免疫藥實驗方法-藥理實驗方法學-研究生

1、1,影響免疫功能藥物藥理研究方法中藥藥理教研室 洪敏唐仲英科技樓406 Tel：15805191595Email:hongmin72@126.com,2,第一節(jié) 概述一、免疫學研究概況 免疫學的3個時期： 經(jīng)驗免疫期 科學免疫期 現(xiàn)代免疫期,3,●經(jīng)驗免疫學時期 中國明代，正式記載接種“人痘”

2、，預防天花 18世紀中葉，英國醫(yī)生Edward Jenner 種牛痘預防天花 目前，通過全球性大面積疫苗接種我們已經(jīng)消滅了天花病毒,4,5,● 科學免疫學時期,病原菌的發(fā)現(xiàn)與疫苗使用的推廣 19世紀中葉，顯微鏡的改進使人們可在鏡下直接觀察到細菌，導致病原菌的發(fā)現(xiàn)。 1850年，首先在感染羊的血液中看到了炭疽桿菌。 Pasteur證明實驗室培

3、養(yǎng)的炭疽桿菌能使動物感染致病，并且發(fā)明了液體培養(yǎng)基，以培養(yǎng)細菌。 Koch發(fā)明固體培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)結核桿菌成功，提出病原菌致病的概念。,Emil von Behring 1854 - 1917, Nobel Prize in 1901 for demonstrating that circulating antitoxins against diphtheria（白喉）and tetanus（破傷風）toxins

4、 conferred immunity.,Louis Pasteur 1822-1895, Father of immunology, attenuated bacteria and viruses as vaccine against anthrax（炭疽）…..,Edward Jenner 1749-1822Successful vaccination against smallpox（天花）,Robert Koch 1843-1

5、910, Nobel Prize in 1905 for his work on tuberculosis（肺結核）, Anthrax（炭疽）, Cholera（霍亂）, Tubercule bacillus（結核桿菌）,8,科學免疫學時期的重要成就,減毒疫苗的發(fā)明 抗毒素的發(fā)現(xiàn) 補體的發(fā)現(xiàn) 血清學方法的建立 免疫化學的研究,●現(xiàn)代免疫學時期,免疫應答細胞和T細胞亞類的發(fā)現(xiàn) 免疫網(wǎng)絡學說的提出 抗體生成克隆選擇學說

6、的提出 細胞因子研究進展 免疫學技術的發(fā)展（免疫標記技術） 免疫耐受現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),,Clonal Selection Theory（ Burnet學說, 1960年諾貝爾獎）體內(nèi)存有能識別各種抗原的細胞克隆(clone)，每一細胞表面均有對特定抗原的受體，能與相應抗原結合而識別它們?？乖淖饔迷谟谶x擇與其相應的細胞克隆與其受體結合后，引起細胞的增殖分化，產(chǎn)生免疫應答。 胎生期免疫細胞與自己抗原相接觸形成天然自身耐受狀態(tài)（禁忌

7、細胞系） 免疫細胞系可突變產(chǎn)生與自己抗原發(fā)生反應的細胞系可形成自身免疫反應 此學說對免疫學中的根本問題——自我識別有了比較滿意的解釋，對免疫學中的其他重要問題，諸如免疫記憶、免疫耐受性、自身免疫性等現(xiàn)象也能作出恰當?shù)恼f明，因此被人們廣為接受，成為現(xiàn)代免疫學的理論基礎。,11,,12,● 研究進展,1.抗原識別受體多樣性的產(chǎn)生2.信號轉(zhuǎn)導途徑的發(fā)現(xiàn)3.細胞程序性死亡途徑的發(fā)現(xiàn)4.造血與免疫細胞的發(fā)育5.應用免疫學的發(fā)展

8、 (1)DNA疫苗 (2)基因工程制備重組細胞因子 (3)免疫細胞治療 (4)完全人源抗體 (5)口服自身抗原,預防自身免疫病,13,二、免疫功能的病理生理及免疫功能的調(diào)節(jié) ● 免疫應答：是機體借助理化屏障及神經(jīng)體液調(diào)節(jié)控制，通過免疫細胞及有關的體液因子（抗體or淋巴因子等）發(fā)揮識別自己、排除異己，以維持機體內(nèi)外環(huán)境統(tǒng)一的一種功能。 ● 非特異性免疫應答：是機體防御異物進入機體以及對進入體內(nèi)

