一次性(開胸)或多次采血(不開胸)。一次性開胸采血可得到5~10ml血量。2、背跖靜脈采血:用于少量反復采血。3、耳緣剪口采血,(四)犬貓:和靜脈注射部位相同,前肢內側頭靜脈、后肢外側小隱靜脈。也可頸靜脈(動脈)或心臟采血。,(五)豬:前腔靜脈或耳大靜脈采血(六)羊:頸靜脈采血(七)猴:前肢頭靜脈、后肢皮下靜脈或耳緣靜脈等。(八)禽類:翼下靜脈,仔豬

24、前腔靜脈采血,采血注意事項,(一)采血場所有充足的光線;室溫夏季最好保持在25~28℃,冬季,15~20℃為宜;(二)采血用具有采用部位一般需要進行消毒;(三)采血用的注射器和試管必須保持清潔干燥;(四)若需抗凝全血,在注射器或試管內需預先加入抗凝劑。(五)注意不同動物的采血量采血。,1、取少量血,,2、取中量血,3、取大量血,4、最大安全采血量與最小致死采血量,常用抗凝劑:1、肝素:抑制凝血酶活力,阻止血小板凝集。純品肝素1

25、mg=125U,10U~20U抗1ml血凝集,但通常應用2~3倍劑量。 用法:可配成1%肝素溶液,用時取0.1ml于試管內,100℃烘干,每管可抗凝5~10ml血?;蛴?%肝素溶液濕潤采血注射器。 肝素可改變蛋白質等電點,當用鹽析法分離蛋白作分類測定時,不可用肝素抗凝。,2、枸櫞酸鈉:使凝血必需的鈣離子失活。常用3~5%水溶液,堿性較強。3、草酸鹽合劑:草酸銨1.2g,草酸鉀0.8g,福爾馬林1.0ml,加蒸餾水至100

26、ml。使凝血必需的鈣離子失活。每毫升血加草酸鹽合劑0.1ml。4、氟化鈉:每毫升血加6mg。,十、其他體液采集,1、胸水、腹水采集:穿刺2、消化液采集:唾液,胃液,胰液,膽汁3、精液采集:中、大動物用假陰道,小動物穿刺附睪來采集精液。4、腦脊液采集:手術或小腦延髓池抽取5、骨髓采集:大動物活體穿刺,小動物處死后取股骨或胸骨骨髓。,6、尿液采集:代謝籠收集導尿管采集膀胱穿刺壓迫排尿,十一、麻醉方法,(一)麻醉方法:1、

27、全麻 吸入麻醉,靜脈注射、腹腔注射。2、局麻 浸潤麻醉。根據(jù)手術,按皮下、筋膜、肌肉、腹膜、骨膜等順序逐步深入注射到術野周圍。,(二)麻醉前準備:1、禁食8~12h,防止嘔吐,可飲水。2、根據(jù)實驗部位和種類,給動物脫毛。3、犬、豬、猴等大動物可在麻醉前給予一些藥物以減少動物緊張,減少支氣管分泌。,(1)阿托品:減少支氣管和唾液腺分泌,防止氣管阻塞。副作用:加快心率。用量:肌肉或皮下注射0.04mg/kg(2)安定:

28、產生鎮(zhèn)靜作用,加強麻醉效果,使骨骼肌松弛。用量:2.5~5mg/kg(3)嗎啡:產生鎮(zhèn)靜作用。副作用:抑制呼吸中樞。用量:皮下注射1~2mg/kg,肌肉注射10~20mg/kg。,(三)麻醉藥物:1、全麻藥物(1)乙醚:強揮發(fā)性、易燃。乙醚是最常用的吸入麻醉劑,各種動物適用。 機制:抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)。 特點:安全范圍大,肌肉完全松弛,對肝腎毒性小,麻醉誘導期和蘇醒期較長。副作用:局部刺激大,引起上呼吸道黏膜分泌增加,導

29、致呼吸道阻塞,可用阿托品對抗解救。,(2)巴比妥類:種類很多,有巴比妥鈉,戊巴比妥鈉,硫噴妥那,苯巴比妥鈉等。適用于各種動物。如實驗中大小鼠常用3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射進行麻醉。 特點:安全范圍廣,毒性小,麻醉潛伏期短,麻醉維持時間長??筛骨换蜢o脈給藥。機理:阻斷神經(jīng)沖動傳遞到大腦。 副作用:過量使用可導致呼吸肌麻痹而死亡,同時抑制末梢循環(huán),導致血壓降低,并影響基礎代謝,導致體溫降低。,(3)氯胺酮:常用其鹽酸鹽

30、。 特點:麻醉潛伏期短,麻醉維持期僅10~20min,麻醉淺,安全性高,可重復給藥。 機制:阻斷大腦聯(lián)絡途徑。 副作用:興奮心血管系統(tǒng),使血壓升高,心率加快,偶爾引起嘔吐。(4)水合氯醛:作用特點和巴比妥類相似。但安全范圍小,麻醉劑量和中毒劑量接近,對皮膚和黏膜有較強刺激。,2、局麻藥物(1)普魯卡因:是無刺激性的局麻藥物。 特點:麻醉速度快,注射后1~3分鐘就可產生麻醉??梢跃S持30~45分鐘。對皮膚和黏膜

