南開大學分子生物物理-蛋白質(zhì)的折疊

1、1,蛋白質(zhì)的功能,催化功能,運輸功能,防御功能,收縮和運動功能,結構功能,信號傳導和調(diào)控功能,遺傳和發(fā)育,2,蛋白質(zhì)的合成過程,3,4,蛋白質(zhì)的結構表示,5,6,蛋白質(zhì)通過結構專一性結合實現(xiàn)其功能,,7,8,腎上腺素,9,蛋白質(zhì)折疊問題是生命科學領域的前沿課題之一，并且被列為“21世紀的生物物理學”的重要課題，它是分子生物學中心法則尚未解決的一個重大生物學問題。從一級序列預測蛋白質(zhì)分子的三級結構并進一步預測其功能，是極富挑戰(zhàn)性的工作。研

2、究蛋白質(zhì)折疊，尤其是折疊早期過程，即新生肽段的折疊過程是全面的最終闡明中心法則的一個根本問題。,第二章 蛋白質(zhì)的折疊,10,遺傳信息的傳遞,,DNA,,RNA,,Proteins,多肽鏈,,有活性的蛋白質(zhì)天然構象,實質(zhì)上是多肽鏈,遺傳信息的傳遞應該是從核苷酸序列到有完整結構的功能蛋白質(zhì)的全過程。,11,定義：蛋白質(zhì)折疊是多肽鏈憑借相互作用在細胞環(huán)境（特定的酸堿度、溫度等）下自己組裝自己，從無規(guī)卷曲（去折疊態(tài)）折疊到三維功能結構（天然

3、態(tài)）的物理過程。,§2.1 蛋白質(zhì)折疊的基本概念和研究概況,12,DNA RNA 蛋白質(zhì)（新生肽鏈）新生肽鏈必須經(jīng)歷一系列極其復雜的加工過程，包括氨基酸殘基的化學修飾諸如二硫鍵的形成、糖基化作用、羥基化作用、磷酸化作用等?，F(xiàn)在已知的與翻譯同時進行或在翻譯完成后進行的化學修飾反應已經(jīng)超過100種。新生肽鏈必須進行折疊，才能形成一定的三維結構。每一個新合成的多肽鏈都必須轉運到細胞內(nèi)特定的場所或者被

4、分泌到細胞外區(qū)發(fā)揮作用。這些轉運往往需要經(jīng)過一次甚至多次的跨膜過程。完全折疊好的蛋白質(zhì)是不能跨越細胞膜的，因此如果折疊過早或過多，還要先去折疊，才能跨膜運輸?shù)教囟ǖ陌l(fā)揮其生物功能的場所，再最終折疊成為功能蛋白。,,,13,多亞基蛋白還要進行亞基的組裝。許多以前體形式合成的蛋白，如一些蛋白酶等還必須經(jīng)過水解除去前體分子中的“前序列”才能轉變成具有活性的酶分子。新生肽只有折疊成特定的三維結構，才能獲得特定的生物學功能，成熟為功能蛋白分子

5、。新生肽的折疊不僅指肽鏈在空間的盤卷，而是包括廣義的新生肽鏈的整個成熟過程，包括化學修飾、跨膜轉運、亞基組裝、水解激活等。,14,20世紀50年代Fraekel和Williams從煙草斑紋病毒分離出外殼蛋白和核糖核酸，在體外生理條件下重組得到有感染活力的病毒粒子。60年代美國生物化學家安芬森（Anfinsen） 根據(jù)還原變性的牛胰核糖核酸酶在去除變性劑和還原劑后，不需要任何其他物質(zhì)的幫助，能夠自發(fā)的形成正確的4對二硫鍵，重新折疊成天

6、然的三維結構，并恢復幾乎全部生物活性的實驗，提出“多肽鏈的氨基酸序列包含了形成其熱力學上穩(wěn)定的天然構象所必須的全部信息”或者說“一級結構決定高級結構”的著名論斷，為此Anfinsen 獲得1972年Nobel化學獎。,蛋白質(zhì)折疊研究的概況,15,Anfinsen's work, 1957-63: formation of native disulfide bonds in ribonuclease A and other pro

7、teins. Key discovery: the information needed for folding is contained in the amino acid sequence.,Anfinsen 對 Ribonuclease 的研究提出了蛋白質(zhì)一級結構決定高級結構的假說。,16,這些經(jīng)典的工作開辟了近代蛋白質(zhì)折疊的研究，形成了蛋白質(zhì)折疊自組裝（self－assembly）的主導學說。 Anfinsen 原理揭示了

8、蛋白質(zhì)的氨基酸序列決定蛋白質(zhì)分子在熱力學上穩(wěn)定的三維結構的必然，但是沒有闡明蛋白質(zhì)折疊的全過程，還有些問題需要回答：一級結構到底如何決定高級結構？具有完整一級結構的多肽鏈又如何克服在動力學上可能的能障，最終達到這個熱力學上最穩(wěn)定的狀態(tài)？是否存在像三聯(lián)遺傳密碼那樣的第二套密碼，即氨基酸序列決定蛋白質(zhì)的三維結構的所謂的“折疊密碼” ？按照Anfinsen原理，在理論上應該可以根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預測其相應的“唯一”的三維結構，那么，如何由