9、異物的清除作用，是機體與生俱來的免疫功能。 ● 特異性免疫應答：是機體發(fā)育過程中接觸抗原后發(fā)展而成的免疫力，包括體液免疫和細胞免疫。,14,免疫應答的3個階段： （1）感應期 抗原進入機體后，多數(shù)由單核－巨噬細胞攝取與加工，再將抗原信息傳遞給T、B淋巴細胞，使之能特異性地識別抗原。 （2）增殖分化期 抗原激活――淋巴細胞――T、B淋巴細胞――致敏淋巴細胞、漿細胞。 （3）效應期 再次遇到抗原

10、――致敏淋巴細胞、抗體――細胞免疫、體液免疫。,15,16,18,19,免疫病理與免疫性疾病,按發(fā)病機制不同,免疫性疾病分為： 超敏反應性疾病 免疫缺陷病：先天性及繼發(fā)型免疫缺陷病 自身免疫?。侯愶L濕性關節(jié)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡,干燥 綜合征,多發(fā)性硬化 移植排斥和移植物抗宿主反應,,,速發(fā)型：由抗體

11、介導， 發(fā)作快 如：哮喘、蕁麻疹等 遲發(fā)型：由細胞免疫介導，發(fā)作慢 見于結核病、接觸性皮炎,,20,目前臨床所用的影響免疫功能的藥物有： ● 免疫增強藥：胸腺素、卡介苗、干擾素（免疫調(diào)節(jié)）、左旋咪唑等。 ● 免疫抑制藥：環(huán)孢素A、他克莫司、糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、抗淋巴細胞球蛋白。 ● 中藥類： 雙向免疫調(diào)節(jié)，如：人參、黃

12、芪、靈芝、豬苓、枸杞、銀耳、鹿茸、云芝等植物多糖。 免疫抑制，如：川烏總堿、氧化苦參堿、雷公藤多苷、生物堿等。,21,中國醫(yī)院用藥評價與分析,2009;9(10):726-729,22,三、研究的基本要求（一）動物的選擇 由于免疫反應和基因類型有關，盡可能用純系動物。如純系小鼠和大鼠，并控制鼠齡、性別和體重，以減少個體差異。若用雜種動物，最好用同窩動物。,23,（二） 動物模型 1、模型特點和要求

13、 （1）正常實驗動物 （2）免疫功能低下的動物模型（腫瘤、衰老、慢性病均可造成免疫功能低下） ① 免疫抑制劑造模（如環(huán)磷酰胺、氫化可的松、環(huán)孢霉素A） ② 輻射引起免疫功能低下動物模型,24,常用的免疫抑制劑 1. 環(huán)磷酰胺：80～100mg/kg，Sc，5天后免疫功能顯著降低。 2. 氫化可的松：50～100mg/kg，Sc，6～8天后免疫功能顯著降低。

14、 3. 抗淋巴細胞血清（ALS）:ip 0.2ml，5～6天后免疫功能顯著降低。 4. 60Co或X射線600～800拉德照射1次，4日后免疫功能顯著降低，動物存活時間顯著縮短。,25,（3）免疫缺陷動物 Nude小鼠：該小鼠先天性無胸腺，細胞免疫力低下，失去正常T細胞功能。但其B淋巴細胞功能基本正常。BALB/c–nu、NC-nu、C3H-nu、Swiss-nu  

15、 Scid小鼠：即重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠。Scid 小鼠外觀與普通小鼠差別不大，有毛，被毛白色，體重發(fā)育正常。但胸腺、脾、淋巴結的重量不及正常的30%，組織學上表現(xiàn)為淋巴細胞顯著缺陷。 BALB/c-Scid,26,（4）自身免疫性疾病模型： 類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥 （5）過敏性疾病模型： 哮喘，過敏性鼻炎，接觸性皮炎等,,27,佐劑性關節(jié)炎模型是免疫性關節(jié)炎動物模型