31、穿透力很弱,需要注射給藥才能產生局麻效果。它可以使血管舒張,易被吸收入血液而失去效果。在其溶液中加入腎上腺素(每100ml加入0.1%腎上腺素0.2~0.5ml)可以使麻醉時間延長1~2小時。,(2)利多卡因:效力和穿透力比普魯卡因強。(3)的卡因:化學結構和普魯卡因類似,效力和穿透力比普魯卡因強。,(四)實驗動物的急救,動物實驗過程中,可因麻醉藥過量、出血過多、分泌物或血塊堵塞氣管造成窒息以及某種藥物原因引起動物血壓、呼吸不規(guī)則等現(xiàn)

32、象,此時應立即進行急救處理措施。 急救處理措施首先要迅速排查原因,并中斷誘因(如止血、停藥、排除分泌物等),然后對癥實施急救措施。,1、呼吸、心跳(血壓)的改變 動物實驗過程中,需密切觀察實驗動物的呼吸、心跳及血壓的變化,一者它們是實驗反應的數(shù)據(jù)指標,二者是實驗動物狀態(tài)的主要指征。尤其對呼吸的觀察,因為動物的死亡首先是呼吸的停止。(1)誘發(fā)原因 ①麻醉給藥速度過快或過量:實施靜脈給藥麻醉,可因給藥速度過快或

33、過量導致呼吸停止。因此,為防止麻醉劑過量,注射速度一定不要過快,嚴密觀察動物狀況,若需追加麻醉劑,一次不宜超過總量的1/5。,②氣道不暢或堵塞:常見于麻醉后,因為氣管分泌物增多或氣管切口的出血凝塊堵塞氣管,動物呼吸不規(guī)則、呼吸困難甚至引起的窒息。 ③大失血:如因大動脈插管的松脫所造成的大失血。 ④實驗藥物的作用:如靜脈注射乙酰膽堿過量或動物對其反應過強,引起心搏減弱減慢,繼而出現(xiàn)呼吸、心跳的停止。,2、急救措施

34、 (1)迅速排查、中斷、排除誘因。如應用棉簽清除干凈氣管、氣管插管內的分泌物及血凝塊。必要時拔出氣管插管沖洗后再行氣管插管術。 (2)根據(jù)下列不同情況采取相應的急救措施:①呼吸極慢、不規(guī)則,但心跳正常時:給予人工呼吸-壓胸法,適當給予蘇醒劑。②呼吸停止仍有心跳時:實施人工呼吸,必要時可使用人工呼吸機或吸氧(吸入氣中O2占95%,CO2占5%);注射50%葡萄糖液5~10ml;給腎上腺素及蘇醒劑。③呼吸、心跳

35、均停止時:用l:10000腎上腺素溶液心內注射,其余同②。,3、大失血 (1)誘發(fā)原因 多因動脈插管結扎不牢、動物掙扎,導致大動脈插管的松脫,或在進行動脈插管術時,因未放置動脈夾或動脈夾夾閉不全而剪切動脈引起。 (2)急救措施 ①立即止血:應迅速手指壓迫或捏住出血處(盡量不要用止血鉗,以防損傷動脈和神經(jīng)),然后仔細檢查分離出血點,于近心端放置動脈夾,再行動脈插管術。 ②補充血容量:若失血太多,適當加快輸液(生

36、理鹽水)速度,增加血容量。 ③注射強心劑:靜脈注射1︰10000腎上腺素0.5ml。,十二、處死方法,1、頸椎脫臼法:小鼠、大鼠2、空氣栓塞法:兔、貓、犬等大動物3、放血法:心臟放血或大血管放血4、斷頭法:小鼠、大鼠5、吸入二氧化碳6、麻醉法:如注射巴比妥類藥物,十三、動物病理檢查,(一)一般病理檢查,1、實驗動物不明原因死亡或實驗需要時必須進行尸檢以查明死亡原因。2、對動物進行尸檢應該在動物死亡后立即進行,不能立即進行的

37、需在冷凍的條件下保存動物尸體,以盡量保持病變與死亡前狀態(tài)一致。3、外觀檢查:檢查動物的發(fā)育狀況、營養(yǎng)狀況、精神狀態(tài)、感覺器官、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚及被毛等指標。4、病理剖檢:主要觀察組織器官的大小、色澤、質地、切面和粘膜等指標。,(二)組織病理學檢查,1、取材:按要求切取相應的組織器官,并用固定液進行固定。2、制片:按程序將切取的組織器官制作成組織切片。3、讀片:在顯微鏡下觀察動物的心、肝、脾、肺、腎、腦等重點器官。尸體需

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