9、一級結構預測三級結構？,17,近年來的研究表明蛋白質(zhì)折疊是一個序變過程，可通過捕捉蛋白質(zhì)折疊的中間狀態(tài)了解蛋白質(zhì)折疊的全過程。在研究牛與人的α－乳清蛋白酸變性、熱變性和在中等濃度鹽酸胍溶液中變性時的各種物理性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在這些條件下都能形成一種彼此類似但又不同于天然分子的結構，具有與天然蛋白不同的新的物理狀態(tài)—“熔球態(tài)”。熔球態(tài)是蛋白質(zhì)折疊過程的中間態(tài)，與天然分子比較，雖然被動性增加，不存在特定的牢固安排的側鏈基團，但其結構仍是緊密的，

10、并且具有顯著的分子柔性，二級結構含量很高。對大多數(shù)小分子量蛋白質(zhì)來說，變性的蛋白質(zhì)在沒有外力的情況下可以通過折疊達到天然狀態(tài)。,18,體內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊往往需要有其他輔助因子的參與，并伴隨有ATP的水解。因此，Ellis 于1987年提出了蛋白質(zhì)折疊的“輔助性組裝學說”。這表明蛋白質(zhì)的折疊不僅僅是一個熱力學的過程，顯然也受到動力學的控制?！拜o助性組裝學說”認為，蛋白質(zhì)多肽鏈的正確折疊和組裝并非都能自發(fā)完成，在相當多的情況下是需要其他蛋

11、白質(zhì)分子的幫助，這類幫助蛋白包括分子伴侶（molecular chaperone）與折疊酶。新的觀點在實質(zhì)上并不和Anfinsen理論相矛盾，屬于蛋白質(zhì)折疊途徑或折疊的識別和組裝問題上的認識的完善 。,19,如果一級結構是肽鏈折疊形成功能蛋白質(zhì)的特定三維結構的內(nèi)因是第一要素；那么幫助蛋白質(zhì)肽鏈正確折疊的外因是條件，外因要通過內(nèi)因起作用；但如果沒有適當?shù)某浞值臈l件，多肽鏈也不能折疊成為活性蛋白質(zhì)。,20,蛋白質(zhì)折疊的研究內(nèi)容,蛋白質(zhì)折疊的

12、研究，狹義的定義就是研究蛋白質(zhì)特定三維空間結構形成的規(guī)律、穩(wěn)定性及與其生物活性的關系。在概念上有熱力學的問題和動力學的問題；有在體外折疊和在細胞內(nèi)折疊的問題；有理論研究和實驗研究的問題。,21,最根本的科學問題就是多肽鏈的一級結構到底如何決定它的空間結構？既然前者決定后者，一級結構和空間結構之間肯定存在某種確定的關系，這是否也像核苷酸通過“三聯(lián)密碼”決定氨基酸順序那樣有一套密碼呢？后來，有人把這設想的一級結構決定空間結構的密碼

13、叫作“第二遺傳密碼”。因此，研究蛋白質(zhì)折疊的過程，可以說是破譯“第二遺傳密碼”——折疊密碼（folding code）的過程。,22,變性：蛋白質(zhì)受到某些物理因素如熱、紫外照射、高壓和表面張力等或化學因素如有機溶劑、脲、鹽酸胍、酸、堿等的影響，會發(fā)生蛋白質(zhì)的變性。變性作用不涉及共價鍵的斷裂，蛋白質(zhì)的一級結構保持完好，但高級結構被破壞，天然構象解體。 蛋白質(zhì)變性的的化學本質(zhì)：維持高級結構的次級鍵（氫鍵，離子鍵，疏水相互作用，范德華力等）

14、被破壞（一級結構不被破壞），特別是氫鍵的破壞，從而具有活性的蛋白質(zhì)空間構象被破壞。 有些蛋白質(zhì)的變性是可逆的。 將變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)可以恢復其天然構象，這個過程稱為蛋白質(zhì)的復性（renaturation）。,§2.2 蛋白質(zhì)折疊的熱力學考慮,23,折疊去折疊變性復性,in vivo: 新生肽的折疊in vitro: 變性（去折疊）蛋白的復性（重折疊）,24,變性后高級結構破壞，一級結構不變,25

15、,變性條件,1.　溫度2.　pH3.　鹽4.　變性劑,有機溶劑脲鹽酸胍去垢劑,尿素：碳酸(全)酰胺O=C(NH2)28M胍：HN=C(NH2)26M,26,Native Protein Denatured,27,變性原理,破壞次級鍵不破壞共價鍵,溫度：較高時導致蛋白質(zhì)交聯(lián)聚沉，凝固，不可逆pH ：破壞鹽鍵，影響解離，改變相互作用的性質(zhì)鹽?。夯疃?，溶解度脲?。焊偁帤滏I,28,由于蛋白質(zhì)的功能決定于它們的天然構

16、象，因而過去研究工作集中在蛋白質(zhì)的天然構象上，而對變性態(tài)沒有給予足夠重視。近來，人們已知道蛋白質(zhì)的非天然構象至少在以下三方面有重要作用：1、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性2、蛋白質(zhì)的跨膜運輸3、蛋白質(zhì)的水解和更新,29,小分子蛋白質(zhì)去折疊轉變是可逆的。在周圍環(huán)境的誘導下，小分子蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊，當將環(huán)境刺激因素去掉后，去折疊的蛋白質(zhì)又可以再折疊。,30,Anfinsen的經(jīng)典熱力學假說： Anfinsen認為天然蛋白質(zhì)多肽鏈所