16、的基本方法。造模多采用大鼠, 足跖部皮下注射法, 原發(fā)病變主要表現(xiàn)為致炎局部的炎癥反應, 續(xù)發(fā)病變一般于致炎后10-20天左右出現(xiàn), 20天左右達到高峰, 病理改變?yōu)榛は陆M織炎癥, 滑膜增生, 血管翳形成, 軟骨破壞, 4周后, 關節(jié)紅腫減退, 骨質(zhì)減少, 新骨形成, 關節(jié)間隙變窄, 形成不可逆的關節(jié)改變。AA大鼠的關節(jié)組織病理學及血中變化與人相似, 同時, 對其免疫學機制研究發(fā)現(xiàn), 此模型存在明顯的細胞免疫異常。,28,II 型

17、膠原誘導的關節(jié)炎模型II 型膠原+完全弗氏佐劑, 乳化制成乳劑, 將該乳劑于小鼠的尾根部皮內(nèi)注射致炎, 腹腔注射乳劑作為激發(fā)注射。表現(xiàn)為多發(fā)性外周關節(jié)炎, 關節(jié)局部紅腫, 嚴重致關節(jié)畸形, 病理變化為增生性滑膜炎, 關節(jié)軟骨破壞, 骨侵蝕, 關節(jié)腔內(nèi)有炎性細胞浸潤, 體內(nèi)可檢出針對自身型膠原的高滴度的IgG抗體, 這些臨床表現(xiàn)及實驗室指標與人密切相關。不出現(xiàn)病情的波動和復發(fā)情況, 也沒有的皮下結節(jié), 漿膜炎, 血管炎等表現(xiàn),不出現(xiàn)

18、類風濕因子及抗核抗體,29,卵蛋白誘導的關節(jié)炎模型卵蛋白+福氏佐劑混勻, 注入動物背部皮下, 致敏, 末次注射后一周于關節(jié)內(nèi)注入溶解的卵蛋白, 24小時內(nèi)此關節(jié)出現(xiàn)紅腫熱痛等急性炎癥的表現(xiàn), 發(fā)病率達100%。卵蛋白誘導的關節(jié)炎模型的病理改變有滑膜增生、血管翳形成和軟骨及骨破壞。第一階段為關節(jié)內(nèi)注入抗原后, 24小時出現(xiàn)關節(jié)腫脹, 關節(jié)直徑增加, 病理表現(xiàn)為急性滑膜炎。第二階段為1-4周, 關節(jié)滑膜明顯增生, 血管翳形成?；ぜ?/p>

19、胞以單核細胞、巨噬細胞為主,其次為淋巴細胞, 以CD4+淋巴細胞多見, 這一階段部分動物可出現(xiàn)早期軟骨破壞。第三階段在4周后, 不可逆的關節(jié)軟骨及骨破壞出現(xiàn),最后可出現(xiàn)骨變形。最長的觀察到6個月, 慢性炎癥仍存在, 證明卵蛋白誘導的關節(jié)炎模型與在發(fā)病機理上的某些類似。,,30,2、觀察指標 （1）非特異性免疫功能的測定指標 （2）體液免疫功能的測定指標 （3）細胞免疫功能的測定指標3、給藥途徑和劑量4、對照實驗,31,,（1

20、）組間對照,標準品對照組弱陽性對照組,（2）自身對照（3）配對對照,對照組,陰性對照組,空白對照組,假處理對照組,陽性對照組,,,,,32,第二節(jié) 實驗方法一、影響非特異性免疫功能實驗（一）碳粒廓清法【基本原理】 網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）是機體最主要的防御系統(tǒng)，具有強大而迅速的吞噬廓清異體顆粒或某些可溶性異物的能力，并能迅速清除體內(nèi)自身產(chǎn)生的某些有害物質(zhì)。 當靜脈注入特定大小的惰性顆粒后，它即可被RES細胞

