96孔微平板中含有3個重復(fù)的31種碳源biolog分析代謝指紋技術(shù)

1、膜磷脂脂肪酸圖譜分析 (Phospholipid Fatty Acid Profile) 代謝指紋技術(shù) (群落水平生理特征圖譜Biolog)Metabolic fingerprinting techniques - Community level physiological profiles (CLPPs),微生物群落結(jié)構(gòu)分析,膜磷脂脂肪酸分析,微生物特異磷脂脂肪酸,脂肪酸分子通式：X:YωZ（c/t）X：脂肪酸分子的總碳原

2、子數(shù)；Y：烯鍵的數(shù)目；ω：雙鍵的位置（從羧基端起計(jì)）; 后綴c和t分別表示順式和反式同分異構(gòu)體,a (anto): 前異構(gòu)甲基支鏈; cyc: 環(huán)丙基支鏈; i (iso): 異構(gòu)甲基支鏈; Me:甲基支鏈,在生物體中的濃度恒定：不隨種類、生長條件和生理狀態(tài)而變化,應(yīng)用細(xì)胞中特異化學(xué)成分的前提,該物質(zhì)僅存在于活的生物體中，在死亡微生物體或非生物的有機(jī)物質(zhì)中量很小,磷脂脂肪酸僅存在于活細(xì)胞的細(xì)胞膜中，死亡細(xì)胞膜磷脂被迅速分解,容易從

3、細(xì)胞和土壤中提取出來；有測定該物質(zhì)靈敏、準(zhǔn)確的方法,PLFAs可從土壤中直接提取出來，并用氣相色譜測定其總量及種類,特定微生物具有特異性PLFAs，膜磷脂脂肪酸分析反映微生物群體的多樣性，可以用來測定微生物量中真菌和細(xì)菌比例,在生物體中的濃度恒定：不隨種類、生長條件和生理狀態(tài)而變化,微生物PLFAs 組成隨環(huán)境及生理狀態(tài)而有所變化,膜磷脂脂肪酸總量與土壤微生物量(SIR法)的相關(guān)性,(Bååth & Ande

4、rson, 2003),真菌膜磷脂脂肪酸特異性,土壤中麥角甾醇(真菌組成指示物質(zhì))和18:2w6,9 PLFA含量之間的相關(guān)性 (Bååth & Anderson, 2003),,,提取測定土壤脂肪酸基本步驟,土壤樣本脂肪提取 氯仿:甲醇:緩沖溶液 = 1:2:0.8 (體積比),脂肪組分分離 通過硅酸柱將脂肪分為中性脂肪、糖脂和極性的磷脂3個組分,根據(jù)脂肪酸的飽和度、羧基數(shù)目及幾何特性等，區(qū)分不同種類的磷脂

5、脂肪酸,,,,,氣相色譜分析磷脂脂肪酸量,生物多樣性指標(biāo),豐度 生態(tài)系統(tǒng)中物種總數(shù)；Species EvennessDiversity index Shannon 指標(biāo)Simpson 指標(biāo)Berger-Parker指標(biāo)Alpha指標(biāo),膜磷脂脂肪酸分析應(yīng)用實(shí)例 - 土壤微生物中真菌細(xì)菌比例隨土壤pH變化,真菌細(xì)菌生物量系數(shù) 用18:2w6,9 PLFA 和13種細(xì)菌特有的PLFA 分別作為真菌和細(xì)菌的指示物 (B

6、29;åth & Anderson, 2003),定量描述微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性；敏感地反映微生物群落結(jié)構(gòu)變化較為簡單、有效微生物的PLFAs 組成隨環(huán)境及生理狀態(tài)而有所變化 大多數(shù)微生物細(xì)胞膜上占優(yōu)勢的脂肪酸組成很相 似，PLFAs分析不能鑒定微生物種類；是較為粗略的反映微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的參數(shù)，不能指示群落中單個菌種的變化,PLFAs方法評價,膜磷脂脂肪酸分析 （ Phospho

7、lipid Fatty Acids—PLFAs） 代謝指紋技術(shù) (Biolog) Metabolic fingerprinting techniques- Community level physiological profiles (CLPPs）,微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法,根據(jù)微生物利用碳源特性，選擇含有不同碳源物質(zhì)的微平板將土壤懸液接種于GN、GP、Ecoplate 微平板中，微平板中氧化還原染料形成的顏色

8、能指示微生物對不同碳源的利用程度Ecoplate平板：96孔微平板中含有3個重復(fù)的31種碳源,BIOLOG 分析代謝指紋技術(shù)-群落水平生理特征圖,微生物利用不同的碳源物質(zhì)，產(chǎn)生電子傳遞體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)；四氮唑接受電子，轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙募踪?(音同建）；顏色的深淺及形成速度，反映不同類型微生物的數(shù)量及活性,,Biolog 測定原理,BIOLOG－EcoPlateTM,EcoPlate碳源基質(zhì)類型,10 g土壤＋90

9、 ml無菌水,4℃振蕩1 h（200 rpm / min）,取上清液用無菌水做成10-3的土壤稀釋液,吸取150 μl 接種至ECO板的微孔中,在Emax自動讀盤機(jī)上 每24 h 讀取一次590 nm 處光密度值，直至不再變化。,,,,,25 ℃ 下培養(yǎng)72h,BIOLOG 測定步驟,采用孔平均染色程度法(Average Well Color Development, AWCD ) 或曲線積分法(CI)，得出終點(diǎn)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換值，AWC

