植物響應(yīng)重金屬Cd脅迫基因的克隆及功能的初步分析.pdf

1、隨著我國重工業(yè)的快速發(fā)展，重金屬污染日益嚴(yán)重，尤其是土壤重金屬污染，不僅導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)、品質(zhì)下降，并可通過食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而毒害人體健康。植物沒有有效的選擇性吸收這些重金屬離子的能力，會(huì)在農(nóng)作物可食部分累積。如果通過基因工程技術(shù)改變植物選擇性吸收重金屬離子的能力，并阻斷在可食部分積累重金屬，就有可能從源頭上解決農(nóng)作物重金屬污染問題。但是，目前重金屬離子進(jìn)入植物細(xì)胞的通路、哪些基因參與響應(yīng)重金屬脅迫及這些基因在植物響應(yīng)重金屬脅迫中的功能

2、尚不清楚。
　　為了分離鑒定植物細(xì)胞中響應(yīng)重金屬脅迫基因，本實(shí)驗(yàn)室通過甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（MSAP）研究重金屬脅迫對(duì)植物基因組DNA甲基化水平的影響，克隆了255條差異片段，最終確定7條候選基因進(jìn)一步研究。本論文通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、亞硫酸鹽測(cè)序（BSP）和病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)，分析這些基因在植物響應(yīng)重金屬脅迫中的作用，得到以下結(jié)果：
　?。?）通過MSAP技術(shù)在本生煙草中得到255條

3、Cd脅迫相關(guān)DNA差異條帶，以此為模板構(gòu)建克隆載體，測(cè)序分析后篩選出NbMORC3等7個(gè)與Cd脅迫相關(guān)的基因。
　　（2）通過geNorm和NormFinder程序?qū)CT、TUB、18SrRNA、PP2A、GAPDH和 EF1a6個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，最終選擇 EF1a作為不同濃度 Cd脅迫下qRT-PCR的最優(yōu)內(nèi)參基因。
　?。?）通過qRT-PCR技術(shù)，研究候選基因NbMORC3等在不同濃度Cd脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果

4、顯示：隨著 Cd濃度的上升，NbRL表達(dá)量先下調(diào)再上調(diào)，而NbMORC3表達(dá)量則相反；NbHGSNAT、NbMUT、NbBG、NbG1r和NbSAMD表達(dá)量均上調(diào)，除NbG1r在500 mg·L-1 Cd2+脅迫時(shí)表達(dá)量最高，其余均在250 mg·L-1 Cd2+脅迫時(shí)表達(dá)量最高。說明重金屬Cd脅迫影響候選基因的表達(dá)水平。
　?。?）通過亞硫酸鹽測(cè)序（BSP）技術(shù)，研究候選基因在重金屬脅迫甲基化變化情況，結(jié)果顯示：在250、500

5、 mg·L-1 Cd2+脅迫下，候選基因NbRL（280 bp）和NbG1r（330 bp）只有1處堿基位點(diǎn)發(fā)生變化為C-C-T-T（0/0-SO3/250Cd-SO3/500Cd-SO3）其余位點(diǎn)未發(fā)生變化，說明重金屬Cd脅迫后誘導(dǎo)基因組DNA發(fā)生去甲基化，甲基化水平下降。其它候選基因的甲基化變化情況正在繼續(xù)研究。
　?。?）通過VIGS技術(shù)將候選基因的工程菌注射本生煙草，對(duì)沉默后2周植株進(jìn)行半定量RT-PCR分析，結(jié)果表明：候