常用儀器分析匯報

1、儀器分析匯報,孫雁斌,紅外光譜分析流式細胞儀激光掃描共聚焦顯微鏡動態(tài)光散射儀核磁共振波譜分析,紅外光譜分析（IR）,紅外光譜(Infrared Spectroscopy, IR) 又稱分子振動-轉(zhuǎn)動光譜，屬分子吸收光譜。樣品受到頻率連續(xù)變化的紅外光照射時，分子吸收其中一些頻率的輻射，分子振動或轉(zhuǎn)動引起偶極矩的凈變化，使振-轉(zhuǎn)能級從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，相應于這些區(qū)域的透射光強減弱，記錄百分透過率T%對波數(shù)或波長的曲線，即紅

2、外光譜。,,近紅外光譜區(qū)：低能電子能級躍遷含氫原子團：-OH、-NH、-CH伸縮振動的倍頻吸收峰稀土及過渡金屬離子配位化學的研究對象適用于水、醇、高分子化合物、含氫原子團化合物的定量分析 中紅外光譜區(qū)：分子的振動、轉(zhuǎn)動基頻吸收光譜區(qū)應用最為廣泛的紅外光譜區(qū),遠紅外光譜區(qū)：氣體分子的轉(zhuǎn)動能級躍遷液體與固體中重原子的伸縮振動晶體的晶格振動某些變角振動、骨架振動-異構(gòu)體的研究金屬有機化合物、氫鍵、吸附現(xiàn)象研究該光區(qū)能

3、量弱,較少用于分析,紅外光譜的應用及特點：,應用：推斷分子的結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型；測定分子的鍵長、鍵角推斷化學鍵的強弱及極性；計算相關(guān)熱力學參數(shù)等特點：能夠更為精細的表征分子結(jié)構(gòu)的差別；測定快速、靈敏度高、試樣用量少；能分析各種狀態(tài)的試樣，應用范圍廣；與色譜等儀器聯(lián)用具有強大的定性功能,色散型紅外光譜儀,產(chǎn)生紅外吸收的條件,輻射光子的能量應與振動躍遷所需能量相等。輻射與物質(zhì)間有偶合作用，產(chǎn)生偶極矩變化。,峰數(shù)目——分子的振動自由度,

4、振動自由度= 3N -（平動自由度+轉(zhuǎn)動自由度）線性分子：振動自由度= 3N - 5非線性分子：振動自由度= 3N - 6例：水分子,吸收峰數(shù)目少于振動自由度的原因：,存在沒有偶極矩變化的振動模式存在能量簡并態(tài)的振動模式，即振動頻率相同的峰重疊 振動吸收的強度小，儀器的分辨率分辨不出，從而檢測不到某些振動模式所吸收的能量不在中紅外光譜區(qū)。,吸收峰的位置及影響因素,虎克定律：k：化學鍵的力常數(shù)，與鍵能和鍵長有關(guān)μ：雙原子的

5、折合原子量任意兩個相鄰的能級間的能量差為：化學鍵鍵強越強，鍵的力常數(shù)k越大,原子折合質(zhì)量μ越小，化學鍵的振動頻率越大，吸收峰將出現(xiàn)在高波數(shù)區(qū)。,電子效應：誘導效應、吸電效應；使吸收峰向高波數(shù)方向移動（藍移）共軛效應：n-?共軛效應（中介效應），?-?共軛效應（C效應）；使吸收峰向低波數(shù)方向移動（紅移）氫鍵效應：分子內(nèi)氫鍵、分子間氫鍵；使吸收峰向低波數(shù)方向移動（紅移）振動耦合：當兩個振動頻率相同或相近的基團相鄰并由同一原子相連