21、迅速吞噬而從血流中廓清，因此，可借助測定血流中炭粒的消失速度來反映RES吞噬異物的能力。,33,【實驗步驟】（1）取小鼠，隨機分組，給藥。（2）末次給藥后30min，每鼠iv印度墨汁0.05～0.1ml/10g體重。（3）于1min（t1）和5min（t5）后，每鼠眼眶靜脈取血20ml，加到2ml 0.1%NaCO3溶液中搖勻。（4）測OD680nm，計算廓清指數(shù)（K）、吞噬指數(shù)。,34,廓清指數(shù)K＝

22、 ＝ 吞噬指數(shù)α＝ × 即校正廓清指數(shù),,,,,35,【注意事項】 （1）印度墨汁應用NS稀釋1～5倍左右，最好經(jīng)超聲處理后離心，棄去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺毛細血管，引起動物猝死。 印度墨汁的質(zhì)量可影響測定結果的準確性，墨汁顆粒大小有嚴格要求，過大則不被吞噬，

23、過小則被其他吞噬細胞吞噬，如小吞噬細胞。印度墨汁因顆粒大小均勻，能特異性地被單核巨噬細胞所吞噬，因而適用于本實驗。 （2）iv要熟練，印度墨汁的劑量、取血時間必須準確無誤。另外，取血的時間間隔也可延長至10分鐘。,36,【評價】 印度墨汁法測定RES吞噬活性是最經(jīng)典的一種免疫學研究方法，實驗條件要求不高，方法簡便，結果可靠，重現(xiàn)性好。 若再配合小鼠腹腔巨噬細胞吞噬消化雞紅血球?qū)嶒灱鞍准毎巫邔嶒?，則可較全面地反

24、映單核巨噬細胞系統(tǒng)清除異物功能狀態(tài)。,37,（二）小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞法【基本原理】 Mφ具有強大的吞噬能力，雞紅細胞對鼠類是一種較強的抗原性異物，當其被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔Mφ聚集并吞噬，注入定量雞紅細胞（CRBC），隔一定時間后，吸取腹腔Mφ，鏡檢其吞噬活性，并以吞噬百分率及吞噬指數(shù)的高低表示Mφ吞噬能力的大小。,38,【實驗步驟】 （1）取18～22g小鼠，雌雄各半，隨機分組。 （2）若篩選免疫抑

25、制藥，預先用Mφ誘導劑，可在實驗前3～4天，ip0.5％淀粉生理鹽水溶液，每鼠0.5ml。 （3）4天后，ip，5％ CRBC 0.5ml。8～12h后脫頸椎處死小鼠，ip2ml NS，輕揉腹部1min，然后吸出洗液1ml，分滴于兩片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃孵箱溫育30min。 （4）用NS漂洗，除去未粘片的細胞。晾干，1∶1丙酮－甲醇溶液固定5min。4％（V/V）Giemsa－磷酸緩沖液染色3min，用

26、流水沖洗、晾干，鏡檢。,39,【結果判定】 油鏡下計每片200個Mφ，計算吞噬百分率、吞噬指數(shù)。吞噬百分率＝ ×100％ 吞噬指數(shù)＝ ÷2,,40,CRBC被消化的程度，通常分4級： Ⅰ級：未消化。CRBC完整，胞質(zhì)淺紅或淺黃帶綠色，胞核呈淺紫紅色。 Ⅱ級

27、：輕度消化。胞質(zhì)淺黃綠色，胞核固縮呈紫藍色。 Ⅲ級：重度消化。胞質(zhì)淡染，胞核呈淺灰黃色。 Ⅳ級：完全消化。Mφ內(nèi)僅見形態(tài)類似CRBC大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見。,41,【注意事項】 （1）實驗各步驟均需保持無菌操作。Mφ誘導劑僅用于免疫抑制藥研究。 （2）若滴片染色過深，可用1%HCl脫色，過淺則可復染。 （3）每鼠兩片的計數(shù)應基本一致，若差距過大，應予淘汰。腹腔吸出的液體若有血性滲出時，則不宜使用。,42

