植物響應重金屬Cd脅迫基因的克隆及功能的初步分析.pdf

1、隨著我國重工業(yè)的快速發(fā)展，重金屬污染日益嚴重，尤其是土壤重金屬污染，不僅導致農(nóng)作物減產(chǎn)、品質(zhì)下降，并可通過食物鏈進入人體，進而毒害人體健康。植物沒有有效的選擇性吸收這些重金屬離子的能力，會在農(nóng)作物可食部分累積。如果通過基因工程技術改變植物選擇性吸收重金屬離子的能力，并阻斷在可食部分積累重金屬，就有可能從源頭上解決農(nóng)作物重金屬污染問題。但是，目前重金屬離子進入植物細胞的通路、哪些基因參與響應重金屬脅迫及這些基因在植物響應重金屬脅迫中的功能

2、尚不清楚。
　　為了分離鑒定植物細胞中響應重金屬脅迫基因，本實驗室通過甲基化敏感擴增多態(tài)性技術（MSAP）研究重金屬脅迫對植物基因組DNA甲基化水平的影響，克隆了255條差異片段，最終確定7條候選基因進一步研究。本論文通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、亞硫酸鹽測序（BSP）和病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術，分析這些基因在植物響應重金屬脅迫中的作用，得到以下結(jié)果：
　?。?）通過MSAP技術在本生煙草中得到255條

3、Cd脅迫相關DNA差異條帶，以此為模板構建克隆載體，測序分析后篩選出NbMORC3等7個與Cd脅迫相關的基因。
　?。?）通過geNorm和NormFinder程序?qū)CT、TUB、18SrRNA、PP2A、GAPDH和 EF1a6個候選內(nèi)參基因進行篩選，最終選擇 EF1a作為不同濃度 Cd脅迫下qRT-PCR的最優(yōu)內(nèi)參基因。
　?。?）通過qRT-PCR技術，研究候選基因NbMORC3等在不同濃度Cd脅迫下的表達情況，結(jié)果

4、顯示：隨著 Cd濃度的上升，NbRL表達量先下調(diào)再上調(diào)，而NbMORC3表達量則相反；NbHGSNAT、NbMUT、NbBG、NbG1r和NbSAMD表達量均上調(diào)，除NbG1r在500 mg·L-1 Cd2+脅迫時表達量最高，其余均在250 mg·L-1 Cd2+脅迫時表達量最高。說明重金屬Cd脅迫影響候選基因的表達水平。
　?。?）通過亞硫酸鹽測序（BSP）技術，研究候選基因在重金屬脅迫甲基化變化情況，結(jié)果顯示：在250、500

5、 mg·L-1 Cd2+脅迫下，候選基因NbRL（280 bp）和NbG1r（330 bp）只有1處堿基位點發(fā)生變化為C-C-T-T（0/0-SO3/250Cd-SO3/500Cd-SO3）其余位點未發(fā)生變化，說明重金屬Cd脅迫后誘導基因組DNA發(fā)生去甲基化，甲基化水平下降。其它候選基因的甲基化變化情況正在繼續(xù)研究。
　　（5）通過VIGS技術將候選基因的工程菌注射本生煙草，對沉默后2周植株進行半定量RT-PCR分析，結(jié)果表明：候