6、時，兩個振動相互作用產(chǎn)生共振，吸收譜帶裂分，形成雙峰（高頻和低頻）。,費米共振：當一振動的倍頻與另一振動的基頻接近（2νA= ν B）時，二個振動相互作用而產(chǎn)生強吸收峰或者發(fā)生譜帶裂分的現(xiàn)象?？臻g效應:由于空間阻隔，分子平面與雙鍵不在同一平面，此時共軛效應下降，吸收峰藍移。張力效應:環(huán)張力：四元環(huán) > 五元環(huán) > 六元環(huán);環(huán)外雙鍵隨環(huán)張力增加，吸收峰藍移。環(huán)內(nèi)雙鍵隨環(huán)張力增加，吸收峰紅移物質(zhì)狀態(tài)：由固態(tài)向氣態(tài)轉(zhuǎn)變時，其

7、紅外吸收峰將藍移。溶劑效應：極性基團的伸縮振動峰隨溶劑極性增加而紅移。,特征區(qū)與指紋區(qū),特征峰：與官能團相聯(lián)系的、在一定頻率范圍內(nèi)出現(xiàn)的化學鍵的振動吸收峰。特點：吸收峰稀疏、較強，易辨認,,指紋區(qū)：1300~900 cm-1： C-X (X：O、N、F、P、S)、 P-O、Si-O伸縮振動區(qū) 900~40

8、0 cm-1： -CH2平面搖擺、苯環(huán)取代、 C-H面外變形振動區(qū)特點：吸收峰密集、難辨認,流式細胞儀（FCM）,流式細胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）是以激光為光源、檢測生物學顆粒理化性質(zhì)的儀器。流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是應用流式細胞儀對懸浮液中的細胞或細胞器進行快速測量和多參數(shù)檢測的細胞分析技術(shù)。同時依賴測量

9、到的參數(shù)還可以用物理的方法將一個群體中的細胞亞群分選出來，即流式細胞分選術(shù)。,FCM與其他細胞分析技術(shù)相比，有如下特點：高速度：每秒可檢測1 000~5 000個細胞。高靈敏度：每個細胞只要帶有1 000~3 000個熒光分子就能檢出，兩個細胞之間有5%的差別就可區(qū)分出來，光散射的靈敏度為0.3um。高精度：在細胞懸液中測量細胞，比其他分析技術(shù)的變異系數(shù)更小，分辨率高。高純度：分選細胞的純度可大于99%以上。多參數(shù)：可同時定量

10、檢測單個細胞的DNA等多個參數(shù)。在適當?shù)臈l件，可對活細胞進行無害性分析和分選。,流式細胞儀基本結(jié)構(gòu),流式細胞儀基本結(jié)構(gòu)包括五部分：以上整個系統(tǒng)由電子電路和計算機控制，用以收集、顯示、分析、儲存被測定的各種信號及控制細胞的分選收集。,流式細胞儀基本原理,流式細胞術(shù)光信號,散射光信號：與標記熒光素無關(guān)，是細胞的固有參數(shù)。前向散射光(forward scatter, FSC)：激光器正前方1 -6度方向上有比較強的衍射光，即前

11、向散射光，F(xiàn)SC強度是d/λ的函數(shù)，反映被測細胞的體積大小和活力。側(cè)向散射光(side scatter, SSC)：SSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散射光，其信號強度反映細胞內(nèi)部顆粒度和精細結(jié)構(gòu)的變化。,,熒光信號（fluorescence，F(xiàn)L）：熒光素的電子吸收光的能量由低能態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軕B(tài)，再回到低能態(tài)時釋放出的光。自發(fā)熒光：微弱（核黃素、色素分子等）特異熒光：熒光素分子發(fā)出的的熒光比自發(fā)熒光強很多倍

12、。,細胞信號的顯示,一維直方圖（histogram）：單參數(shù)直方圖表示一個參數(shù)與細胞數(shù)量間的關(guān)系，橫坐標（X軸）表示熒光或散射光強度的相對值，其單位用在流式細胞儀中用“道”表示，道數(shù)與熒光強度之間是線性或?qū)?shù)關(guān)系，依儀器分析時放大器的性質(zhì)而定?？v坐標（Y軸）通常代表細胞出現(xiàn)的頻率或相對細胞數(shù)量，絕對細胞數(shù)較少使用。在直方圖中，每個峰表示在某些方面性質(zhì)相同的一群細胞，若用“標尺”把各峰分開成區(qū)間，即可統(tǒng)計分析出各個區(qū)間內(nèi)細胞所占百分比、