28、,（4）掌握好實驗時間，時間太短，吞噬雞紅細胞較少，過長則雞紅細胞已被消化。 （5）避免腹腔注射受試藥物，以免干擾實驗結果。【評價】 本法簡便，但操作慢而欠精確，可配合其他方法進行綜合分析。,43,（三）巨噬細胞吞噬作用的化學發(fā)光測定法【基本原理】 化學反應中電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，在其回到基態(tài)過程中，以光的形式釋放能量or將能量轉(zhuǎn)移到另一分子而發(fā)射光子，利用發(fā)光檢測儀測定發(fā)射光的強度or速度，即可計算發(fā)光物質(zhì)or

29、發(fā)光物質(zhì)標記的抗原or抗體的含量。測定發(fā)光強度的方法，即光子計數(shù)法，可用液體閃爍儀進行測定。,44,Mφ吞噬顆粒or受其他生物與化學因子刺激后，細胞代謝猛增，其特征是耗氧量增加，產(chǎn)生大量自由基（氧負離子、過氧化氫、羥自由基、單線態(tài)氧），同時，往往伴有化學發(fā)光現(xiàn)象，但十分微弱，難以檢測。若在體系中加入魯米諾等發(fā)光增強劑，就能增強發(fā)光強度，因為氧化劑激發(fā)魯米諾，可發(fā)出425nm的光，易被檢測到。,45,【操作步驟】 （1）用HBSS將Mφ

30、調(diào)整至2×106個/ml的細胞懸液備用。 （2）取細胞懸液1ml，置聚乙烯小管中，加入10-4M魯米諾200ml，將小管放入液閃測量瓶中，測定發(fā)光6秒鐘，作為本底。 （3）加入調(diào)理的酵母多糖200ml，搖勻，即刻測發(fā)光6秒鐘，以后每隔3～5min測一次發(fā)光，直至加酵母多糖1h。 （4）以發(fā)光強度（cpm）為縱坐標，加酵母多糖后的時間為橫坐標，繪制Mφ吞噬發(fā)光的動力曲線。比較各組的峰高、峰時（峰高的時間）、發(fā)光積分值及早期

31、曲線斜率的變化。,46,【注意事項】 （1）注意無菌操作。所用試管、滴管、緩沖液等均需高壓滅菌，應在超凈臺內(nèi)操作，避免污染。 （2）用臺盼藍染色，Mφ活力應在90％以上。 （3）所用藥物應能完全溶解，懸浮的微粒將會影響Mφ的反應性。 （4）小試管與測量瓶先置暗室24h，整個操作系統(tǒng)均在暗室進行。,47,【方法評價】 （1）本法也可檢測Mφ氧代謝功能與血清調(diào)理作用，故作為檢測吞噬功能的指標的專一性不夠。 （2）因液

32、閃儀無溫控裝置，不能使反應系統(tǒng)達到37℃，只能通過恒定的室溫（25±1℃）與水浴37℃進行間接控制。,48,（四）溶菌酶測定法【基本原理】 溶菌酶是一種小分子蛋白質(zhì)，存在于機體的淚液、痰、鼻涕、WBC、血清等。測定它在體液or分泌物中的含量及其變動情況，可作為側面了解機體防御功能的一個指標。 體液和分泌物中的溶菌酶活性，可通過檢查其對指定敏感菌株的裂解作用來進行測定。,49,2種測定法：（1）光學測定法

33、：將檢品與菌液混合，用分光光度計觀察指定時間內(nèi)透光度改變的百分數(shù)。（2）平板打孔測定法：在混有菌液的瓊脂凝膠上打孔，檢品放在孔內(nèi)，一定時間后測定溶菌環(huán)直徑。,50,二、影響特異性體液免疫功能的實驗方法（一）血清溶血素測定法【基本原理】 經(jīng)SRBC免疫動物的淋巴細胞可產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素），并釋放至外周血。這種抗體在試管內(nèi)與SRBC溫育，在補體（正常血清中的一組酶蛋白，具有溶解和殺傷細胞，增強吞噬等作用）參與下可產(chǎn)生

34、溶血反應，通過測定血紅蛋白的釋放量多少來間接測出血清中溶血素的含量。 血紅蛋白與都氏試劑反應形成氰化血紅蛋白后比色測定。,51,【操作步驟】 （1）免疫：小鼠，ip 20％SRBC 0.2ml/天，第4天取血、分離血清，將血清稀釋后供測定（一般500倍以上）。 （2）溶血反應：在試管內(nèi)依次加入血清1ml、5％SRBC 0.5ml、10％補體1ml，置37℃水浴30min，然后移至冰浴中終止反應，1500rpm離心5min