10、D或CI。AWCD=∑(C-R)/n C：每一個微孔的光密度值R：空白微孔的光密度值n ：碳源底物的數(shù)目(ECO板 n =31)根據(jù)培養(yǎng)時間計(jì)算每一個樣品的總平均AWCD值；應(yīng)用主成分分析(PCA)比較不同的樣本,數(shù)據(jù)分析,箭頭所指的是土壤化學(xué)和物理性狀BD:容重; DP:入滲空隙; EC:電導(dǎo)率; AWC:有效水容量; N:氮; OMC: 有機(jī)質(zhì)含量； SP：飽和率; PW:孔隙水,,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)以及物理

11、化學(xué)性狀受污水灌溉的影響,△ Waste water treated ○ control,主成份分析 土壤加入不同濃度的Hg培養(yǎng)一周后，在 31種單獨(dú)碳源基質(zhì)上最大顯色速率; 主成份1和2分別解釋總變異的 41.1% 和17.4。(Müller et al., 2001. FEMS Microbiology Letters, 204, 49-53),應(yīng)用實(shí)例- 微生物群落對土壤中Hg響應(yīng),主成份1,主成份2,優(yōu)點(diǎn)簡

12、單、快速，適用于大量樣品的測定尤其適合對于根際微生物群落結(jié)構(gòu)的分析局限性 只適用于可培養(yǎng)的微生物 選擇性測定能利用簡單基質(zhì)快速生長的微生物不適于森林土壤 常用的Ecoplate平板中碳源物質(zhì)缺乏纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、幾丁質(zhì)等森林土壤中常見的有機(jī)物質(zhì),Biolog 方法評價,基于16S rDNA 分析方法描述群落結(jié)構(gòu),基于PCR 16S rRNA分析,利用熒光染色顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)每克土壤或水體沉積物可含有1010 個細(xì)菌 而

13、利用瓊脂板分離到的細(xì)菌在森林土壤中僅占0.1-1%，在農(nóng)田土壤中也不過10%；利用分子生物學(xué)技術(shù)可以分析包括不可培養(yǎng)的微生物在內(nèi)的整個土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；,rDNA擴(kuò)增及限制性位點(diǎn)分析(ARDRA),Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis 通過PCR擴(kuò)增、克隆可探測到已知和未知的DNA序列，但每克土中有4000多種微生物，分析每個土壤樣本要測序幾千個序列，非常耗時，利用ARDRA提取

14、土樣中DNA;利用一定的標(biāo)記引物(如熒光)對樣品中的DNA進(jìn)行特異擴(kuò)增；然后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶解,獲得末端限制性片段TRFs；電泳分離片段，檢驗(yàn)TRFs的多樣性；利用主成份分析比較不同樣本的末端限制性片段的特征,多聚酶鏈反應(yīng) - 變性或溫度梯度凝膠電泳技術(shù) (PCR-DGGE/TGGE),Denaturing/Temperature Gradient Gel Electrophoresis 使用1對特異性引物，利用PCR擴(kuò)增微生

15、物自然群體的16S/18S rRNA基因;產(chǎn)生長度相同但序列不同的DNA片段的混合物，然后用DGGE分離；所得環(huán)境樣本的特異性DGGE條帶，經(jīng)切膠，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增特異性DNA片段直接測序或經(jīng)DNA克隆、測序；進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建遺傳相似性圖譜，以揭示微生物多樣性演變的內(nèi)在機(jī)制,CsCl/ethidium bromide 密度梯度平衡離心法分離同位素標(biāo)記的DNAa: 從利用 12C- 或 13C-methanol 作惟一碳源純

16、培養(yǎng)的M. extorquens AM155 提取的DNA；b,c: 分離前后從加入12C- or 13C-methanol作惟一碳源的土壤中提取出的DNA Bar: 1cm (Radajewski et al., 2000 Nature 403, 646-649),穩(wěn)定同位素探針技術(shù),從一系列單個基因組序列分析推斷它們在環(huán)境中相互作用,,,,Kowalchuk, 2005,測定特定環(huán)境基因組序列,,,,,,,,,,,,,,,,,,

17、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,并利用技術(shù)和試驗(yàn)設(shè)計(jì)降低復(fù)雜程度…,生物多樣性指標(biāo),Alpha (a) 多樣性 特定區(qū)域、群落或生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性，一般用物種豐富度表示；Shannon 指數(shù) H= -SPilnPi (i=1 to S) S: 物種數(shù)；Pi=ni/N:第i個物種個體(ni)占全部個體N比例。是communication entropySimpson 指數(shù) D=1-SP

18、i2 (i=1 to S) Pi2= ni(ni-1)/[N(N-1)]; 0≧D ≦1, 接近1說明生物多樣性高，或環(huán)境空間異質(zhì)性大，而近于0說明多樣性小,Beta β-diversity β = (S1 ? c) + (S2 ? c) S1,S2分別是兩個群落的物種數(shù)；c 在兩個群落中都有的物種數(shù)，可用來比較生態(tài)系統(tǒng)或表征環(huán)境梯度的影響； Sørensen‘s similar

19、ity index b=2c/(S1+S2),參考文獻(xiàn),1) Firestone M., Balser T., Herman D.. Defining soil quality in terms of microbial community structure. Annual Reports of Research Projects, UC Berkeley, 1997 2) Garland J L., M

20、ills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community level sole carbon source utilization. Appl. Environment Microbiology, 1991, 57: 2351-2359 3)

21、 Garland J L..Analytical approaches to the characterization of samples of microbial communities patterns of potential C source utilization .soil biology biochemistry,1996,28:213~22 4) Muüller A. K., Rasmussen L.D

22、., SØrensen S. J. Adaptation of the bacterial community to mercury contamination. FEMS Microbiology Letters 2001, 204: 49-53 5) Zelles L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in thechar