13、及光散射或熒光強度的峰值、平均值、標準差、變異系數(shù)等。,,二維點圖（dot plot）：二維點圖表示兩個參數(shù)與細胞數(shù)量間的關(guān)系。在二維點圖中，每個點代表一個細胞，根據(jù)細胞性質(zhì)的不同，在二維點圖上就會出現(xiàn)若干群細胞，即為不同的細胞亞群。若用“門”把各亞群細胞分開并進行統(tǒng)計分析，可得各亞群細胞所占百分比、及平均熒光強度等。,,假三維圖：任選FSC、SSC、FL1~FL3中任何兩個參數(shù)為X軸和Y軸，以細胞數(shù)量為Z軸，就構(gòu)成了三維圖。因Z軸細

14、胞數(shù)量不是直接測量參數(shù)，實際上仍是二維圖，故稱為假三維圖。該圖對細胞亞群的觀察更為直觀。二維等高圖：用不同高度的平面切割假三維圖，將這些切割投影到X、Y平面上，就形成了等高圖，等高圖由類似地圖上的等高線組成，等高線密集的地方，就是細胞數(shù)變化快的地方。該圖對觀察細胞的分布趨勢優(yōu)于二維點圖。,,三維圖（3D）及四參數(shù)平面圖：三維圖：在FSC、SSC、FL1~FL3中任選三個參數(shù)為X軸、Y軸和Z軸，就構(gòu)成了一個三維圖，在三維空間中，每一群

15、細胞各處于獨立的空間位置。該圖對復雜的細胞亞群分析更為直觀、準確，但對其數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析較難。四參數(shù)平面圖：四參數(shù)平面圖分析對數(shù)據(jù)分布的觀察也有一定意義。,直方圖 散點圖 假三維圖,二維等高圖

16、 三維圖,流式細胞儀的使用,制備合格的單細胞懸液。對需測量的細胞生物化學成分進行熒光標記染色。進行流式細胞儀測量。對測量資料進行定量分析。對測量分析結(jié)果在生物學上的意義予以解釋。,,流式對照的設(shè)置,空白對照：設(shè)置空白對照（未染色的細胞），用以區(qū)分細胞的自發(fā)熒光和特異性熒光，避免假陽性的結(jié)果。同型對照：同型對照是指使用與實驗抗體相同種屬來源、相同劑量及同種免疫球蛋白的相同亞型的抗體作為對照，用于消除抗體非特異性

17、結(jié)合到細胞上而產(chǎn)生的背景熒光。單標對照：由于熒光素的寬發(fā)射譜特點，熒光通道間有光譜重疊現(xiàn)象。多色流式實驗的時候需要通過補償調(diào)節(jié)消除光譜重疊影響。,激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）,激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope;LSCM):以激光作為光源，激光器發(fā)出的激光通過照明針孔形成點光源， 經(jīng)過透鏡、分光鏡形成平行光后，再通過物鏡聚焦在樣品上，并對樣品內(nèi)聚焦平面上的每一點進行掃描。樣品

18、被激光激發(fā)后的出射光波長比入射光長，可通過分光鏡，經(jīng)過透鏡再次聚焦，到達探測針孔處，被后續(xù)的光電倍增管檢測到，并在顯示器上成像，得到所需的熒光圖像，而非聚焦光線被探測針孔光欄阻擋，不能通過探測針孔，因而不能在顯示器上顯出熒光信號。這種雙共軛成像方式稱為共聚焦。因采用激光作為光源，故稱之為“激光掃描共聚焦顯微鏡”。,激光掃描共聚焦顯微鏡的基本結(jié)構(gòu),激光光源掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測器）自動顯微鏡控制系統(tǒng)（數(shù)字信

19、號處理器、計算機）圖象輸出設(shè)備（顯示器、打印機、存儲器）,激光掃描共聚焦顯微鏡的基本原理,利用放置在光源后的照明針孔(P1)和放置在檢測器前的探測針孔(P2)實現(xiàn)點照明和點探測；激光經(jīng)過照明針孔形成點光源，由物鏡聚焦在樣品焦面的某個點上，只有該點所發(fā)射 的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光線被探測器阻擋，不能到達PMT探測器，從而提高了成像效果。照明針孔和探測針孔 共焦，共焦點為被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面。,共聚焦