17、采取的構象是在一定環(huán)境條件下（如溶液組分、pH、溫度、離子強度等），整個系統(tǒng)的總Gibbs自由能取最低，所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈能夠在這樣的環(huán)境下自發(fā)折疊成天然構象。,31,Anfinsen實驗變性蛋白的復性實驗,從二硫鍵入手，提出假設，實驗驗證其正確性材料: 牛胰核糖核酸酶含4對二硫鍵26-8440-9558-11065-72,-S-S-交聯(lián)方式: 7x5x3x1=105種，天然只占其中一種,32,牛胰核糖核酸酶的一

18、級結構,33,Anfinsen實驗,模型一：空間障礙，只允許一種構象（二硫鍵配對）模型二：生物合成的結果模型三：先形成了熱力學穩(wěn)定構象，然后形成二硫鍵加固,實驗否定了前兩種假設，肯定了第三種,34,Anfinsen實驗,實驗一：1. 脲變性。Ribonuclease + 8M脲 + ?-巰基乙醇，脲使得肽鏈展開，酶失活；2. 透析除脲和?-巰基乙醇；3. pH~8弱堿性條件，溶液暴露于空氣中，重新氧化復性，酶活力重新獲

19、得。,35,36,37,?-巰基乙醇,一種有機化合物，其化學式為HOCH2CH2SH，英文通用縮寫為ME或βME。它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能團，為揮發(fā)性液體，具有較強烈的刺激性氣味。βME通常用于二硫鍵的還原，可以作為生物學實驗中的抗氧化劑。由于β-巰基乙醇能夠打開蛋白質(zhì)的結構，它常常被用于蛋白質(zhì)分析。此外，β-巰基乙醇也常常被用于保護蛋白質(zhì)中自由的半胱氨酸巰基之間不會錯誤形成二硫鍵。,

20、38,過量巰基乙醇導致還原,脲變性,39,錯配的二硫鍵只需要加一點點巰基乙醇就可復性,40,Anfinsen實驗,實驗二1. 同上。Ribonuclease + 8M脲 + ?-巰基乙醇，脲使得肽鏈展開，酶失活；2. 透析除巰基乙醇，然后通O2，再透析除脲。結果：酶活性恢復到~0.01,41,Anfinsen實驗,1. 由實驗一可知，模型 2 不成立，因為離體條件下復性的蛋白具有全部酶活性（后來又有實驗證明體外解折疊是完

21、全的，全人工合成）。2. 由實驗二可知，模型 1 不成立，否則，復性的蛋白應該具有幾乎全部酶活性。3. 模型 3 能夠解釋 both 結果。,結論：蛋白質(zhì)一級結構決定三級結構形成三級結構所需要的所有信息包含在一級結構中。,42,Anfinsen實驗,Anfinsen實驗的啟示：1. 成功需要一點點運氣（簡單的單結構域蛋白）2. 抓住主要矛盾，善于洞察問題的本質(zhì)3. 嚴謹?shù)耐评聿皇堑玫秸_結論的必要條件,正確的前提＋

22、正確的推導＝正確的結論正確的前提＋錯誤的推導＝正確或錯誤的結論錯誤的前提＋正確的推導＝錯誤的結論（大概率）錯誤的前提＋錯誤的推導＝正確或錯誤的結論,Model 1 and 2 都有實驗支持,43,同時代取得的其它一些結果,折疊是以結構域為單位進行的。 Ribonuclease A 去除 5 C-末端殘基后，蛋白質(zhì)就喪失了正確形成二硫鍵的能力。 (H. Taniuchi, J. Biol. Chem. 245, 5459-546

23、8; 1970) 含有兩個或多個結構域的蛋白質(zhì)，相鄰結構域的解折疊是近似相互獨立的。,44,§2.3 折疊的動力學考慮,有無中間體？最低自由能構象能否達到？折疊過程是怎樣的？,45,單一結構域的蛋白質(zhì)，不存在平衡中間態(tài)。,兩態(tài)折疊,46,折疊中間態(tài)的發(fā)現(xiàn),首先在折疊、去折疊的早期動力學時相（快速反應）中發(fā)現(xiàn)。(Cytochrome c: A. Ikai and C. Tanford, Nature 230, 100-

24、102; 1971; ribonuclease A: T. Y. Tsong, R.L. Baldwin and E.L. Elson, PNAS 68, 2712-2715; 1971),47,折疊中間態(tài)?,無輔基肌紅蛋白(Apo-Mb)變性圖,,圓二色譜：殘基摩爾橢圓度,48,蛋白質(zhì)折疊研究技術,研究表明：每種蛋白質(zhì)都用自身偏好的方式進行折疊。某些蛋白質(zhì)可在十億分之幾秒內(nèi)折疊起來，某些則要耗費數(shù)毫秒才能卷縮成首選結構。由于蛋白質(zhì)折疊

25、如此之快，所以對其研究很困難。 費城賓夕法尼亞大學Feng Gai研究組創(chuàng)造出極簡單的蛋白質(zhì)，可折疊成最普通的螺旋。對蛋白質(zhì)上氨基酸用C13標記，將它們放入水浴并用激光照射整個系統(tǒng)。激光對蛋白質(zhì)加熱十億分之三秒，使其打開折疊。然后在重新折疊時用紅外光譜觀察C13和其他原子間化學鍵的變化情況。記錄一段“延長了的”信號，表明蛋白質(zhì)以不同的速度不同的途徑進行折疊。 Weizmann研究小組將蛋白“誘騙”到由脂質(zhì)構成的小泡中，小泡約100n