35、，取上清1ml，加都氏液3ml，搖勻放置10min，測OD540nm。,52,（3）SRBC半數(shù)溶血值：取5％SRBC 0.25ml加都氏液4ml，測OD540nm。 （4）計算：樣品管半數(shù)溶血值HC50： 每只鼠的血清 HC50＝ ×稀釋倍數(shù),,53,【

36、評價】 （1）簡單易行，快速，重復性好。測定HC50較準確，客觀，可克服溶血空斑法用肉眼計數(shù)的錯誤。 （2）本實驗用615純種小鼠測出的數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。,54,（二）抗體形成細胞測定法（PFC）1 溶血空斑試驗（haemolytic plaque assay，HPA）【基本原理】 PFC是一種體外檢測單個抗體形成細胞（漿細胞）的方法。將SRBC免疫的小鼠脾細胞、SRBC、補體混合于瓊脂內(nèi)，抗體形成細胞分泌的抗

37、體在補體的參與下，使其周圍的SRBC的溶解形成肉眼可見的溶血空斑，這種溶血空斑大體上可以反映抗體形成細胞數(shù)。 方法：瓊脂固相法（平皿法）：常用。 液相單層細胞法（玻片法）：很少使用。,56,直接溶血空斑試驗:測定產(chǎn)生 IgM 型抗體的細胞。因為活化補體的能力強，只加細胞和補體即可出現(xiàn)空斑，故稱直接溶血空斑測定。間接溶血空斑試驗: 產(chǎn)生其他類型抗體的（如 IgG 或 IgA 等）細胞檢測，需要加靶細

38、胞和抗各類 Ig 的抗血清,再加補體才能出現(xiàn)可見的空斑，故稱間接溶血空斑測定。,57,【操作步驟】（1）瓊脂固相法――直接法 1）免疫動物：選用純系小鼠，隨機分組，每鼠腹腔注射5％的SRBC 0.2ml致敏。 2）制備補體，同前。 3）制備底層瓊脂：稱取1.4g瓊脂糖加入100mlGey’s液中，煮沸，溶化后分裝若干只預溫的試管，每管5ml，置45℃恒溫水浴保溫。然后傾入水平放置的平皿（直徑9cm）中，凝固后打

39、開平皿蓋，將平皿反扣放入37℃溫箱1h，備用。,58,4）制備脾細胞懸液：免疫后第4天，用冷Gey’s制備107/ml脾細胞懸液，置4℃冰箱備用。5）上層瓊脂的制備：稱取0.7瓊脂糖加入100mlGey’s液中煮沸，溶化后分裝若干只預溫的試管，每管1.5ml，置45℃恒溫水浴保溫。逐個取出，依次加入SRBC懸液（2×109/ml）0.1ml、107/ml脾細胞懸液0.1ml，充分混勻，立即傾入上述制備好的底層瓊脂平皿中，均勻

40、鋪平，凝固后靜止10min。,59,6）將平皿置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，每皿中加入1∶10稀釋的豚鼠血清1.0ml，均勻覆蓋于表面，繼續(xù)溫育40～50min，取出后置室溫1h，4℃冰箱過夜，次日傾去補體，or加入0.25%的戊二醛（NS配置），使細胞固定后計數(shù)空斑。,60,7）空斑計數(shù)與評定：用放大鏡or雙目解剖鏡可見每個空斑由抗體分泌細胞及其周圍的透明區(qū)域組成。計數(shù)每個平皿（106個細胞）的空斑數(shù)。（2）瓊脂固相法――間接

41、法：在上述5）中再加入適當濃度的抗-Ig血清0.1ml，其他步驟相同。,61,【注意事項】（1）SRBC既是免疫細胞，又是靶細胞和指示細胞，故SRBC要新鮮，洗滌不得超過3次，每次離心5min。用Alsever’s液保存的SRBC可使用2周。 （2）為了消除非特異性溶血，豚鼠血清在使用前必須經(jīng)SRBC吸收，補體的濃度以1∶10稀釋為宜。,62,（3）制備脾細胞懸液：若將取出的脾立即放入0℃冰浴，可明顯降低空斑計數(shù)；在20℃以下操作，