20、顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別,Fluorescent Microscope,Confocal Principle,抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學切片增加側(cè)向分辨率由于點對點掃描去除了雜散光的影響,激光掃描共聚焦顯微鏡的優(yōu)越性,動態(tài)連續(xù)掃描及三維圖像重組同時多種物質(zhì)標記瞬時分辨率高高質(zhì)量數(shù)字圖像,熒光樣品的制備要求,熒光標記反應特異性強，熒光信號定位準確保持樣品應有的形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性熒光信

21、號響應百準確靈敏，具有可重復性熒光強度適度熒光穩(wěn)定性好樣品的熒光分布均勻圖象背景干凈，干擾雜質(zhì)少,激光掃描共聚焦顯微鏡的應用,細胞生物學：細胞結(jié)構(gòu)、細胞骨架、細胞膜結(jié)構(gòu)等； 生物化學：酶、核酸、 FISH 、受體分析等；藥理學：藥物對細胞的作用及其動力學等；生理學：膜受體、離子通道、離子含量、分布、動態(tài)等；遺傳學和組胚學：細胞生長、染色體分析、基因表達、基因診斷等； 神經(jīng)生物學：神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞

22、質(zhì)的成分、運輸和傳遞等； 微生物學和寄生蟲學：細菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)等； 病理學及病理學臨床應用：活檢標本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷等； 生物學、免疫學、環(huán)境醫(yī)學和營養(yǎng)學：免疫熒光標記（單標、雙標）的定位，細胞膜受體或抗原的分布等。,動態(tài)光散射儀,動態(tài)光散射Dynamic Light Scattering(DLS)，也稱光子相關(guān)光譜Photon Correlation Spectrosc

23、opy (PCS) ，準彈性光散射quasi-elastic scattering，是一種通過測量樣品散射光強度起伏的變化來得出樣品顆粒大小信息的一種技術(shù)。DLS技術(shù)測量粒子粒徑，具有準確、快速、可重復性好等優(yōu)點，還具有測量Zeta電位、大分子的分子量等的能力，已經(jīng)成為納米科技中比較常規(guī)的一種表征方法,動態(tài)光散射儀原理,,假設(shè)粒子一樣大的，有單 一的、良好的擴散系數(shù)，且溫度保持不變。小顆粒在溶液中“抖 動”相對迅速，就得到一個快速波動

24、的強度信 號。相比之下，大顆粒擴散地更慢，導致強度 信號又慢又大。,從擴散系數(shù)獲得粒度,散射光強度與時間的關(guān)系是符合統(tǒng)計規(guī)律，引入“自動相關(guān)函數(shù)C (t’)”，通過拉普拉斯逆轉(zhuǎn)換，將光信號轉(zhuǎn)換成指數(shù)光譜的形式進行數(shù)據(jù)處理，從而將雜亂的強度起伏圖就變成了有規(guī)則的C( t’)平滑曲線。變量τ是一個的指數(shù)函數(shù)里特定的衰變時間常數(shù)，控制自相關(guān)函數(shù)C(t)向long-t極限值(基線B)衰變的速度。因此，粒子越大擴散系數(shù)越小，產(chǎn)生的波動越慢，衰減時

25、間常數(shù)τ就越大。,,通過粒子衰變常數(shù)τ就能夠得到的擴散系數(shù)D1/τ= 2DK2或者D =(1/2K2)(1/τ)k “散射光波矢量”，是一個常數(shù)，由溶液中的激光的波長和PMT探測器接收到的散射光散射角θ決定。K = (4πn/λ) sin θ/2 K = 1.868×105 cm-1（n溶劑折射率；θ= 90°；λ= 632.8nm）D = kT / 6πηR（ K玻耳茲曼常數(shù)，T溫度，η溶液的剪切粘度）