26、m寬，蛋白質(zhì)在小泡中可自由移動，能夠被聚焦的激光束完全照射到（激光束約為300納米寬）。研究證明即使最終形狀一樣的蛋白質(zhì)也通過不同路線折疊。,49,多種技術結合：光譜學，波譜學和x 射線分析?？焖俸舜殴舱窦夹g已經(jīng)能夠在秒到皮秒的時間域上觀察蛋白質(zhì)結構的運動過程，其中包括主鏈和側鏈的運動，以及在各種不同的溫度和壓力下蛋白質(zhì)的折疊和去折疊過程。快速光譜技術（熒光，遠紫外和近紫外圓二色?,蛋白質(zhì)折疊研究技術,50,快速檢測蛋白質(zhì)

27、折疊的方法,停流,51,通過二硫鍵捕捉中間體,碘乙酸抑制二硫鍵的生成，在不同的時間加入碘乙酸，得到二硫鍵數(shù)目不同，構象不同的蛋白質(zhì)，然后利用柱層析分離。,52,牛胰蛋白酶抑制劑的二硫鍵折疊途徑,,中間體,,限速,,53,蛋白質(zhì)折疊過程的時間尺度,54,多肽鏈能夠采取的構象個數(shù)是個天文數(shù)字， 平均每個Aa可以有10種構象，100Aa的多肽鏈有10100種可能的構象。從一個構象轉變?yōu)榱硪粋€構象所需最短時間10－13s，則該蛋

28、白嘗試所有的構象的時間是1085s=1077y，而人們觀察到蛋白質(zhì)體內(nèi)、體外折疊的時間是10-1～10-3s. 結論：蛋白質(zhì)的折疊不是隨機嘗試所有可能的構象直到遇到某個自由能最低的構象，而是沿著某些確定的途徑進行的。蛋白質(zhì)的天然構象未必是最低自由能的構象，而是動力學途徑中所能得到的穩(wěn)定的構象。,55,對蛋白折疊過程的共識－－兩種過程,成核：小蛋白多步：大蛋白，以結構域為單位,56,(去)折疊過程中的限速步驟,1. 脯氨

29、酸異構 脯氨酸異構是一個慢反應(秒)，去折疊形式下發(fā)生， 產(chǎn)生折疊過程中的動力學中間態(tài)。 (J.-R. Garel and R.L. Baldwin, PNAS 70, 3347-3351; 1973; J.F. Brandts, H.R. Halvorson and M. Brennan, Biochemistry 14, 4953-4963; 1975; F.X. Schmid and R.L. Baldwin, PNAS

30、 75, 4764-4768; 1978).,脯氨酸異構造成的動力學曲線復雜化不屬于折疊中間態(tài),57,(去)折疊過程中的限速步驟,2. 二硫鍵異構如前所述，略,58,蛋白質(zhì)折疊的啟動,疏水塌縮經(jīng)熔球中間態(tài) （molten globule state）二級結構生成框架結構模型特殊作用的啟動Disulfide bonds去折疊態(tài)中的殘留有序結構,59,快速可逆形成一些二級結構,通過折疊核心的延展形成一些結構域,通過結構域的組裝

31、形成“熔球態(tài)”,結構域構象的調(diào)整,形成蛋白單體,60,1、局部肽段形成一些構象單元（?螺旋、?折疊和?轉角等）——Motifs——三級結構；2、肽鏈內(nèi)部的疏水作用引起一個塌陷過程，然后經(jīng)調(diào)整，形成不同層次的結構。3、 “熔球態(tài)”的中間狀態(tài)。在熔球態(tài)中，蛋白質(zhì)的二級結構已基本形成，蛋白質(zhì)的整體空間結構也初具規(guī)模。在熔球態(tài)時，分子立體的結構再作一些局部調(diào)整，最后形成正確的立體結構。,61,折疊過程的動力學模擬,動力學模擬能夠成功的再現(xiàn)折

32、疊過程的細節(jié)，例如過渡態(tài)的結構(D. Baker, Nature 405, 39-42; 2000)和折疊中間體 (C. Clementi, P.A. Jennings and J.N. Onuchic, PNAS 97, 5871-5876; 2000),62,Bakei, D.等認為， 如果多肽鏈所采取的構象中只有一個低自由能狀態(tài)，即天然構象，則所有非天然構象多肽鏈將遵循經(jīng)典熱力學假說，由高能態(tài)向低能態(tài)轉變，最終形成

33、天然構象。 但有些蛋白，天然構象也許并非是多肽鏈自由能最低的構象或唯一的低能構象，多肽鏈采取非天然的構象也很穩(wěn)定，而這兩種構象之間轉變需要克服很高勢壘而難以實現(xiàn)，那么蛋白質(zhì)在折疊過程中就會有兩種途徑的競爭，一種是正確折疊形成天然構象，一種是錯誤折疊形成非天然構象。蛋白質(zhì)之所以能夠形成正確的構象，是由于一些因素在蛋白質(zhì)折疊的動力學過程中起驅動作用。,63,§2.4 蛋白質(zhì)折疊的理論模型,框架模型（Framewor

34、k Model）疏水塌縮模型（Hydrophobic Collapse Model）擴散-碰撞-粘合模型 （Diffusion-Collision-Adhesion Model）成核-凝聚-生長模型（Nuclear-Condensation-Growth Model）拼版模型（Jig-Saw Puzzle Model）熔球態(tài)模型（molten globule）,64,框架模型（Framework Model）,P. S. Ki