42、不超過15min，對空斑計數(shù)并無影響。 （4）測定抗血清的顯斑常數(shù)（KD）和抑斑常數(shù)（KI），作為空斑計數(shù)的校正。,63,（5）傾注底層瓊脂糖時，一定要將平皿放置水平位置，以便使底層瓊脂糖水平光滑。傾上層瓊脂糖時，各種細胞成分要充分混勻。不能劇烈震蕩，以免出現(xiàn)氣泡。水浴溫度應控制在47～49℃之間，溫度過高使細胞變性；過低使瓊脂糖凝固，影響細胞分散。,64,2 分光光度法【基本原理】 又稱SRBC的定量溶血測定法，基本原理

43、同溶血空斑法。但本法可定量測定抗體形成細胞所分泌的抗體，較溶血空斑法精確。同時操作比較簡便。,65,【操作步驟】 （1）免疫動物：同前。 （2）制備脾細胞懸液：基本同前，制成5×106/ml脾細胞懸液，或按15mg脾重/ml制成脾細胞懸液。 （3）溶血反應：取試管若干只，每管依次加入脾細胞懸液、0.2％SRBC、1∶10豚鼠血清各0.5ml，充分混勻，另設不加補體的空白組。置37℃水浴中溫育1h，離心3000rpm，5m

44、in。 （4）測OD值：取上清測OD413nm。,66,【注意事項】 （1）若使用雜種鼠時，宜將每兩只小鼠的脾混合液制備脾細胞懸液，可減少實驗誤差。 （2）反應系統(tǒng)中其他條件不變時，SRBC濃度可根據(jù)受試藥的免疫增強or抑制作用作適當調(diào)整。,67,三、影響特異性細胞免疫功能的實驗方法（一）淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（3H-TdR摻入法）【基本原理】 淋巴細胞在有絲分裂原的刺激下，轉(zhuǎn)化為母細胞，并分化增殖，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸

45、合成增加，并釋放多種淋巴因子。如在培養(yǎng)液中加入3H-TdR，使其摻入到新合成的DNA中，可以定量細胞內(nèi)的DNA合成強度。,68,有絲分裂原： PHA（植物血凝素） ――刺激T細胞 Con-A（刀豆球蛋白） ――刺激T細胞 LPS（脂多糖） ――刺激B細胞,69,【操作步驟】 （1）純系小鼠，2～3月齡，雌雄均可。處死小鼠，在無菌條件下迅速取出脾臟，放入盛有RPMI1640培養(yǎng)

46、液的平皿中（冰?。羲?，用注射器針芯搗爛，過100目鋼篩，制成脾細胞懸液。 （2）用培養(yǎng)液離心洗滌脾細胞3次，用臺盼藍檢查活細胞數(shù)在95％以上。將細胞用培養(yǎng)液稀釋成2×106個/ml。,70,（3）將脾細胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，3～4復孔（也可更多）。加入有絲分裂原，培養(yǎng)72h。 （4）終止前6h，每孔加入3H-TdR 1ml，使其終濃度為1～5μci/ml。 （5）用微量多頭細胞收集儀，將細胞抽吸在49型

47、玻璃纖維濾紙上，置80℃烘箱內(nèi)干燥30min。 （6）將烘干的濾紙片放入盛有閃爍液的小瓶中，用液閃儀測定樣品中的放射強度（cpm）。,,72,【注意事項】 （1）無菌操作。 （2）脾細胞制備要放在冰浴中，避免細胞死亡帶來誤差。 （3）中藥粗制劑中影響因素較多，注意假陽性?！驹u價】（1）3H-TdR摻入法客觀準確。經(jīng)典方法。（2）可直接觀察藥物本身對淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響，也可觀察與有絲分裂原的協(xié)同or拮抗作用。,73,MTT

