大蒜重金屬抗性基因的克隆及其功能分析.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothionein，MT)和植物絡合素(phytochelatin，PC)是植物中能夠與金屬離子結合的兩大類多肽。研究重金屬脅迫下這兩類基因的表達對了解植物的重金屬抗性的分子機制具有重要意義，同時還可以為培育能用于植物修復的品種提供新思路。
　　 本論文從大蒜中克隆了一個type2 MT基因，命名為AsMT2a，將其在大蒜中的表達模式與大蒜的植物絡合素合酶基因(AsPCS1)進行了比較，并對二者的過表達轉

2、基因擬南芥的重金屬抗性進行研究。其主要結果如下：
　　 1.AsMT2a基因全長525 bp，編碼79個氨基酸，其中有14個Cys殘基。推測的氨基酸序列分析表明其Cys的位置和數(shù)目與來自其它植物的type2 MT蛋白的完全一致。v2.RT-PCR的結果顯示，大蒜根部AsPCS1的表達在Cd處理的短期(1 hr)內(nèi)迅速增強，同時PCs含量也大幅度增加。但AsMT2a的表達在Cd處理10 hr后才有明顯的增加。說明AsPCS1可能在

3、植物對重金屬的快速響應方面起主要作用，而AsMT2a則在植物對重金屬長久耐性方面起更大作用。暗示在大蒜暴露于Cd脅迫的不同時期AsPCS1和AsMT2a基因可以互相協(xié)調(diào)而對重金屬脅迫作出反應。v3.將AsPCS1和AsMT2a轉入對砷和鎘敏感的酵母菌株FD236-6A中，對轉化子的重金屬抗性實驗表明這兩個基因均可提高轉化子對砷和鎘的抗性。
　　 4.在Cd脅迫下，AsPCS1的超表達擬南芥的生長好于野生型植株，主要表現(xiàn)在轉基因擬

4、南芥的根較長，根數(shù)目較多；但在As脅迫下AsPCS1轉基因植株與野生型植株沒有明顯的差別。與此不同的是將AsMT2a轉入擬南芥后，轉基因植株的As抗性明顯增強
　　 5.Cd脅迫下，所有的轉基因植株對Cd的積累量均明顯增加，其中AsPCS1過表達植株Cd含量增加最多，平均比野生型對照增加4倍。而AsMT2a過表達植株的Cd積累量的增加幅度較小，約比野生型對照增加1.4倍。雙價基因AsMT2a+AsPCS1過表達植株的Cd積累量也

5、增加，是野生型的5.8倍，是AsMT2a過表達植株的2.4倍，是AsPCS1過表達植株的1.2倍。
　　 在克隆AsMT2a的同時，我們還從大蒜中克隆到了一個金屬硫蛋白基因家族的新成員，命名為AsMT2b，并對其功能進行了初步探討。主要結果如下：
　　 1.AsMT2b全長520 bp，編碼80個氨基酸，其中含有15個Cys殘基。對推測的氨基酸序列分析表明AsMT2b的N端和C端domain內(nèi)，Cys的數(shù)目和排列方式與其

6、它type2 MT蛋白明顯不同。暗示AsMT2b可能具有與其它MT不同的生物學功能。
　　 2.在較低濃度Cd(200μM)脅迫下，AsMT2b的表達量隨著處理時間(24hr內(nèi))的延長而降低，但隨著處理濃度的升高(500μM)和處理時間延長(48hr)，其表達量又逐步增強，說明AsMT2b可能在脅迫強度增加到一定程度時才起作用。
　　 3.將AsMT2b轉入對Cd和As敏感的酵母菌株FD236-6A中，發(fā)現(xiàn)AsMT2b對

7、酵母As抗性的提高貢獻不大，但可明顯提高酵母對Cd的抗性。
　　 4.對AsMT2b的超表達擬南芥的重金屬抗性分析表明，與野生型植株比較，轉基因植株具有較強的Cd抗性，但在As脅迫下，轉基因植株的生長和野生型沒有明顯差異?？梢钥闯觯DAsMT2b的擬南芥對重金屬的抗性不同于轉AsMT2a的植株，前者的抗Cd性較強，而后者的抗As性較強。另外，Cd脅迫下，AsMT2b過表達擬南芥的Cd含量明顯增加。
　　 另外，我們還對C

8、dCl2脅迫下，大蒜幼苗中鎘的積累及氧化脅迫和抗氧化能力的變化進行了研究。結果表明在CdCl2脅迫下，大多數(shù)Cd在根部積累，而只有少量的Cd積累于葉片中。同時膜脂過氧化產(chǎn)物積累，抗氧化酶活性發(fā)生變化。這些結果說明鎘脅迫下，植物細胞中氧化脅迫加劇，而抗氧化酶活性的增強是植物對次生氧化脅迫的一種適應策略。
　　 綜上所述，在重金屬脅迫下，AsPCS1和AsMT2a之間及AsMT2a和AsMT2b之間均表現(xiàn)出明顯的協(xié)調(diào)反應。這種協(xié)調(diào)反