35、m 和R. L. Baldwin 于1982 年提出， 假設蛋白質(zhì)局部構象依賴于局部的氨基酸序列；在多折疊的起始階段，先迅速形成不穩(wěn)定的二級結構單元，稱為“flickering cluster”；隨后二級結構靠近，形成穩(wěn)定的二級結構框架；最后二級結構框架相互拼接，肽鏈逐漸緊縮，形成三級結構。這個模型認為即使是一個小分子的蛋白也可以一部分一部分的進行折疊，其間形成的亞結構域是折疊中間體的重要結構。,65,疏水塌縮模型（Hydro

36、phobic Collapse Model）,在疏水塌縮模型 中，疏水作用力被認為是在蛋白質(zhì)折疊過程中起決定性作用的力的因素。疏水片段首先聚集在一起，然后進一步聚集長大，形成蛋白中間體 ，進而形成高級結構 。在形成任何二級結構和三級結構之前首先發(fā)生很快的非特異性的疏水塌縮。,66,擴散-碰撞-粘合模型 (Diffusion-Collision-Adhesion Model）,蛋白質(zhì)的折疊起始于伸展肽鏈上的幾個位點，在這些位點上生成

37、不穩(wěn)定的二級結構單元或疏水簇，主要依靠局部序列（3-4個殘基）相互作用來維系。疏水簇以非特異性布朗運動方式擴散、碰撞、相互黏附，導致大的結構生成并增加穩(wěn)定性。進一步碰撞形成具有疏水核心和二級結構的類熔球態(tài)中間體。球形中間體調(diào)整為致密的、無活性的類似天然結構的高度有序熔球態(tài)結構。最后無活性高度有序熔球態(tài)轉變?yōu)橥暾谢盍Φ奶烊粦B(tài)。,67,成核-凝聚-生長模型（Nuclear-Condensation-Growth Model）,伸

38、展多肽鏈開始折疊時，肽鏈中的某些區(qū)域可以形成“折疊晶核”，由8-18個氨基酸殘基組成，它們隨機波動，很不穩(wěn)定，多肽鏈的其它部分以以它們?yōu)楹诵?，整個肽鏈繼續(xù)折疊進而獲得天然構象。所謂“晶核”實際上是由一些特殊的氨基酸殘基形成的類似于天然態(tài)相互作用的網(wǎng)絡結構，這些殘基間不是以非特異的疏水作用維系的，而是由特異的相互作用使這些殘基形成了緊密堆積。晶核的形成是折疊起始階段限速步驟。,68,拼版模型（Jig-Saw Puzzle Model）

39、,中心思想是多肽鏈可以沿多條不同的途徑進行折疊，在沿每條途徑折疊的過程中都是天然結構越來越多，最終形成天然構象。每條途徑的折疊速度都較快，與單一途徑折疊方式相比，多肽鏈速度較快，另一方面，外界生理生化環(huán)境的微小變化或突變等因素可能會給單一折疊途徑造成較大的影響 這些變化可能給某條折疊途徑帶來影響，但不影響另外的折疊途徑，因而不會從總體上干擾多肽鏈的折疊。,69,分為二維模型和三維模型兩類。二維格點模型就是在平面空間中產(chǎn)生正交的單位長度

40、的網(wǎng)格，每個氨基酸分子按在序列中排序的先后順序依次放置到這些網(wǎng)格交叉點上，在序列中相鄰的氨基酸分子放置在格點中時也必須相鄰，即相鄰氨基酸分子在格點模型中的距離為1。網(wǎng)格中的每個交叉點最多只能放置一個氨基酸分子，如果序列中的某個氨基酸分子已經(jīng)放置在此位置上，則后序的氨基酸分子就不可以再放置在這個格點上。三維格點模型和二維格點模型相似，它是在三維空間中產(chǎn)生的單位長度的立體網(wǎng)格。格點中放置氨基酸分子的方法和二維的相同，但在二維格點模型中放置氨

41、基酸分子時除了序列前兩個氨基酸分子外最多只有三個方向可以選擇，而在三維格點模型中復雜度提高了很多，放置氨基酸分子最多可以有五個方向可選。,格點模型（HP模型）,70,多肽鏈折疊分為三個階段，在多肽鏈折疊的起始階段類似“拼圖模型”，多肽鏈沿多條途徑迅速形成許多具有一些局部結構的中間體，折疊的中間階段類似“成核/快速生長模型”的快速生長階段，多肽鏈在第一階段形成的局部結構的基礎上進行快速折疊“生長”形成具有較多天然結構的中間體，復性的最后階

42、段是中間體向天然構象的轉變，這是整個折疊過程中的限速步驟。,動力學模型(The kinetic model),71,蛋白質(zhì)折疊動力學模型　U1-6:伸展多肽鏈I1-3:具有局部結構的中間體I4:具有較多天然結構的中間體NN:天然構象,72,這些模型各有特點，這與模型提出者們各自研究的對象及側重點不同有關，它們之間有許多相似之處，如“框架模型”與“擴散-碰撞-締合模型”中各自所指的“微結構域”和“flickering clust

43、er”型” 和“成核/快速生長模型”的一些觀點。Baldwin.R.L為在多肽鏈的始階段，“疏水折疊”和二級結構的形成（框架模型）就是互補的，它們在多肽鏈折疊的起始階段可以同時存在。因為在“溶球體”中就有大量的二級結構。,73,除了這些折疊模型外，還有學者從另外的角度來考慮多肽鏈在體內(nèi)快速折疊的問題，如Karplus等用Monte Carol法對200個隨機序列的折疊動力學進行了研究，發(fā)現(xiàn)其中30種能快速折疊，而其中146種折疊速度很慢