26、,動態(tài)光散射技術(shù)的優(yōu)點：,樣品制備簡單，不需特殊處理，測量過程不干擾樣品本身的性質(zhì)，所以能夠反映出溶液中樣品分子的真實狀態(tài)測量過程迅速，樣品可以回收利用檢測靈敏度高能夠?qū)崟r監(jiān)測樣品的動態(tài)變化,核磁共振波譜分析（NMR）,將磁性原子核放入強磁場后會發(fā)生磁能級分裂，用適宜頻率的電磁波照射，處于低能級的原子核發(fā)生能級躍遷會吸收能量，同時產(chǎn)生核磁共振信號，得到核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance，NMR）分

27、析測定時，樣品不會受到破壞，屬于無破損分析方法結(jié)構(gòu)分析的重要工具之一，獲取的結(jié)構(gòu)信息豐富,核磁共振的原理,將自旋核置于外磁場H0中時，根據(jù)量子力學原理，由于磁矩與磁場相互作用，磁矩相對于外加磁場有不同取向，它們在外磁場方向的投影是量子化的，可以用磁量子數(shù)(m)描述： m=I ，I-1，I-2，…，-I 2I+1個取向其中I是核的自旋量子數(shù)，只有I﹥0時原子核才有自旋角動量和自旋現(xiàn)象。

28、,對于具有一定自旋量子數(shù)I、磁量子數(shù)m的核量子化能級的能量為： H0 ：外加磁場強度 β ：核磁子 μ ：核磁矩 相鄰兩個能級的能量差：當用頻率為υ的電磁波照射被外磁場分裂了的自旋1H核且滿足：1H核自旋產(chǎn)生的磁場與外磁場發(fā)生相互作用，磁矩的取向發(fā)生改變，即處于低能態(tài)的核吸收了射頻能量而躍遷至高能態(tài)，發(fā)生了核磁共振吸收。,原子核在自旋的同時，還以外磁場方向為軸線發(fā)生回旋，這種回旋運動稱為拉摩爾進

29、動： ω0自旋角速度 υ0進動線頻率 γ磁旋比當電磁波的照射頻率υ與進動頻率υ0相等時， 發(fā)生核磁共振吸收，核磁矩取向發(fā)生改變。,,核有自旋(磁性核)有外磁場時，能級裂分照射頻率滿足：,固定磁場，改變射頻頻率，掃頻法，較困難固定射頻頻率，改變磁場，掃場法，通常用,連續(xù)波核磁共振儀,脈沖傅里葉變換核磁共振波譜儀,不是通過掃場或掃頻產(chǎn)生共振；恒定磁場，施加全頻脈沖，產(chǎn)生共振，采集產(chǎn)生的感應電流信號，

30、經(jīng)過傅立葉變換獲得一般核磁共振譜圖,樣品的制備,試樣濃度： 5~10%，0.1~0.5mol/L； 需要純樣品15-30 mg； 傅立葉變換核磁共振需要純樣品1 mg ；標準樣品：四甲基硅烷 TMS；溶劑：四氯化碳，二硫化碳、重水；氘代溶劑：氯仿、苯、二甲基亞砜的氘代物。,化學位移,在有機化合物中，各種1H核所處的化學環(huán)境不同，周圍的電子云密度也不同，共

31、振頻率有差異，即引起共振吸收峰的位移的現(xiàn)象化學位移的標準物質(zhì)：四甲基硅烷　Si(CH3)4 (TMS)，屏蔽強烈，位移最大，與有機化合物中的質(zhì)子峰不重迭,規(guī)定其位移常數(shù)δTMS= 0,1H NMR譜,峰的數(shù)目：標志分子中磁不等性質(zhì)子的種類；峰的強度(面積積分)比：每類質(zhì)子的相對數(shù)目；峰的位移值(δ)：每類質(zhì)子所處的化學環(huán)境；峰的裂分數(shù)：相鄰碳原子上質(zhì)子數(shù)；偶合常數(shù)(J)：確定化合物構(gòu)型。氫譜僅能確定質(zhì)子，與紅外譜圖聯(lián)合解析