48、法：【基本原理】 Mosmann等根據(jù)細胞內(nèi)能量代謝水平與DNA合成水平平行相關，首創(chuàng)了四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法。MTT進入細胞后作為反應底物，被氧化成藍色的甲臜（formazan），存積于細胞內(nèi)及周圍，加入DMSO，使細胞破裂，并使細胞內(nèi)甲臜釋放出來，測定OD490nm。,74,（二）二硝基氟苯誘導小鼠DTH反應【基本原理】 DNFB是一種半抗原，將其溶液涂抹腹部皮膚后，與皮膚蛋白結合成完全抗原，由此刺

49、激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞。4~7天后將其再次涂抹皮膚，可使局部產(chǎn)生DTH反應，一般在抗原攻擊24~48h達高峰，故此時測定局部腫脹。,75,【操作步驟】 （1）致敏：小鼠，隨機分組，腹部去毛，范圍約3×3cm2，并將1％DNFB溶液均勻涂抹于腹部皮膚，必要時于次日再強化一次。 （2）DTH反應產(chǎn)生與測定：致敏后第5天，將1％DNFB溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊，對照組同樣涂耳但未致敏。,76,攻

50、擊24h后，脫頸處死小鼠，用直徑8mm的打孔器打下圓形耳片，稱重，以左右耳片總量之差為腫脹度；同時取小鼠胸腺及脾臟稱重，計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)（以每10g體重計）?！咀⒁馐马棥?（1）DNFB溶液要臨用前新鮮配制。 （2）在小鼠腹部應盡量去毛，且應避免剪破皮膚。 （3）操作者避免DNFB與皮膚接觸。實驗環(huán)境控制在20±2℃為宜。,小 結一、影響非特異性免疫功能實驗（一）碳粒廓清法/吞噬雞紅細胞法/化學發(fā)光測

51、定法(巨噬細胞)（二）溶菌酶測定法（三）硝類蘭四氮唑（NBT）還原試驗(中性粒細胞)（四）NK細胞活性檢測,LDH法二、影響體液免疫功能的實驗方法（一）血清溶血素測定法（二）抗體形成細胞測定法（PFC）（三）抗體水平的檢測三、影響細胞免疫功能的實驗方法（一）淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（二）DTH反應（三）細胞因子測定（四）細胞亞群檢測,78,常用免疫學技術免疫沉淀 利用抗原抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一

52、種方法。抗體與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后，再與蛋白 A／G（Protein A／G）或二抗偶聯(lián)的agaose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗體－目的蛋白復合物，沉淀經(jīng)洗滌后，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。,79,2.免疫轉(zhuǎn)印技術基本原理是將蛋白質(zhì)先行電泳分帶，然后將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用標記信號分子（同位素、酶、熒光）的

53、抗體進行結果判定。 Western blot,81,3.免疫組織化學技術,應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。,83,4.細胞因子的測定1）m

54、RNA的表達水平 RT-PCR，real-time PCR2）生物活性測定法 IL-2，CTLL-2細胞株3）酶聯(lián)免疫測定法 ELISA4）細胞內(nèi)細胞因子測定 流式細胞術 5）蛋白質(zhì)芯片技術,,84,ELISA （Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay） 基礎:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直

55、接相關，由此進行定性或定量分析。,ELISA的原理,85,ELISA的類型,ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"immunosorbent；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物。 可設計出各種不同類型的檢測方法。,Example TGF-?1,,8

56、9,流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。該技術是一項集激光技術、光電測量技術、計算機技術、流體力學、免疫熒光細胞化學技術及單克隆抗體技術為一體的新型高科技細胞分析技術。概括地說，流式細胞技術是通過流式細胞儀(flowcytometer)對處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速和準確地定量分析和分選。流式細胞術在生物醫(yī)學領域中應用十分廣泛。凡能被熒光分子標記的

57、細胞或微粒均能用于流式細胞儀檢測。,90,CD3+CD8-IL-17+ Th17anti-CD3-FITC，anti-CD8-PE，anti-IL-17-APC,Control,Depression,0.3,0.5,,91,CD3+CD4+ cellsanti-CD3-FITC，anti-CD4-Percp-cy5,,92,5.淋巴細胞亞群的檢測、分選 細胞表面標志 1）流式細胞儀 2）