44、。他們認為，在生物進化過程中，自然界容易選擇那些能快速折疊而最終達到熱力學上穩(wěn)定結構的序列，而那些折疊緩慢的多肽鏈在生物體內(nèi)容易被蛋白酶降解而被自然界淘汰。,74,另外，多肽鏈在體內(nèi)的快速折疊顯然是由生物體內(nèi)這個特殊的生理環(huán)境所決定的，折疊過程受到許多酶的催化，如蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶(PDI)，脯氨酰順反異構酶(PPI)等，分子伴侶在這個過程中也會起到重要作用，多肽鏈在體內(nèi)折疊還可能是伴隨著翻譯/轉移進行的。Bergman,L.W.和Ku

45、ebl.W.M.發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白輕鏈的Cys35-Cys100這對天然二硫鍵是伴隨著多肽鏈的翻譯及向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉移的過程中形成的，說明多肽鏈N端部分在翻譯還未完成時就可能開始折疊，這顯然也是多肽鏈在體內(nèi)快速折疊的一個原因。,75,§2.5 幫助新生肽折疊的蛋白（輔助蛋白）,分子伴侶折疊酶分子內(nèi)伴侶,Ellis1987年提出了蛋白質(zhì)“輔助性組裝學說”。相對于“自組裝”學說，認為蛋白質(zhì)多肽鏈的正確折疊和組裝需要其他蛋白質(zhì)分子的幫

46、助。,76,分子伴侶（chaperone）——蛋白質(zhì)的保姆,許多蛋白質(zhì)的多肽單體在離體條件下能折疊、組裝成具有生物學功能的聚合體，但在體內(nèi)絕大多數(shù)新生肽三維結構的形成，需要一類稱為分子伴侶的輔助蛋白的存在?！　》肿影閭H是能夠結合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構象，并能通過有控制的結合和釋放，促進新生多肽的折疊、多聚體的裝配或降解及細胞器蛋白的跨膜運輸?shù)鹊囊活惖鞍??！　≡趧游铩⒅参?、細菌?nèi)廣泛分布和存在，其功能是介導其它蛋白質(zhì)的折疊和裝

47、配，而本身卻不是最終功能蛋白質(zhì)分子的組成部分。,77,定義,分子伴侶：(chaperone或molecular chaperone，也可譯為伴侶蛋白)，是細胞內(nèi)的一類保守蛋白質(zhì)，在序列上沒有相關性但有共同功能，它們在細胞內(nèi)可識別肽鏈的非天然構象，幫助其完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構成這些蛋白質(zhì)結構執(zhí)行功能時的組份。,78,分子伴侶的特征,從參與促進一個反應而本身不在最終產(chǎn)物中出現(xiàn)這一點來看，分子伴侶具有酶的特征。但從以下

48、三方面來看，分子伴侶和酶很不同。1、分子伴侶對靶蛋白沒有高度專一性，同一分子伴侶可以促進多種氨基酸序列完全不同的多肽鏈折疊成為空間結構、性質(zhì)和功能都不相關的蛋白質(zhì)。2、它的催化效率很低。行使功能需要水解ATP，以改變其構象，釋放底物，進行再循環(huán)。3、它和肽鏈折疊的關系，主要是阻止錯誤折疊，而不是促進正確折疊。4、多能性（脅迫保護防止交聯(lián)聚沉，轉運，調(diào)節(jié)轉錄和復制，組裝細胞骨架）5、進化保守性,79,分子伴侶的分類,伴侶素家族

49、(Charperonin, Cpn)GroEL/S (Hsp60)家族和 Tric家族熱休克蛋白 70家族 (Hsp70)熱休克蛋白 90家族 (Hsp90)其它種類的分子伴侶,80,81,熱休克蛋白家族促進蛋白質(zhì)折疊的基本作用——結合保護待折疊多肽片段，再釋放該片段進行折疊。形成HSP70和多肽片段依次結合、解離的循環(huán)。,82,Hsp70 系統(tǒng)包括Hsp70、Hsp40 和GrpE。它們能作用于新合成的蛋白質(zhì)、跨膜運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)

50、和在脅迫下變性的蛋白質(zhì)。這個系統(tǒng)的名字反應了Hsp70蛋白質(zhì)最初是通過熱激(Heatshock)作用的誘導發(fā)現(xiàn)的，很多熱激蛋白質(zhì)都是分子伴侶。Hsp70 和Hsp40 蛋白質(zhì)都能獨立地與其結合底物。Hsp40 包括一個與Hsp70 相互作用的結構域。Hsp70既與Hsp40 結合又與未折疊的蛋白質(zhì)結合。Hsp70與Hsp40之間的相互作用激活了Hsp70 的ATPase 活性。與ADP結合的復合物與蛋白質(zhì)底物結合，并且一直持續(xù)到到Gr

51、pE將ADP 替換。這種替換造成復合物的解體，包括Hsp40解離，ATP 與Hsp70結合，然后Hsp70 解離。蛋白質(zhì)的折疊是經(jīng)過幾輪的結合與解離完成的。當?shù)鞍踪|(zhì)的鏈延長時，Hsp70可能從一個結合位點上解離接著又重新結合到其它位點，使底物蛋白質(zhì)的一部分有序地正確折疊。最后，整個蛋白質(zhì)從核糖體上釋放，并折疊為成熟的構型。,83,伴侶素GroEL/GroES系統(tǒng)促進蛋白質(zhì)折疊過程,伴侶素的主要作用——為非自發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成

52、天然空間構象的微環(huán)境。,84,Chaperone and chaperone-mediated protein folding,85,Hsp60 家族分子伴侶組成一個大的包括兩種類型亞基的結構。Hsp60 本身(在E. coli中稱為GroEL)形成具有14 個亞基的結構，以相反的方向互相堆疊成兩個七聚體環(huán)。就是說，這兩個環(huán)的頂部及底部的表面是完全相同的。中心的空洞貫穿這兩個環(huán)，所以這個結構像是一個中空的圓柱體。這個結構與Hsp10

53、(在E. coli為GroES)亞基構成的七聚體結合。一個GroES七聚體形成的隆起的鐘罩結構與雙環(huán)中的一個表面結合。這個隆起位于活性中心的上方，覆蓋圓柱體的一個開口。兩個GroEL 環(huán)一個是近端環(huán)(與GroES 結合)一個是遠端環(huán)(未與GroES 結合)。 GroEL有時被稱為分子伴侶，而GroES被稱為輔分子伴侶(Co-chaperonin)，因為GroEL在指導折疊的過程中起到了重要的作用，而GroES 輔助它的活性功能。,86,

54、GroEL 能同許多未折疊的蛋白質(zhì)結合，很可能是通過識別濃縮的“熔球(Moltenglobule)”狀態(tài)來完成的。與底物的相互作用是以底物表面和GroEL 暴露在活性空洞中殘基之間的疏水相互作用為基礎的。底物可能是已變性的蛋白質(zhì)；可能在其它分子伴侶的作用下將它們轉運到GroEL 上——例如Hsp70 可能幫助一個新生蛋白質(zhì)折疊，但隨后將其傳遞到GroEL上，這一過程直到它被核糖體釋放才結束。當GroES 和底物結合在同一個環(huán)上時，就

55、發(fā)生折疊(有可能是底物先結合在GroEL/GroES復合物的遠端環(huán)上，GroES解離下來再與另一個環(huán)結合)。當GroES與GroEL結合后，它誘導近端GroEL的一個構型變化，增加中心空洞的體積。這也改變了底物所處的環(huán)境。以前與底物結合的疏水殘基也涉及到與GroES的結合。結果使底物處在一個使其構型發(fā)生改變的疏水環(huán)境中。,87,ATP在GroEL行使功能中起重要作用。每個GroEL的亞基都含有一個ATP分子。近端環(huán)上亞基上的ATP對于折

56、疊是必要的。在這一步驟不需要水解。但底物的釋放需要水解，近端環(huán)上的ATP只起到間接的作用。近端環(huán)上ATP的水解降低了GroEL和GroES之間的親和性。GroES 和底物的釋放需要遠端環(huán)的ATP 的水解。,88,89,90,91,折疊酶,蛋白質(zhì)多膚鏈的折疊過程中，還需要酶的催化，稱之為折疊酶。它們催化與蛋白質(zhì)折疊直接有關的、對形成功能構象所必需的共價鍵變化，幫助蛋白質(zhì)正確折疊。,92,折疊酶類型,許多研究表明，某些蛋白質(zhì)折疊的限速步驟是

57、共價鍵的異構化，需要相應的酶催化。(1) 蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶 PDI (Protein disulfide isomerase)(2) 肽基脯氨酰順反異構酶PPI (Peptidyl prolyl cis/trans isomerase),93,蛋白二硫鍵異構酶 (PDI),真核生物的PDI在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔活性很高，細菌中的類似物是Dsb家族，位于細菌外周質(zhì)(periplasm)，在肽鏈中催化錯配二硫鍵斷裂并形成正確二硫鍵連接，最終使蛋白

58、質(zhì)形成熱力學最穩(wěn)定的天然構象。通過催化巰基與二硫鍵的交換反應，從而催化蛋白質(zhì)二硫鍵的形成、還原（斷裂）或重排（異構化）。在蛋白質(zhì)折疊過程中，主要催化含有二硫鍵的膜蛋白或分泌蛋白的正確折疊。,94,肽基脯氨酰順反異構酶 (PPI),PPI廣泛分布于各種生物體及各種組織中，多數(shù)定位于胞漿，但也存在于大腸桿菌的外周質(zhì)、紅色面包霉的線粒體基質(zhì)、酵母、果蠅和哺乳動物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 肽基脯氨酰順反異構酶是蛋白質(zhì)三維構象形成的限速酶，在細胞中通過非共價鍵

59、方式，穩(wěn)定扭曲的酰胺過度態(tài)，而催化肽基脯氨酰順反式的相互轉變。在肽鏈合成后需形成順式構型時，可使多肽在各脯氨酸彎折處形成準確折疊。,95,PDI和PPI不僅可以起到折疊酶的催化作用，而且具有防止折疊中間體聚集的類似分子伴侶的功能。王志珍等最早提出PDI是分子伴侶的假說并驗證了PDI的這一功能。,96,分子內(nèi)伴侶 (intramolecular chaperones),1987年，Ikemura發(fā)現(xiàn)枯草桿菌素 (subtilisin)的

60、折疊需要前肽 (propeptide)的幫助。這類前肽常位于信號肽與成熟多肽之間，在蛋白質(zhì)合成過程中與其介導的蛋白質(zhì)多肽鏈是一前一后合成的，并以共價鍵相連接，是成熟多肽正確折疊所必需的，成熟多肽完成折疊后即通過水解作用與前肽脫離。Shinde和Inouye將這類前肽稱為分子內(nèi)伴侶。,97,§2.6 蛋白質(zhì)折疊?。╢old disease),“分子病”——由于基因突變造成蛋白質(zhì)分子中僅一個氨基酸殘基的變化就引起的疾病?！罢郫B

61、病”——或稱“構象病”蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列沒有改變，即一級結構正常，只是其二級結構、乃至立體結構（構象）異常而導致的疾病。,98,構象病的種類,1、由朊病毒蛋白構象變化所引起的疾病：致死家族性失眠癥、瘋牛病、羊瘙癢病等。2、淀粉樣蛋白等相關的神經(jīng)退行性疾?。喊柎暮Ｄ　⑶邦~顳癡呆綜合征、肌肉萎縮外側硬化癥、帕金森病。3、抑絲酶家族構象異常所引起的疾病：遺傳性血管水腫、家族型早期發(fā)作癡呆腦病。,99,早在三百年前，人類在綿羊和小山

62、羊中首次發(fā)現(xiàn)了“羊搔癢癥”。該病廣泛傳播于歐洲和澳洲，潛伏期18到26個月，患病動物興奮、搔癢、癱瘓直至死亡。后來又相繼發(fā)現(xiàn)了傳染性水貂腦軟化病、馬鹿和鹿的慢性消瘦病、貓的海綿狀腦病等。1996年春天英國蔓延的“瘋牛病”，它不僅引起英國一場空前的經(jīng)濟和政治動蕩，也波及了整個歐洲。1983年“植物和動物亞病毒病源：類病毒和朊病毒國際會議”正式把朊病毒歸入亞病毒領域。,朊病毒導致的疾病 ( Prion Diseases),100,Sc

63、rapie羊瘙癢癥,Kulu克魯病,瘋牛病,101,人類已知的朊病毒疾病現(xiàn)有： 克雅氏?。ǚ▏肆_伊茨菲爾德—雅各布氏病， Creutzfeldt–Jakob disease，CJD）：自身PrP蛋白發(fā)生變異引起的。 變異型克-雅氏?。╲CJD）：PRION感染。 GSS綜合征（格斯特曼綜合癥，Gerstmann-Straussler Scheinker disease）：由Prnp基因缺陷引起。 克魯?。ㄕ痤澆?， Kuru

64、）：PRION感染。 致死性家族性失眠癥（Fatal familial insomnia，F(xiàn)FI）：Prnp基因變異。 1976年諾貝爾獎（Carleton Gajdusek）：Kuru 1997年諾貝爾獎（ Stanley Prusiner ）： PrPsc 動物：羊瘙癢病（Scrapie）、牛海綿腦病（BSE 俗稱瘋牛?。┖吐埂⒇垺⑺醯鹊暮＞d腦病。 致病蛋白質(zhì)分子與正常蛋白質(zhì)分子的組成完全相同，只是空間結構不同。,102

65、,瘋牛病,牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)：俗稱瘋牛病(mad cow disease) ，1986年首次在英國報道。該病潛伏期4～5年，發(fā)病初期表現(xiàn)為體質(zhì)變差，體重減輕，產(chǎn)奶量下降等非特異性癥狀。隨后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀逐步明顯，出現(xiàn)小腦共濟失調(diào)、震顫等，由于病牛常表現(xiàn)出感覺過敏、恐懼甚至狂亂，因此俗稱“瘋牛病”。 死亡率100% ——可能威脅人類生存

66、 比愛滋病更可怕 ——無法找到防治疫苗 瘋牛病毒殺不死 ——常規(guī)消毒殺不死 瘋牛病防不勝防 ——醫(yī)療用品食品傳播　　　　　　　　　 化妝品也不能排除,103,瘋牛病中的蛋白質(zhì)構象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白 (prion protein, PrP) 錯誤折疊引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。 正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。這種結構比較脆弱，容易發(fā)生變異。 PrPc在某種未知蛋白

67、質(zhì)的作用下可轉變?yōu)榫哂蟹浅７€(wěn)定β-折疊結構的PrPsc，變異PrP能夠促使正常PrP發(fā)生變異，形成淀粉狀纖維，殺死神經(jīng)細胞從而致病。正常和變異的PrP成分相同，都由253個氨基酸構成。,104,PrPc,PrPsc,105,朊病毒,朊病毒病的病原體究竟是什么？ 蓋杜賽克等曾將庫魯病死者腦組織制成無菌、無原蟲的懸浮液，注入黑猩猩的顱腔，20個月時，黑猩猩發(fā)病，其癥狀與人相似，提示病原體不是細菌或原蟲。 20世紀60年代，英國放射生物學

68、家阿普（T. Alper）將羊搔癢癥致病組織用會導致核酸失活的放射線輻射，發(fā)現(xiàn)處理過的致病組織仍有傳染性，提出羊搔癢癥的病因可能是不含核酸的蛋白質(zhì)，但這樣的觀點有悖于“核酸為中心”的觀念，因而當時未得到人們的重視。,106,直至1982年，美國神經(jīng)學與生物化學家魯辛納在致病因子的探尋方面作了8年研究之后，提出該致病因子確實不含核酸，而是蛋白質(zhì)。為了能把他與細菌、真菌、病毒及其他已知病原體相區(qū)別，他將這種蛋白質(zhì)致病因子定名為朊病毒（Pri